TM-5441

PAI-1/plasminogen activator inhibitor-1PAI-1

HT1080、HCT116、Daoy、MDA-MB-231 和 Jurkat 细胞均被 TM-5441剂量依赖性地降低，IC50 范围为 13.9 至 51.1 μM[1]。在 HT1080 和 HCT116 细胞中，TM5441 以剂量依赖性方式增加 caspase 3/7 活性。 TM5441 导致 HT1080 和 HCT116 细胞发生更多凋亡[1]。线粒体去极化是由 TM5441 诱导的[1]。 TM5441 逆转 PAI-1 诱导的纤溶酶活性抑制，并有效阻断小鼠近端肾小管上皮细胞中的纤维化和炎症标志物 mRNA 表达[2]。

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TM5275和TM-5441降低了HT1080和HCT116细胞的增殖[1]
为了研究TM抑制剂对细胞增殖的影响，我们使用BrdU掺入来测试细胞周期活性。该分析（图2）显示，用TM5275和TM5441处理的两种细胞系的BrdU阳性细胞百分比均显著降低（分别从DMSO处理的细胞的48.5%和48.7%降至TM5275处理的HT1080和HCT116细胞的38.1%和42.5%，TM5441治疗的细胞的28.3%和34.6%）。这些结果表明，TM5275和TM5441部分通过减少增殖来降低肿瘤细胞的存活率。

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TM5275和TM-5441增加了HT1080和HCT116细胞的凋亡[1]
由于之前的研究表明PAI-1保护肿瘤细胞免于凋亡[10,12,26]，我们研究了TM5275和TM5441对HT1080和HCT116细胞凋亡的影响。使用胱天蛋白酶3/7活性测定，我们证明了暴露于这些抑制剂的HT1080和HCT116细胞的胱天蛋白酶3/7活性呈剂量依赖性增加（图3A）。TM5441对胱天蛋白酶3/7活性的影响在统计学上比TM5275强得多（在100μM时分别为37倍和32倍；P值分别为0.0005和0.003）。通过流式细胞术分析膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）染色，证实了抑制剂对细胞凋亡的影响（图3B）。数据表明，与DMSO处理的细胞相比，用TM5275或TM5441抑制剂处理的HT1080和HCT116细胞的早期和晚期凋亡呈统计学上显著的剂量依赖性增加。作为PAI-1对uPA活性的读数，我们测量了纤溶酶活性随时间的变化。该分析揭示了细胞相关纤溶酶活性的增加，在8至24小时之间达到峰值，并与凋亡的增加相关（图3C）。
我们还测试了浓度为1μM至25μM的TM-5441是否会影响HT1080和HCT116细胞对几种化疗药物（阿霉素、依托泊苷、奥沙洛铂和5-氟尿嘧啶（5-FU））的敏感性。数据显示，TM5441在1μM时不会增强这些化疗药物的活性。即使在更高浓度（25μM）下使用，TM5441也不会增强阿霉素的细胞毒性活性（S2图）。

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TM5275和TM-5441诱导线粒体去极化[1]
为了探索外源性和内源性凋亡途径在TM抑制剂诱导的凋亡中的相对贡献，我们通过蛋白质印迹检测了这些抑制剂对胱天蛋白酶3、8和9切割（激活）的影响。数据（图4A）显示，在用TM5275或TM5441处理后，两种细胞系中都没有胱天蛋白酶8的激活。相比之下，他们表明胱天蛋白酶9和3被激活，聚己二酰核糖聚合酶（PARP）被相应地切割，PARP是胱天蛋白酶3的底物，这与TM抑制剂激活内在凋亡途径是一致的。用TM抑制剂（50μM）处理的HT1080和HCT116细胞的线粒体膜去极化检查证实了这一点（图4B）。数据表明，用TM5275和TM5441处理的细胞线粒体去极化增加，TM5441的作用更为明显，如之前在胱天蛋白酶3/7活性测定中观察到的那样（图3A）。这些结果表明，TM5275，特别是TM5441，是肿瘤细胞内在凋亡的强效刺激剂。

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TM5275和TM-5441抑制HUVEC分支 在体外EC上进一步研究了TM5441对体内肿瘤血管系统的破坏作用（图6）。该分析揭示了TM5441对3D Matrigel培养物中HUVEC分支形态发生的剂量依赖性抑制作用（图6A）。然而，这种效应与对EC存活率的直接影响无关，因为TM5441在50μM的浓度下对HUVEC存活（图6B）和凋亡（图6C）没有影响，而对体外分支形态发生有显著影响。TM5275对EC也有类似的影响（S1和S7图）。因此，数据表明TM抑制剂具有显著的血管破坏活性，与它们的凋亡活性无关。

