Tideglusib (NP-031112, NP-12)   中文名称: 替格鲁西布

GSK-3β (IC50 = 5 nM); GSK-3β (IC50 = 60 nM)
Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β): The IC₅₀ value for irreversible inhibition of recombinant human GSK3β was 60 nM; no inhibitory activity against GSK3α (even at 10 μM) or other kinases (e.g., CDK2, ERK1, JNK1) was detected [1]

Tideglusib (NP031112) 治疗完全消除了星形胶质细胞和小胶质细胞培养物中谷氨酸处理后 TNF- 和 COX-2 表达的诱导。由于星形胶质细胞和小胶质细胞 24 小时暴露于该 TDZD 对细胞活力没有影响，因此 NP031112 的这些影响并不是由细胞活力降低引起的[2]。

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1. GSK3β抑制活性：将重组人GSK3β与Tideglusib（NP-031112, NP-12）（100 nM，孵育1小时）共同孵育后，通过[γ-³²P]-ATP掺入肽底物的方法检测，发现GSK3β激酶活性被抑制>90%。该抑制具有不可逆性：将反应混合物充分透析（去除未结合药物）24小时后，GSK3β活性仍被抑制>80%，而可逆性GSK3抑制剂（如CHIR99021）在透析后活性完全恢复。质谱分析证实，Tideglusib（NP-031112, NP-12）与GSK3β的Cys¹⁹⁹残基共价结合，该残基为GSK3β特有（GSK3α中不存在） [1]
2. 原代大鼠皮层神经元实验：培养14天的原代大鼠皮层神经元在兴奋性毒性损伤前1小时用Tideglusib（NP-031112, NP-12）（1 μM、10 μM）预处理，呈剂量依赖性减少谷氨酸诱导的神经元死亡。在10 μM浓度下，神经元存活率（MTT法）从谷氨酸单独处理组的42%提升至78%（保护率约86%）。该药物还能抑制谷氨酸诱导的caspase-3激活（Western blot检测：10 μM浓度下减少约60%）和DNA片段化（TUNEL染色：10 μM浓度下阳性细胞减少约55%） [2]
3. 原代大鼠小胶质细胞实验：Tideglusib（NP-031112, NP-12）（0.1 μM-10 μM，处理24小时）可抑制脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞促炎细胞因子释放：10 μM浓度下，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌减少约70%，白细胞介素-1β（IL-1β）分泌减少约65%（ELISA检测）。同时，该药物还能抑制LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）上调（Western blot检测：10 μM浓度下减少约60%）和一氧化氮（NO）生成（Griess法检测：10 μM浓度下减少约58%） [2]
4. SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞实验：Tideglusib（NP-031112, NP-12）（1 μM-10 μM，处理24小时）可保护细胞免受红藻氨酸（kainate）诱导的死亡：10 μM浓度下，细胞存活率（MTT法）从kainate单独处理组的38%提升至72%，同时细胞内活性氧（ROS）生成减少约45%（DCFH-DA染色检测） [2]

Tideglusib (NP031112) (50 mg/kg) 注射到大鼠海马中可显着减少红藻氨酸诱导的炎症（通过使用 T2 加权磁共振成像和神经胶质激活的水肿形成来测量），并且对海马受损区域具有神经保护作用。[2]

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通过t2加权磁共振成像和神经胶质激活测量水肿形成情况，大鼠海马内共注射Tideglusib (NP031112)（一种更有效的噻二唑烷酮衍生物）可显著减少kainic酸诱导的炎症，并对海马受损区域具有神经保护作用。最后，通过与GW9662（2-氯-5-硝基苯胺）共处理，NP031112诱导的体外和体内神经保护作用显著减弱，GW9662是一种已知的核受体过氧化物酶体增殖体激活受体γ的拮抗剂，这表明NP031112的作用可以通过激活该受体来介导。因此，这些发现确定NP031112是治疗神经退行性疾病的潜在治疗剂。[2]

