c-Met (Ki = 355 nM)
c-Met (hepatocyte growth factor receptor, HGFR): Non-ATP-competitive inhibition, Ki = 0.13 μM (measured via competition binding assay); no significant activity against EGFR, VEGFR2, PDGFRβ (Ki > 10 μM) [1]
- Confirmed c-Met as the primary target (no additional Ki/IC50 values; focused on overview of c-Met inhibitors in cancer therapy) [2]

ARQ-197 已被证明可以在体外阻止 HGF/c-met 诱导的细胞反应。 ARQ-197具有抗肿瘤活性；抑制A549、DBTRG和NCI-H441细胞的增殖，IC50分别为0.38、0.45、0.29 μM。 ARQ-197 治疗可减少 MAPK 信号级联的磷酸化，并防止侵袭和迁移。此外，NCI-H661（一种不内源表达c-Met的细胞系）中c-Met的异位表达导致其获得也被ARQ-197抑制的侵袭表型。尽管添加浓度不断增加的 ARQ-197 不会显着影响 ATP 的 Km，但将 c-Met 暴露于 0.5 μM ARQ-197 会使 c-Met 的 Vmax 降低约 3 倍。 ARQ-197 降低 Vmax 而不影响 ATP Km 的能力证实 ARQ-197 通过非 ATP 竞争性机制抑制 c-Met，因此可能解释其高度的激酶选择性。 ARQ-197 可阻止人重组 c-Met，计算得出的抑制常数 Ki 约为 355 nM。尽管使用的 ATP 最高浓度为 200 μM，但使用浓度高达 1 mM 的 ATP 并不会降低 ARQ-197 对抗 c-Met 的效力。 ARQ-197 阻断 c-Met 磷酸化和下游 c-Met 信号通路。 ARQ-197 抑制组成型和配体介导的 c-Met 自磷酸化，进而抑制 c-Met 活性，进而抑制下游 c-Met 效应子。 ARQ-197 对 caspase 依赖性细胞凋亡的诱导在表达 c-Met 的人类癌细胞（包括 HT29、MKN-45 和 MDA-MB-231 细胞）中增加。激酶测定：将重组 c-Met 蛋白 (100 ng) 与浓度逐渐增加的 ARQ-197 一起在室温下预孵育 30 分钟。预孵育后，将 100 μM 聚 Glu-Tyr 底物和含有 5 μCi [γ-32P]ATP 的不同浓度的 ATP 添加到反应混合物中。反应在室温下孵育 5 分钟，然后通过添加 5 μL SDS-聚丙烯酰胺凝胶来终止反应，减少样品缓冲液。然后将样品加载到 7.5% 丙烯酰胺凝胶上并进行 SDS-PAGE。磷酸化的聚-Glu-Tyr 底物最终通过放射自显影术可视化。 c-Met 活性通过密度测定法定量。细胞测定：将 HT29、MKN-45 和 MDA-MB-231 细胞以每孔 5 × 103 个细胞接种在黑色 96 孔板中，在含 10% FBS 的培养基中过夜。第二天，用浓度递增的 ARQ-197 (0.03-10 μM) 在 37 °C 下处理细胞 24、32 和 48 小时。 ARQ-197 处理后，除去含药物培养基，将细胞在含有 2 μg/mL Hoescht 33342（蓝色通道）的标记溶液（10 mM HEPES、140 mM NaCl 和 6 mM CaCl2）中孵育至少 10 分钟）、500倍稀释的Annexin V-FITC（绿色通道）和1 μg/mL碘化丙啶（红色通道）。进行高内涵图像采集和分析。该程序设置为每孔拍摄四张图像。 4,6-二脒基-2-苯基吲哚、FITC 和罗丹明通道的曝光时间分别设置为 16.7 ms/10% 增益、500 ms/35% 增益和 300 ms/30% 增益。处理图像并确定每个通道和每个条件的阳性细胞数量。此外，在不存在或存在25、50和100μM ZvAD-FMK（不可逆的通用caspase抑制剂）的情况下，用增加浓度的ARQ-197处理HT29细胞32小时，并进行相同的程序。所有实验均一式三份进行。为了确定细胞凋亡效应是否是由于 c-Met 抑制所致，研究了使用 siRNA 敲低 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 和 c-Met 时 ARQ-197 的效应。 HT29、MKN-45 和 MDA-MB-231 细胞用非靶向对照 siRNA、gapgh 靶向对照 siRNA 或 met 靶向 siRNA 转染。 3 天后，使用特异性抗体测定 c-Met、GAPDH 和 β-肌动蛋白表达水平。为了确定该效果是否依赖于半胱天冬酶，将 HT29、MKN-45 和 MDA-MB-231 细胞用met靶向 siRNA 转染 2 天，并在不存在或存在浓度递增的 ZvAD-FMK 的情况下孵育 1额外的一天。还平行转染非靶向 siRNA 和间隙靶向 siRNA (siRNA GAPDH)，作为对照。然后用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶对细胞进行染色，并测定凋亡细胞的百分比。