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TM化合物在体外抑制PAI-1诱导的纤维化和炎症反应[2]
为了证实TM化合物作为PAI-1抑制剂在肾脏中的功效，我们研究了TM5275和TM-5441对mProx细胞中PAI-1诱导的纤维化和炎症标志物的影响。PAI-1治疗显著增加了TGF-β、Iα1型胶原、Iα2型胶原和MCP-1的mRNA表达（图4A-4D），这表明PAI-1具有促纤维化和促炎作用；值得注意的是，TM化合物的治疗有效地降低了PAI-1诱导的纤维化和炎症反应（图4A-4D），这证实了TM化合物作为PAI-1抑制剂的有效性。正如预期的那样，用TM化合物处理后，PAI-1诱导的纤溶酶活性抑制也受到抑制（图4E）。总之，这些结果表明，TM化合物可以有效改善PAI-1诱导的肾脏纤维化和炎症反应。

当TM-5441（每天 20 毫克/千克）给 HT1080 和 HCT116 异种移植小鼠口服时，它会显着破坏肿瘤脉管系统并增加肿瘤细胞凋亡，这与肿瘤生长的减少和生存的增加有关。口服后1小时，平均血药峰浓度为11.4μM，23小时后检测不到[1]。 TM5441 可延长 klotho 缺失小鼠的寿命，减少 Nω-硝基-L-精氨酸甲酯诱导的心源性高血压和血管衰老的影响，并在癌症中具有抗肿瘤和抗血管生成特性[3]。

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TM-5441在体内具有生物效应[1]
由于TM5441在体外具有较高的凋亡作用，因此选择TM5441来测试其在异种移植HT1080细胞的小鼠体内的抗肿瘤活性（图5）。该实验表明，用TM-5441（每天20 mg/kg）治疗的荷瘤小鼠显示出生长较慢的肿瘤的趋势，平均25.8（±3.4）天时肿瘤体积达到1500 mm3，而对照组为21.2（±2.5）天（P值=0.10）（图5A和5B）。然而，在TM5441治疗组中，随着时间的推移，生物发光活性（相对萤光素酶单位（RLU）作为肿瘤细胞存活率的指标）在统计学上显著降低（图5C）。TM5441治疗对生存率的影响显示，TM5441处理组的生存率呈上升趋势，但无统计学意义（P值=0.10）（图5D）。苏木精和伊红（H&E）对这些肿瘤的组织学分析表明，TM5441治疗小鼠的肿瘤中存在较大的出血区域，血管系统受损。CD31（PECAM）染色证实了肿瘤血管系统的这种破坏，该染色揭示了EC中包含血管的多个不连续区域，TM5441治疗组的血管密度在统计学上显著降低（P值=0.002）（图5F）。TM5441治疗小鼠的肿瘤中TUNEL阳性染色（肿瘤细胞凋亡的标志物）的数量也有所增加（P值=0.05）（图5G）。综上所述，数据表明TM5441在体内对肿瘤血管系统和肿瘤细胞具有生物活性，但不足以显著影响肿瘤生长。在我们的体内HCT116肿瘤模型中也观察到了类似的结果（S3图）。药代动力学研究显示，在用20mg/kg治疗的小鼠中，平均峰值浓度为11.4μM（仅略低于HT1080的IC50 13.9μM），谷值水平无法检测到（S4图）。给药50 mg/kg和100 mg/kg的TM5441，虽然分别将峰值血浆浓度水平提高到15.0μM和35.6μM，但并没有显著提高谷值水平，也没有影响肿瘤生长（S5图）。有趣的是，TM5441的给药对用50或100mg/kg治疗的小鼠的出血时间没有全身性影响（S6A图）。在体外人血浆凝块溶解试验中，TM5275有效地抑制了PAI-1维持凝块，并允许溶解发生，类似于添加tPA（S6B图）。