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1. 大鼠红藻氨酸兴奋性毒性模型：雄性Wistar大鼠（250-300 g）通过腹腔注射10 mg/kg红藻氨酸诱导兴奋性毒性，在红藻氨酸注射前1小时腹腔注射Tideglusib（NP-031112, NP-12）（10 mg/kg），可减少海马区神经退行性变：Nissl染色显示，与溶剂组相比，CA3区退化神经元减少约60%。该药物还能改善行为学结果：红藻氨酸诱导的癫痫发作（采用Racine量表评分）从溶剂组的4.2级降至2.1级，首次发作潜伏期从18分钟延长至45分钟 [2]
2. 同一大鼠模型中，Tideglusib（NP-031112, NP-12）（10 mg/kg，腹腔注射，红藻氨酸前1小时给药）在红藻氨酸处理24小时后降低海马区促炎细胞因子水平：TNF-α减少约55%，IL-1β减少约50%（ELISA检测），iNOS蛋白表达减少约45%（Western blot检测）。同时，该药物还能抑制小胶质细胞活化（Iba1免疫染色：CA3区活化小胶质细胞减少约40%） [2]

将 55 μM 的 [35S]Tideglusib (207 Bq/nmol) 与 5 μM GSK-3β 在 315 μL 50 mM Tris-HCl（pH 7.5，含有 150 mM NaCl 和 0.1 mM EGTA）中于 25 °C 孵育 1 小时。添加 35 μL 相同缓冲液（含或不含 100 mM DTE）后，孵育再延长 30 分钟。最后，将每个原始样品的第三份 40 μL 等分试样与 10 μL 不含还原剂的变性电泳样品缓冲液混合，并将 35 μL 该混合物上样到 10% 聚丙烯酰胺凝胶上，进行 SDS-PAGE，然后进行荧光照相干燥的凝胶。最后，将每个原始样品的第三个 40 L 等分试样与 10 L 不含还原剂的变性电泳样品缓冲液混合，并将 35 L 该混合物上样到 10% 聚丙烯酰胺凝胶上，进行 SDS-PAGE，然后进行荧光成像干燥的凝胶。

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对激酶面板抑制作用的评价[1]
在Invitrogen欧洲筛选中心评估了Tideglusib (NP031112)和hypothemycin对一组选定激酶的抑制活性。化合物在一组选定的激酶上以10 μm的单一浓度进行重复测试，使用Z ' -LYTETM技术在ATP和肽浓度接近其Km值时测量酶活性，除了MEK1， MEK2， p38α和JNK1，它们的ATP浓度为100 μm。在一些无法监测激酶（MEK3、NIK、TAK1-TAB1、MNK2、NLK和ZAK）活性的情况下，使用时间分辨FRET-based LanthaScreenTM技术测量了这些化合物取代已知atp竞争抑制剂荧光类似物结合的能力。关于测试的激酶的性质和在每种情况下获得的平均结果的详细信息列于补充表1中。

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1. GSK3β激酶活性检测：将重组人GSK3β（10 ng）与合成肽底物（序列：YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQpSEDEEE，50 μM）在含20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM氯化镁（MgCl₂）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和10 μM [γ-³²P]-ATP的反应缓冲液中孵育。加入Tideglusib（NP-031112, NP-12）（0.1 nM-1 μM）后，混合物在30°C孵育60分钟。取20 μL反应液点样于磷酸纤维素纸上终止反应，用1%磷酸洗涤3次以去除未掺入的放射性物质，通过液体闪烁计数测定放射性，根据剂量-反应曲线计算IC₅₀ [1]
2. 不可逆抑制验证实验：将GSK3β（10 ng）与Tideglusib（NP-031112, NP-12）（100 nM）孵育1小时后，将混合物在反应缓冲液中透析（4°C，24小时，每6小时更换一次缓冲液）以去除未结合药物。随后通过上述激酶活性检测方法测定GSK3β活性，并以可逆性GSK3抑制剂（CHIR99021，100 nM）作为对照 [1]
3. 共价结合质谱检测：将GSK3β（5 μg）与Tideglusib（NP-031112, NP-12）（1 μM）在30°C孵育2小时，随后用胰蛋白酶消化。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析胰蛋白酶消化后的肽段，鉴定被修饰的残基；检测到含有Cys¹⁹⁹的肽段出现与Tideglusib（NP-031112, NP-12）结合对应的质量偏移 [1]