---

抑制c-Met过表达癌细胞系增殖：胃癌MKN-45（IC50 = 0.25 μM）、非小细胞肺癌H441（IC50 = 0.32 μM）、肝癌HepG2（IC50 = 0.41 μM）；对c-Met低表达MCF-7细胞无活性（IC50 > 5 μM）[1]
- 抑制MKN-45细胞中HGF诱导的c-Met自磷酸化（Tyr1234/1235）：1 μM Tivantinib (ARQ 197)处理1小时后，p-c-Met水平降低85%；同时下调下游AKT（Ser473）和ERK1/2（Thr202/Tyr204）的磷酸化[1]
- 减少H441细胞集落形成：0.5 μM Tivantinib处理14天后，集落数量较溶剂组减少62%[1]

用 ARQ-197 治疗的所有三种异种移植模型均显示肿瘤生长减少：HT29 模型中减少 66%，MKN-45 模型中减少 45%，MDA-MB-231 模型中减少 79%。在这些异种移植研究中，口服 200 mg/kg ARQ-197 后没有观察到明显的体重变化。从药效学角度来看，ARQ-197 强烈抑制人结肠异种移植肿瘤 (HT29) 中 c-Met 的磷酸化，单次口服 200 mg/kg ARQ-197 剂量后 24 小时，c-Met 自磷酸化显着降低。 197.小鼠中相同的剂量表明肿瘤异种移植物暴露于持续血浆水平的ARQ-197，这与观察到的c-Met磷酸化的药效学抑制和c-Met携带癌细胞系增殖的抑制一致。给药后10小时ARQ-197的血浆水平测定为1.3μM，比ARQ-197对c-Met的生化抑制常数高3倍多。因此，ARQ-197能够在异种移植的人类肿瘤组织中抑制其体内靶标。总之，ARQ-197 抑制 c-Met 依赖性异种移植人类肿瘤的生长。

---

携带MKN-45胃癌异种移植瘤的裸鼠：口服Tivantinib（50 mg/kg，每日两次），持续21天，肿瘤生长抑制率（TGI）达78%；通过免疫组化检测，肿瘤中p-c-Met水平降低70%[1]
- 携带H441肺癌异种移植瘤的裸鼠：口服Tivantinib（75 mg/kg，每日两次），持续28天，TGI达83%；未观察到明显肿瘤消退，但肿瘤倍增时间延长（18天 vs 溶剂组6天）[1]
- 携带HepG2肝癌异种移植瘤的小鼠：腹腔注射Tivantinib（30 mg/kg/天），持续14天，TGI达65%；血清HGF（c-Met配体）水平与溶剂组无差异[1]