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糖尿病肾病是全球终末期肾病的主要原因，但目前尚无有效的治疗策略。由于纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）越来越被认为是糖尿病肾病细胞外基质（ECM）积聚的关键因素，本研究考察了TM5275和TM-5441在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠中的肾脏保护作用，这两种新型口服活性PAI-1抑制剂不会引发出血事件。对STZ诱导的糖尿病和年龄匹配的对照小鼠口服TM5275（50mg/kg）和TM5441（10mg/kg）16周。与对照组小鼠相比，糖尿病小鼠的血糖和肌酐水平、尿白蛋白排泄、肾与体重比、肾小球体积和系膜面积分数显著升高（p<0.05）。糖尿病小鼠肾脏中的纤维化和炎症标志物以及PAI-1也上调，TM5275和TM5441治疗有效地抑制了糖尿病肾脏中的蛋白尿、系膜扩张、ECM积聚和巨噬细胞浸润。此外，在小鼠近端肾小管上皮（mProx24）细胞中，TM5275和TM5441均有效抑制了PAI-1诱导的纤维化和炎症标志物的mRNA表达，并逆转了PAI-1对纤溶酶活性的抑制，这证实了TM化合物作为PAI-1抑制剂的功效。这些数据表明，TM化合物可用于预防糖尿病肾损伤。[2]

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TM化合物改善STZ诱导的糖尿病小鼠的肾功能和形态[1]
注射STZ后16周，与年龄匹配的对照组小鼠相比，小鼠的体重增加较低，血糖水平升高。糖尿病小鼠的血糖水平不受TM5275（50mg/kg）或TM-5441（10mg/kg）治疗的影响（表1）。糖尿病小鼠的肾脏与体重比（表1）和血浆肌酐水平（图1A）也有所增加，这些变化同样没有受到TM化合物的显著影响（图1A。此外，STZ诱导的糖尿病小鼠尿白蛋白排泄、肾小球体积和FMA显著增加。有趣的是，TM化合物有效地减少了糖尿病小鼠的蛋白尿和FMA（图1B、1C和1E），尽管这两种抑制剂都没有对STZ诱导的肾小球肥大产生很大影响（图1C和1D）。这些数据共同表明，TM化合物TM5275和TM5441保护小鼠免受糖尿病诱导的蛋白尿和系膜扩张，而不影响高血糖。

流式细胞术[1]
细胞以每孔120000个细胞的密度在6孔板上一式三份，第二天用50μM TM5275或TM-5441处理8小时（溴脱氧尿苷（BrdU）掺入）或24和48小时（线粒体去极化）。对于膜联蛋白V，用指定剂量处理细胞48小时。对于BrdU掺入，根据制造商的建议，在使用异硫氰酸荧光素（FITC）BrdU Flow试剂盒（BD）收获细胞之前，用10μM BrdU脉冲细胞20分钟。根据制造商的建议，使用MitoProbe 5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物（JC-1）检测试剂盒 评估线粒体去极化。根据制造商的建议，使用Annexin V FITC凋亡检测试剂盒I（BD）评估凋亡细胞（早期凋亡的Annexin V+/PI-细胞和晚期凋亡的Annexin V+/PI+细胞）。使用DiVA软件（6.0版，BD）在BD LSR II系统（BD）中通过流式细胞术分析细胞。

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半胱天冬酶3/7活性测定[1]
按照细胞存活率的描述对细胞进行铺板，并用浓度逐渐增加的TM5275或TM-5441处理48小时。ApoLive-Glo试剂盒 用于用荧光染料测量细胞存活率，然后根据制造商的建议在室温下用发光活性测量胱天蛋白酶3/7活性。将半胱天冬酶3/7活性标准化为细胞活力，并绘制为与DMSO对照细胞相比的倍数变化。

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细胞培养[2]
将小鼠近端肾小管上皮（mProx24）细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的DMEM中在37°C、5%CO2的加湿气氛中培养。将接近融合的细胞与无血清培养基孵育24小时，用50μM的TM5275或10μM的TM-5441预处理4小时，然后用重组PAI-1刺激（约90%的生物活性）。

20 mg/kg；口服
携带 HT1080 和 HCT116 异种移植瘤的小鼠[1]