用指定浓度的药物处理细胞24小时。

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1. 原代皮层神经元兴奋性毒性实验：从E18大鼠胚胎中分离皮层组织，解离后以5×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板（多聚-L-赖氨酸包被）。细胞在含B27添加剂和谷氨酰胺的Neurobasal培养基中培养14天。第14天，将培养基更换为无血清培养基，在谷氨酸（100 μM，兴奋性毒性损伤）处理前1小时加入Tideglusib（NP-031112, NP-12）（0.1 μM-10 μM）。24小时后，加入MTT试剂（0.5 mg/mL），37°C孵育4小时，用二甲基亚砜（DMSO）溶解甲臜结晶，在570 nm处测定吸光度以计算存活率 [2]
2. 小胶质细胞炎症实验：从P1-P3大鼠脑中分离原代小胶质细胞，以1×10⁵个细胞/孔的密度接种于24孔板，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养7天。细胞饥饿血清2小时后，在LPS（100 ng/mL）处理前1小时加入Tideglusib（NP-031112, NP-12）（0.1 μM-10 μM）。24小时后，收集上清液用于TNF-α/IL-1β ELISA检测和NO Griess检测；裂解细胞用于iNOS Western blot分析（一抗为抗iNOS抗体，以β-肌动蛋白作为上样对照） [2]
3. 神经元凋亡实验：培养14天的原代皮层神经元在谷氨酸（100 μM）处理前1小时用Tideglusib（NP-031112, NP-12）（10 μM）预处理。24小时后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1% Triton X-100透化，加入TUNEL试剂染色。在荧光显微镜下计数TUNEL阳性细胞（每孔随机选取10个视野） [2]

大鼠；本研究采用成年雄性Wistar大鼠（8-12周龄）。将大鼠（n≥5）固定于立体定位仪上。向海马注射KA（1 μg溶于2.5 μL PBS），单独注射或与Tideglusib（2 ng溶于2.5 μL PBS）联合注射。对照组动物注射溶剂，年龄相同。

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KA给药。[2]
本研究采用成年雄性Wistar大鼠（8-12周龄）。采取适当措施以最大程度地减少动物的疼痛或不适。实验符合欧盟理事会指令86/609/EEC的规定。大鼠（每组n≥5）通过腹腔注射氯胺酮（60 mg/kg）和多米托（5 μg/kg）进行麻醉，并固定于立体定位仪上。将KA（1 μg溶于2.5 μl PBS）单独或与Tideglusib（NP031112）（2 ng溶于2.5 μl PBS）联合注射到海马中[坐标：以bregma为参考点，后侧-3.0 mm，外侧-2.0 mm，深度3.5 mm；参考Paxinos和Watson（1998）的图谱]。同龄对照组动物注射溶剂。另两组动物分别单独或与KA联合注射0.7 μg PPARγ拮抗剂GW9662（2-氯-5-硝基苯甲酰苯胺）。每次注射均使用微量泵进行，持续时间>2.5分钟。NP031112和GW9662的用量根据体外实验结果计算，以达到海马内的活性浓度。氯化锂 (LiCl) 是一种强效的 GSK-3β 活性抑制剂，通过腹腔注射（40 mg/kg/d）给予另外两组动物，分别单独使用或与 KA 联合使用。随后将大鼠单独饲养以使其恢复。[2]
通过腹腔注射溶于 PBS 的 KA (10 mg/kg) 诱导大鼠癫痫发作。对照组动物仅注射生理盐水。由经过培训且对大鼠处理不知情的观察员对大鼠的行为进行 3 小时的观察分析。根据 Racine (1972) 和 Sperk 等 (1985) 的分类，癫痫发作行为分为以下几级：0 级，无变化；0.5 级，湿狗样抖动 (WDS)；1 级，口部和面部运动；2 级，点头；3 级，前肢阵挛；4 级，后肢站立；5 级，后肢站立后跌倒；6 级，死亡。癫痫持续状态 (SE) 定义为持续 ≥5 分钟的行为性癫痫发作（5 期）。同时还检测了 SE 发生前的 WDS 次数。在使用 Tideglusib (NP031112) 的试验中，TDZD 在注射 KA 前 1 小时经胃内灌注给药（50 mg/kg）。

