Sodium/glucose cotransporter 2 (SGLT2)

当肾小管细胞暴露于高葡萄糖水平时，托福沙星 (3–30 nM) 处理 24 小时可抑制氧化应激的产生和单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 基因的表达[2]。用托福沙星（3-30 nM；8 天；肾小管上皮细胞）治疗可防止高葡萄糖诱导的细胞凋亡[2]。

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钠/葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）是肾脏葡萄糖重吸收的主要介导因子，也是治疗糖尿病的新兴分子靶点。我们发现了一种新型强效选择性SGLT2抑制剂托格列净（Tofogliflozin，CSG452），并研究了其作为抗糖尿病药物的功效和药理学特性。托格列净能竞争性抑制SGLT2过表达细胞中的SGLT2活性，其对人类、大鼠和小鼠SGLT2抑制的Ki值分别为2.9、14.9和6.4 nM。在处于临床开发阶段的SGLT2抑制剂中，托格列净对人类SGLT2的选择性（相较于人类SGLT1、SGLT6和钠/肌醇转运体1）最高。此外，在一系列葡萄糖相关生理过程测试（包括葡萄糖摄取、葡萄糖氧化、糖原合成、肝糖生成、葡萄糖刺激的胰岛素分泌以及葡萄糖苷酶反应）中，均未观察到托格列净的相互作用。[1]

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肾小球过滤的葡萄糖中90%由钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）重吸收，该蛋白主要表达于肾近端小管S1和S2段。由于糖尿病状态下SGLT2介导的葡萄糖重吸收增加，选择性抑制SGLT2成为治疗糖尿病的潜在靶点。我们近期研究发现，SGLT2抑制剂对实验性糖尿病肾病具有抗炎和抗纤维化作用，部分机制是通过抑制肾脏晚期糖基化终末产物形成和氧化应激产生。然而，SGLT2抑制剂对肾小管细胞损伤的直接作用尚不明确。本研究探讨了高选择性SGLT2抑制剂托格列净对高糖环境下培养的人肾近端小管细胞氧化应激、炎症及促凋亡反应的影响。托格列净呈剂量依赖性抑制葡萄糖进入肾小管细胞。高糖环境（30 mM）暴露4小时和24小时显著增加肾小管细胞氧化应激产生，而托格列净或抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可抑制该效应。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因表达和凋亡性细胞死亡分别由4小时和8天的高糖暴露诱导，两者均可被托格列净或NAC阻断。本研究表明，SGLT2介导的葡萄糖进入肾小管细胞可能刺激氧化应激并引发该细胞类型的炎症和促凋亡反应。SGLT2抑制剂阻断肾小管细胞葡萄糖重吸收可能对糖尿病肾病的肾小管间质损伤产生有益作用。[2]

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通过使用人肝微粒体、人肝细胞和重组人CYPs的体外研究，评估了强效高选择性钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂托格列净的代谢和药物-药物相互作用（DDI）风险。2. 托格列净在人肝细胞中的主要代谢物为羧基化衍生物（M1），与体内情况一致。托格列净代谢为M1的途径推测如下：首先由CYP2C18、CYP4A11和CYP4F3B催化为初级羟基化衍生物（M4），随后M4被氧化为M1。3. 托格列净对CYP1A2和CYP3A4无诱导潜力。除M1对CYP2C19有微弱抑制作用外，托格列净和M1均无CYP抑制潜力。4. 托格列净不仅通过多种代谢酶参与代谢，口服给药后还可经尿液排泄，表明该药物通过多重途径消除。因此，联用药物引起的DDI不会显著改变托格列净的暴露量。同时，由于托格列净无CYP诱导或抑制能力，且主要代谢物M1无临床相关CYP抑制潜力，托格列净似乎不会引起联用药物的显著DDI[4]。

用托格列净（0.1-10 mg/kg；口服；每天一次；持续 4 周；db/db 小鼠）治疗肥胖糖尿病小鼠可改善高血糖，从而改善葡萄糖耐受不良[1]。

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托格列净可抑制血糖和糖化血红蛋白水平，同时保护胰腺β细胞数量并维持血浆胰岛素水平。氯沙坦治疗未观察到血糖状况或胰岛素水平的改善。虽然未经治疗的db/db小鼠尿白蛋白/肌酐比值从基线水平逐渐升高，但托格列净或氯沙坦治疗可阻止该升高（幅度达50-70%）。托格列净（而非氯沙坦）能减轻肾小球肥大，但两者均未改变基质扩张。
结论与意义：在2型糖尿病小鼠模型中，托格列净对肾脏SGLT2的长期抑制不仅能保护胰腺β细胞功能，还可预防肾功能障碍。这些发现表明，2型糖尿病患者长期使用托格列净或可预防糖尿病肾病进展。[3]

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为更精确评估长期SGLT2抑制的肾脏保护作用，我们比较了托格列净（高选择性SGLT2抑制剂）与氯沙坦（血管紧张素II受体拮抗剂）对肾脏和β细胞功能的影响，并对肾小球和胰岛β细胞质量进行定量分析。我们证实托格列净对SGLT2的长期抑制不仅能防止db/db小鼠胰岛β细胞流失，还可阻止肾功能损害进展。