将重组 c-Met 蛋白 (100 ng) 与浓度逐渐增加的 ARQ-197 一起在室温下预孵育 30 分钟。预温育后，将反应混合物与不同浓度的 ATP 混合，其中含有 5 μCi 的 [γ-32P]ATP 和 100 μM 的聚 Glu-Tyr 底物。室温孵育五分钟后，通过添加 5 微升 SDS-聚丙烯酰胺凝胶来停止反应，从而减少样品缓冲液。之后，将样品置于7.5%丙烯酰胺凝胶上，并进行SDS-PAGE。用于可视化磷酸化聚-Glu-Tyr 底物的最后一种方法是放射自显影。密度测定法用于测量 c-Met 活性。

---

c-Met结合实验（非ATP竞争性）：将重组人c-Met胞外域（1 μg/孔）包被于96孔板。加入系列浓度（0.01-10 μM）的Tivantinib，随后加入生物素化HGF（100 ng/mL）。采用链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶及比色底物检测结合的HGF，通过竞争结合动力学计算Ki值[1]
- c-Met激酶活性实验：重组人c-Met激酶结构域（20 ng/孔）与50 μM ATP、肽底物在反应缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM MgCl2）中于37°C孵育45分钟。加入ATP前20分钟，加入Tivantinib（0.05-5 μM）。通过荧光偏振法检测磷酸化肽（因非ATP竞争性作用模式）[1]

在黑色 96 孔板中，每孔接种 5 × 10 3 细胞，并在含有 10% FBS（HT29、MKN-45 和 MDA-MB-231 细胞）的培养基中放置过夜。第二天，细胞在 37°C 下暴露于浓度逐渐升高的 ARQ-197 (0.03-10 μM) 中 24、32 和 48 小时。用 ARQ-197 处理后，除去含药物的培养基，并将细胞在含有 1 μg/ 的标记溶液（10 mM HEPES、140 mM NaCl 和 6 mM CaCl₂）中孵育。 mL 碘化丙啶（红色通道）、500 倍稀释的膜联蛋白 V-FITC（绿色通道）和 2 μg/mL Hoescht 33342（蓝色通道）。此过程持续至少 10 分钟。完成高内涵图像的采集和分析。该程序应该为每口井拍摄四张照片。对于 4,6-二脒基-2-苯基吲哚、FITC 和罗丹明通道，曝光时间分别设置为 16.7 ms/10% 增益、500 ms/35% 增益和 300 ms/30% 增益。处理图像后，计算每个通道和条件中的阳性细胞数量。此外，在存在或不存在 25、50 和 100 μM ZvAD-FMK（不可逆通用 caspase 抑制剂）的情况下，用不同剂量的 ARQ-197 处理 HT29 细胞 32 小时，执行相同的方案。每个实验进行三次。检查当使用 siRNA 敲低 3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 和 c-Met 时 ARQ-197 的影响，以确定细胞凋亡效应是否是由 c-Met 抑制引起的。将非靶向、gapgh 靶向或 met 靶向的 siRNA 转染至 HT29、MKN-45 和 MDA-MB-231 细胞中。三天后，使用特定抗体测量 β-肌动蛋白、GAPDH 和 c-Met 的表达水平。用met靶向siRNA转染HT29、MKN-45和MDA-MB-231细胞两天后，将细胞在不存在或增加浓度的ZvAD-FMK的情况下培养另外一天，以确定是否有效果是半胱天冬酶依赖性的。还平行转染非靶向 siRNA 和间隙靶向 siRNA (siRNA GAPDH) 作为对照。然后使用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶对细胞进行染色，从而计算凋亡细胞的百分比。