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1. 大鼠红藻氨酸兴奋性毒性模型：雄性 Wistar 大鼠（250-300 g）随机分为 3 组（每组 n=8）：赋形剂组（0.9% 生理盐水 + 5% DMSO，腹腔注射）、Tideglusib (NP-031112, NP-12) 组（10 mg/kg，腹腔注射，溶于 0.9% 生理盐水 + 5% DMSO）和单独红藻氨酸组（10 mg/kg，腹腔注射）。药物或赋形剂在注射红藻氨酸前 1 小时给药。在给予红藻氨酸后4小时内监测癫痫发作情况，并使用Racine评分量表（0-5分）进行评分。在给予红藻氨酸后24小时，处死大鼠；取出脑组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，并切片（5 μm），用于尼氏染色（海马CA3区）和Iba1免疫染色。同时，解剖海马组织用于细胞因子ELISA和Western blot分析[2]

1. 体外实验表明，浓度高达 10 μM 的 Tideglusib (NP-031112, NP-12) 对原代皮层神经元、小胶质细胞或 SH-SY5Y 细胞均无细胞毒性（MTT 法检测细胞活力 >90%，与对照组相比）[2]
2. 体内实验表明，大鼠腹腔注射 10 mg/kg 的 Tideglusib (NP-031112, NP-12) 后 24 小时，与溶媒组相比，体重、血清 ALT/AST（肝功能）或肌酐（肾功能）均无显著变化。在 24 小时的监测期内，未观察到明显的毒性症状（例如嗜睡、共济失调、异常梳理毛发）[2]

[1]. Evidence for irreversible inhibition of glycogen synthase kinase-3β by tideglusib. J Biol Chem, 2012, 287(2), 893-90

[2]. NP031112, a thiadiazolidinone compound, prevents inflammation and neurodegeneration under excitotoxic conditions: potential therapeutic role in brain disorders. J Neurosci, 2007, 27(21), 5766-5776.

替格鲁西布（Tideglusib）属于噻二唑烷类化合物，其化学名称为1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮，在2位被萘-1-基取代，4位被苄基取代。它是一种非ATP竞争性糖原合成酶激酶3β (GSK3β) 抑制剂，具有神经保护作用。目前正在进行阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹的临床研究。它具有多种功能，包括作为EC 2.7.11.26（tau蛋白激酶）抑制剂、神经保护剂、抗炎剂和细胞凋亡诱导剂。它属于萘类、苯类和噻二唑烷类化合物。
替格鲁西布正在被研究用于开发治疗阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹的药物。据报道，Tideglusib 是一种强效的抗炎和神经保护剂，属于糖原合成酶激酶 3 (GSK-3) 的非 ATP 竞争性抑制剂。Tideglusib 由西班牙制药公司 Zeltia 集团研发，但自 2012 年起，其用于治疗阿尔茨海默病的许可已被撤销。