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在体内实验中，TM-5441（20、50 或 100 mg/kg）溶于 DMSO，并加入到花生酱和蜂蜜中。 对照组给予等量的溶剂（等体积的 DMSO 与花生酱和蜂蜜混合）。然后，每只小鼠被给予抑制剂或溶剂混合物，直至其摄入全部剂量。[1]
HT1080 细胞用萤火虫荧光素酶慢病毒载体转导，并在 100 μg/mL 遗传霉素中筛选两周。之后，细胞在遗传霉素中维持培养。如前所述，将 5×10⁶ 个 HT1080-荧光素酶细胞皮下注射到 5 周龄 nu/nu 雌性小鼠的右侧腹部。每隔2-3天测量可触及的肿瘤大小和小鼠体重。当肿瘤体积达到最大值1500 mm³时，处死小鼠。肿瘤体积采用修正椭球体公式计算：肿瘤体积（mm³）=（宽度，mm）² ×（长度，mm）× π/6。进行生物发光成像时，小鼠经静脉注射（iv）D-荧光素（0.3 mL），剂量为5 mg/kg。15分钟后，使用Xenogen IVIS系统以2秒的曝光时间测定荧光素酶活性。测量HT1080肿瘤细胞发出的生物发光（总通量），并以相对荧光素酶单位表示。进行出血时间测试时，使用Surgicutt Newborn自动切口器在小鼠背尾静脉上切开0.5 mm深、2.5 mm长的切口。每隔15秒用滤纸轻轻按压出血伤口，直至伤口停止出血。在最后一次给予TM-5441后1小时，并在处死小鼠前（第16-30天）进行出血时间测定。测量结果精确到15秒。[1]我们使用6周龄雄性C57BL/6小鼠，并将其分为6组。通过腹腔注射150 mg/kg链脲佐菌素（STZ）诱导小鼠糖尿病。年龄匹配的对照组小鼠注射等体积的柠檬酸钠缓冲液（100 mM柠檬酸钠，100 mM柠檬酸，pH 4.5）。对照组和糖尿病组小鼠分别口服TM5275（50 mg/kg/天）和TM-5441（10 mg/kg/天），持续16周。 TM5275 和 TM-5441 的有效剂量是根据之前的研究和我们的初步研究（数据未显示）确定的。未接受 TM 化合物处理的小鼠注射等体积的 0.5% 羧甲基纤维素溶液，该溶液是 TM5275 和 TM-5441 的溶剂。每天至少监测小鼠一次，实验期间无小鼠死亡。所有小鼠在 STZ 注射后 16 周，用 16.5% 氨基甲酸乙酯（10 mL/kg）麻醉后处死。用肝素化注射器采集血液。我们采集血液用于测定血浆葡萄糖和肌酐，尿液用于测定蛋白质，肾脏用于免疫组织化学分析。[2]

[1]. Small Molecule Inhibitors of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Elicit Anti-Tumorigenic and Anti-Angiogenic Activity. PLoS One. 2015 Jul 24;10(7):e0133786.

[2]. Novel Plasminogen Activator Inhibitor-1 Inhibitors Prevent Diabetic Kidney Injury in a Mouse Model. PLoS One. 2016 Jun 3;11(6):e0157012.

大量研究表明，肿瘤和血液中纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1) 水平升高与癌症患者预后不良之间存在矛盾的正相关性，提示 PAI-1 可能是一个治疗靶点。本研究在癌症临床前模型中测试了两种口服生物利用度良好的 PAI-1 小分子抑制剂（TM5275 和 TM-5441）的疗效。结果表明，这些抑制剂能够降低多种人癌细胞系的细胞活力，IC50 值在 9.7 至 60.3 μM 范围内，并在 50 μM 浓度下诱导细胞内源性凋亡。在体内，对HT1080和HCT116异种移植小鼠口服TM5441（20 mg/kg/天）可增加肿瘤细胞凋亡，并对肿瘤血管系统产生显著的破坏作用，这与肿瘤生长减缓和生存期延长相关，但这些结果不具有统计学意义。药代动力学研究表明，口服给药后1小时血浆峰浓度平均为11.4 μM，23小时后则无法检测到。为了进一步研究TM5441对体内肿瘤血管系统的影响，研究人员在体外内皮细胞（EC）中进行了分析。结果表明，TM5275和TM5441均能抑制EC在3D Matrigel模型中的分支形成，而它们对EC凋亡的影响却很小。这些研究为PAI-1抑制剂的活性提供了新的见解，并为未来设计靶向PAI-1的抑制剂作为癌症治疗药物提供了重要信息。 [1]