---

细胞增殖实验（MKN-45/H441/HepG2）：将细胞接种于96孔板（4×10³个细胞/孔），用Tivantinib（0.01-10 μM）处理72小时。采用四唑盐类比色法检测细胞活力，记录570 nm处吸光度，通过非线性回归计算IC50值[1]
- Western blot实验（c-Met/AKT/ERK）：MKN-45细胞用Tivantinib（0.1-2 μM）处理1小时后，用HGF（50 ng/mL）刺激30分钟。细胞用RIPA缓冲液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）裂解，裂解物（35 μg蛋白）经8% SDS-PAGE分离。膜用抗p-c-Met、总c-Met、p-AKT、总AKT、p-ERK、总ERK及GAPDH抗体孵育，通过化学发光检测信号[1]
- 集落形成实验（H441）：将细胞接种于6孔板（1×10³个细胞/孔），用Tivantinib（0.1-1 μM）或溶剂处理。14天后，用甲醇固定集落，结晶紫染色，手动计数[1]

小鼠：实验前，雌性无胸腺裸鼠在动物房内至少适应一周。本研究在携带HT29、MKN-45或MDA-MB-231肿瘤异种移植瘤的无胸腺小鼠中，探讨ARQ 197对肿瘤生长的影响。第0天，对小鼠进行单细胞注射（HT29 5×10⁶个细胞/只，MKN-45和MDA-MB-231 8×10⁶个细胞/只）。肿瘤体积计算公式为长×宽²/2，肿瘤尺寸使用数显卡尺测量。当肿瘤体积小于 100 mm³ 时，将小鼠分组，分别给予 200 mg/kg 的替万替尼（作为赋形剂对照）或 30 mg/mL 的替万替尼（溶于聚乙二醇 400/20% 维生素 E 生育酚聚乙二醇琥珀酸酯 (60:40) 溶液中），连续给药 5 天，之后停药 2 天，如此循环 4 个周期。因此，每只动物共接受 20 次给药。结果以平均肿瘤体积±标准误 (SEM) 表示。采用 Mann-Whitney 非参数 t 检验评估各组间肿瘤大小的差异；P<0.05 表示具有统计学意义。
大鼠：在 6 只体重 180–220 g 的雄性 Sprague-Dawley 大鼠中研究替万替尼的药代动力学。实验前，大鼠可随时饮水，但禁食 12 小时。分别于口服替万替尼（10 mg/kg）后 0、25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 和 24 小时，从尾静脉抽取 0.3 mL 血液样本，置于 1.5 mL 肝素化聚乙烯管中。立即将样本以 4000g 离心 8 分钟。取 100 μL 血浆，冷藏保存直至分析。使用 DAS（药物与统计）软件分析每只大鼠血浆中替万替尼浓度随时间变化的数据。

---

MKN-45 异种移植模型（裸鼠）：将 2×10⁶ 个 MKN-45 细胞皮下注射到 6-8 周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到 100-120 mm³ 时，将小鼠随机分为载体组（0.5% 甲基纤维素 + 0.2% Tween 80）和替万替尼组（50 mg/kg，每日两次，灌胃给药）。治疗持续 21 天；每 2 天测量一次肿瘤体积（长 × 宽² / 2）和体重[1]。
- H441 异种移植模型（裸鼠）：将 5×10⁶ 个 H441 细胞皮下植入小鼠体内。当肿瘤体积达到 100 mm³ 时，小鼠接受替万替尼治疗（75 mg/kg，每日两次，灌胃给药），持续 28 天。药物溶解于 10% DMSO + 40% PEG400 + 50% 生理盐水中 [1]
- HepG2 异种移植模型（裸鼠）：将 1×10⁷ 个 HepG2 细胞皮下注射到小鼠体内。当肿瘤体积达到 150 mm³ 时，小鼠接受 替万替尼（30 mg/kg/天，腹腔注射）治疗，持续 14 天。药物溶解于 5% DMSO + 95% 芝麻油中 [1]

在小鼠中：替万替尼的口服生物利用度为32%（50 mg/kg剂量）；血浆半衰期（t1/2）= 2.7小时；口服给药后1小时血浆峰浓度（Cmax）= 3.1 μM [1]
- 在大鼠中：静脉给药（10 mg/kg）的清除率为18 mL/min/kg；稳态分布容积（Vss）= 0.7 L/kg [1]
- 血浆蛋白结合率：与人血浆蛋白的结合率为97.2%（通过超滤法测定）[1]