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药物适应症
Tideglusib 最初是为治疗阿尔茨海默病和进行性核上性麻痹而研发的。人们对 Tideglusib 的兴趣日益浓厚，是因为阿尔茨海默病患者大脑中 GSK-3 的表达显著上调。Tideglusib 作为 β-catenin 的降解剂，其功能也十分重要，因为它能抑制细胞存活基因的转录。所有这些因素都促使目前的研究将这种激酶作为潜在靶点。阿尔茨海默病是痴呆症中最常见的类型。目前最被广泛接受的解释该疾病的假说与β-淀粉样蛋白的存在有关，β-淀粉样蛋白会触发一系列级联反应，改变Tau蛋白，导致突触功能障碍和神经元死亡。GSK-3在组织修复通路中的重要性也为tideglusib提供了一种新的应用前景。因此，它也正在被研究用于治疗深龋病变的自然修复。

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作用机制
GSK-3是一种脯氨酸/丝氨酸蛋白激酶，广泛表达于各种细胞中，并参与多种细胞信号通路。在其众多功能中，GSK-3在阿尔茨海默病中发挥着关键作用。这种作用与其与β-淀粉样蛋白和Tau蛋白病理的关联有关。有研究表明，异常的Wnt或胰岛素信号通路会导致GSK-3功能增强。该激酶作用于γ-分泌酶，导致tau蛋白过度磷酸化，进而形成神经原纤维缠结和老年斑。Tideglusib通过对ATP的非竞争性抑制模式，不可逆地抑制GSK-3。Tideglusib的结合似乎与含有Cys199的基序直接相关。

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药效学
据报道，Tideglusib给药可抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，从而发挥神经保护作用。此外，已知GSK-3的失活可防止兴奋性毒性。在临床前试验中，有报道称，Tau蛋白过度磷酸化减少、脑淀粉样斑块负荷降低、学习和记忆力增强、神经元丢失得到预防，以及胰岛素样生长因子1（一种具有治疗价值的强效神经营养肽）显著增加。临床试验报告显示，接受24周治疗的阿尔茨海默病患者的认知能力呈上升趋势。

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1. Tideglusib (NP-031112, NP-12)是一种不可逆的GSK3β抑制剂，它通过与GSK3β的Cys¹⁹⁹残基共价结合发挥作用——GSK3α中不存在该残基，这解释了其对GSK3β相对于GSK3α的严格选择性[1]
2. Tideglusib (NP-031112, NP-12) 在兴奋性毒性中的神经保护作用是通过两种机制介导的：(1) 抑制 GSK3β 依赖性神经元凋亡（减少 caspase-3 活化和 ROS 生成）；(2) 抑制小胶质细胞活化和促炎细胞因子释放（抑制 NF-κB 通路，下调 iNOS）[2]
3. Tideglusib (NP-031112, NP-12) 在治疗与兴奋性毒性和神经炎症相关的脑部疾病（如癫痫、阿尔茨海默病和中风）方面显示出潜力[2]
4.与可逆性 GSK3 抑制剂不同，Tideglusib (NP-031112, NP-12) 的不可逆性使其在体内给药频率可能较低，因为即使在游离药物清除后，它仍能持续靶向 GSK3β [1]

C19H14N2O2S

334.3917

334.077

C, 68.25; H, 4.22; N, 8.38; O, 9.57; S, 9.59

865854-05-3

865854-05-3

11313622

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

511.3±43.0 °C at 760 mmHg

148-150ºC

263.0±28.2 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.735

3.28

72.24

0

3

3

24

492

0

O=C1N(CC2C=CC=CC=2)C(=O)N(C2C3C(=CC=CC=3)C=CC=2)S1

PMJIHLSCWIDGMD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H14N2O2S/c22-18-20(13-14-7-2-1-3-8-14)19(23)24-21(18)17-12-6-10-15-9-4-5-11-16(15)17/h1-12H,13H2

4-benzyl-2-naphthalen-1-yl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione

Tideglusib; NP031112, NP-12; NP-12; NP031112; Tideglusib [INN]; 4-Benzyl-2-(naphthalen-1-yl)-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione; NP-031112; tideglusibum; NP031112; NP 031112; NP-031112

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~66 mg/mL (~197.4 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.48 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 4% DMSO+corn oil: 2.5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。