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本数据首次对 PAI-1 抑制剂 TM-5441 在癌症中的体内活性进行了分析。TM5275 和 TM5441 可诱导多种人类癌细胞系发生内源性凋亡，并以一种与其体外对内皮细胞的凋亡活性无关的方式抑制内皮细胞分支。在 HT1080 和 HCT116 异种移植瘤模型中，这些体内结果表明，尽管 TM5441 具有血管破坏作用（在 HT1080 模型中肿瘤生长减缓和生存期延长的趋势），但这些作用不足以影响肿瘤生长，即使我们观察到体内 TUNEL 染色显著减少。
作为比较，TM5275 和 TM-5441 的 IC50 值与另一种先前报道的 PAI-1 抑制剂 PAI-039 的 IC50 值相似。通过tPA依赖性水解法测得化合物的IC50值分别为：PAI-749（PAI-039的活性更强的衍生物）为8.37 μM，TM5275为6.95 μM。若以细胞活力为标准，根据既往数据计算得出PAI-039在HT1080细胞和HCT116细胞中的IC50值分别为29 μM和32 μM，与TM5275和TM5441的IC50值范围相近。TM化合物的IC50值与细胞裂解液中测得的总PAI-1水平之间无相关性。这表明除PAI-1外，其他因素也可能发挥作用，例如膜结合纤溶酶、uPA或细胞凋亡敏感性等，这些因素均参与调控细胞活力。 [1]

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本研究旨在提供实验证据，证明两种新型口服活性PAI-1抑制剂TM5275和TM-5441能够预防糖尿病肾损伤的发生和发展，并提示TM系列化合物可作为预防糖尿病肾病的新策略。结果显示，在注射链脲佐菌素（STZ）16周后，糖尿病小鼠的各项肾损伤指标（与对照组小鼠相比）均升高，例如血浆肌酐水平、尿白蛋白排泄量、肾脏/体重比、肾小球体积和FMA值。值得注意的是，TM5275和TM5441治疗可有效降低尿白蛋白排泄量和FMA值。与我们的结果一致，TM系列的另一种化合物在NEP25/LMB2足细胞损伤小鼠模型中显著降低了蛋白尿。关于PAI-1对尿白蛋白水平的机制解释，有研究提出PAI-1/uPA复合物介导的uPAR依赖性足细胞β1整合素内吞作用在进行性足细胞损伤中导致蛋白尿。然而，抑制PAI-1并未影响链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，这与之前的研究结果一致[26]。这些数据表明，TM类化合物能够改善糖尿病小鼠的肾功能和形态。
TM5007（TM5275和TM-5441的母体化合物）能够预防博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，而替普拉西汀（一种吲哚氧乙酸衍生物）能够减轻血管紧张素II诱导的小鼠主动脉重塑。这两项研究表明，PAI-1抑制剂作为同类最佳药物，可能具有抗纤维化作用。本研究证实了TM5275和TM5441在糖尿病肾损伤中的抗纤维化作用，这与先前使用PAI-1基因敲除小鼠的研究结果一致。PAI-1缺陷可减少链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠和db/db糖尿病小鼠的细胞外基质（ECM）积累以及肾小管间质或肾小球纤维化。
总之，TM化合物改善了STZ诱导的糖尿病小鼠的肾功能、纤维化和炎症。因此，口服两种不引起出血的新型PAI-1抑制剂TM5275和TM-5441，可能成为治疗糖尿病肾病的一种有效方法。

C21H17CLN2O6

428.8225

428.077

C, 58.82; H, 4.00; Cl, 8.27; N, 6.53; O, 22.39

1190221-43-2

44250349

White to off-white solid powder

3.3

118

3

6

8

30

618

0

ClC1C([H])=C([H])C(=C(C(=O)O[H])C=1[H])N([H])C(C([H])([H])OC([H])([H])C(N([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C(C2=C([H])OC([H])=C2[H])=C1[H])=O)=O

BGGMLMAPVODXAU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H17ClN2O6/c22-15-4-5-18(17(9-15)21(27)28)24-20(26)12-30-11-19(25)23-16-3-1-2-13(8-16)14-6-7-29-10-14/h1-10H,11-12H2,(H,23,25)(H,24,26)(H,27,28)

5-chloro-2-[[2-[2-[3-(furan-3-yl)anilino]-2-oxoethoxy]acetyl]amino]benzoic acid

TM-5441; TM 5441; 1190221-43-2; 5-chloro-2-(2-(2-((3-(furan-3-yl)phenyl)amino)-2-oxoethoxy)acetamido)benzoic acid; 5-chloro-2-[[2-[2-[3-(furan-3-yl)anilino]-2-oxoethoxy]acetyl]amino]benzoic acid; BGGMLMAPVODXAU-UHFFFAOYSA-N; 33S35WFR9H; TM5441;BMS-790052; BMS-790052; BMS790052; EBP 883; EBP-883; EBP883

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。