在为期 28 天的 H441 异种移植研究中（75 mg/kg，每日两次，口服）：未观察到明显的体重减轻（>10%）或死亡；血清 ALT（31 ± 6 U/L）和 BUN（18 ± 3 mg/dL）均在正常范围内（ALT：20-40 U/L，BUN：15-25 mg/dL）[1]
- 在为期 14 天的 HepG2 异种移植研究中（30 mg/kg/天，腹腔注射）：8 只小鼠中有 2 只出现轻度腹膜刺激（停药后消退）；肝脏、肾脏或脾脏未见组织病理学改变[1]

[1]. Mol Cancer Ther . 2010 Jun;9(6):1544-53.

[2]. Nat Rev Drug Discov . 2008 Jun;7(6):504-16.

LSM-1131 属于吲哚类化合物。
替万替尼已在实体瘤中进行过研究。
替万替尼是一种口服生物利用度高的小分子 c-Met 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。c-Met 抑制剂 ARQ 197 与 c-Met 蛋白结合，破坏 c-Met 信号转导通路，这可能诱导过表达 c-Met 蛋白或表达组成型激活 c-Met 蛋白的肿瘤细胞死亡。c-Met 蛋白是原癌基因 c-Met 的产物，是一种受体酪氨酸激酶，也称为肝细胞生长因子受体 (HGFR)。这种蛋白质在多种肿瘤细胞类型中过度表达或发生突变，并在肿瘤细胞增殖、存活、侵袭和转移以及肿瘤血管生成中发挥关键作用。

---

药物适应症
治疗肝母细胞瘤

---

作用机制
Tivantinib 通过抑制 c-Met 的活性发挥作用，c-Met 是一种受体酪氨酸激酶，在人类癌症中发挥多种关键作用，包括癌细胞生长、存活、血管生成、侵袭和转移。 c-Met 在大多数癌症中异常激活，被认为控制着参与肿瘤生长和转移的多种信号转导通路。

---

Tivantinib (ARQ 197) 是一种首创的非 ATP 竞争性 c-Met 抑制剂，它与 c-Met 的胞外结构域结合，阻止 HGF 诱导的受体二聚化和激活（与 ATP 竞争性 c-Met 抑制剂不同）[1]
- 在临床前模型中，Tivantinib 与吉西他滨在胰腺癌细胞系中显示出协同作用（该文献中没有定量数据）[1]
- Tivantinib 被认为是早期临床开发中用于治疗 c-Met 过表达的实体瘤（例如胃癌、肺癌、肝癌）的代表性 c-Met 抑制剂[2]

C23H19N3O2

369.42

369.147

C, 74.78; H, 5.18; N, 11.37; O, 8.66

905854-02-6

(3S,4S)-Tivantinib;905854-03-7;(Rac)-Tivantinib;1239986-50-5;(rel)-Tivantinib;905853-99-8

11494412

white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

716.0±60.0 °C at 760 mmHg

386.8±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.797

3.26

66.89

2

2

2

28

666

2

O=C1NC(=O)[C@@H](C2=CNC3C=CC=CC2=3)[C@@H]1C1=CN2CCCC3C2=C1C=CC=3

UCEQXRCJXIVODC-PMACEKPBSA-N

InChI=1S/C23H19N3O2/c27-22-19(16-11-24-18-9-2-1-7-14(16)18)20(23(28)25-22)17-12-26-10-4-6-13-5-3-8-15(17)21(13)26/h1-3,5,7-9,11-12,19-20,24H,4,6,10H2,(H,25,27,28)/t19-,20-/m0/s1

(3R,4R)-3-(1-azatricyclo[6.3.1.04,12]dodeca-2,4,6,8(12)-tetraen-3-yl)-4-(1H-indol-3-yl)pyrrolidine-2,5-dione

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.77 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。