本研究中，托格列净治疗4-8周期间观察到持续降血糖作用和稳定的糖化Hb水平降低（图1A、B、E），同时葡萄糖清除率显著增加，表明托格列净治疗可实现稳定的长期血糖控制。根据小鼠血浆中托格列净的实测浓度（0.015%托格列净组）及其蛋白结合特性，我们估算未结合托格列净浓度在120-350 nM之间。该浓度约为托格列净对小鼠SGLT2半数抑制浓度（IC50值5.0 nM）的24-70倍，同时是其对小鼠SGLT1 IC50值（1800 nM；Suzuki等，2012）的1/15至1/5。因此，上述未结合托格列净浓度足以几乎完全抑制小鼠SGLT2，但不会抑制小鼠SGLT1。[3]

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为理解钠-葡萄糖协同转运蛋白（SGLT）抑制剂诱导的尿糖排泄（UGE）相关低血糖风险，需明确SGLT2与SGLT1对肾脏葡萄糖重吸收（RGR）贡献比例的比值与体内血糖水平的关系。为研究正常大鼠中SGLT2和SGLT1的贡献，我们比较了托格列净（高选择性SGLT2抑制剂）和根皮苷（SGLT1/2抑制剂）在完全抑制大鼠SGLT2（rSGLT2）同时不同程度抑制rSGLT1的血浆浓度下的RGR抑制效果。通过葡萄糖滴定建立的高血糖状态下，托格列净和根皮苷均可实现≥50%的RGR抑制。通过高胰岛素钳夹建立的 hypoglycemic 状态下，根皮苷使RGR降低20-50%，而托格列净仅降低1-5%，表明低血糖状态下rSGLT2对RGR的贡献小于高血糖状态。接着为评估SGLT1/2抑制的低血糖潜力，我们在SGLT抑制剂诱导UGE后同步检测了血糖（PG）和内源性葡萄糖生成（EGP）。托格列净（400 ng/ml）诱导约2 mg·kg⁻¹·min⁻¹的UGE，并使EGP增加1-2 mg·kg⁻¹·min⁻¹，最终PG维持在正常范围。根皮苷（1,333 ng/ml）诱导约6 mg·kg⁻¹·min⁻¹的UGE，EGP增加约4 mg·kg⁻¹·min⁻¹（高于托格列净组），但最低PG更低。这些结果表明SGLT1对RGR的贡献在低血糖状态下大于高血糖状态，且SGLT2选择性抑制剂比SGLT1/2抑制剂具有更低 hypoglycemia 风险。[5]

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本研究中，我们通过比较托格列净（高选择性SGLT2抑制剂）与根皮苷（SGLT1/2抑制剂）在正常大鼠葡萄糖滴定和钳夹实验中对RGR的抑制作用，探究了不同血糖状态下SGLT2和SGLT1的贡献。特别地，我们在固定各SGLT抑制剂血浆浓度的条件下进行实验，以评估根据血浆浓度估算的抑制活性与RGR抑制之间的关系。

在高血糖状态下（方案1），托格列净（≥133 ng/ml）和根皮苷（≥400 ng/ml）均可实现超过50%的RGR抑制（图3）。根据实际血浆浓度（表1）和托格列净的蛋白结合特性，我们估算133 ng/ml（实际平均浓度168 ng/ml）和400 ng/ml（实际平均浓度474 ng/ml）托格列净的未结合浓度分别为70 nM和196 nM。考虑到托格列净对rSGLT1和rSGLT2的IC50值（基于其在过表达rSGLT1或rSGLT2的COS-7细胞中对非代谢性葡萄糖类似物α-甲基-d-吡喃葡萄糖苷[AMG]钠依赖性摄取的抑制活性计算得出：rSGLT1为8,200 nM，rSGLT2为15 nM）（21），上述未结合托格列净浓度足以几乎完全抑制rSGLT2但不会抑制rSGLT1[5]。

体外SGLT2抑制及SGLT2选择性研究 [1]
通过在过表达各物种SGLT2的细胞（CHO、COS-7）中评估钠依赖性AMG摄取，检测了托格列净与根皮苷对人类、大鼠和小鼠SGLT2的抑制活性。Lineweaver-Burk图分析显示两种化合物均以底物竞争性抑制方式抑制AMG摄取（图2），根皮苷对人类、大鼠和小鼠SGLT2抑制的Ki值分别为13.6±1.4、39.4±0.8和13.8±0.7 nM。托格列净对各...

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托格列净在人肝细胞中的代谢 [4]
孵育体系包含混合人肝细胞（1×10⁶细胞/mL）、L-谷氨酰胺（0.292 g/L）、青霉素/链霉素（50单位/50 μg/mL）、胰岛素（10⁻⁷ M）和地塞米松（10⁻⁷ M）的William's E培养基。平行孵育混合物在37℃、5% CO₂条件下，通过Rotamax120以300 rpm转速预孵育15分钟直至温度平衡。抑制实验中，在预孵育前向体系加入月桂酸ω及(ω-1)羟基化抑制剂10-十一碳炔酸（终浓度150 μM），对照组加入等体积空白溶剂。反应通过加入终浓度1 μM的[¹⁴C]托格列净启动。抑制剂和底物溶于二甲基亚砜（DMSO），孵育体系中DMSO终浓度<0.4%。孵育5小时后加入冰乙腈终止反应，混合后5℃、3000 rpm离心5分钟，收集上清作为HPLC分析样本。各峰放射性百分比计算公式：放射性百分比（%）=代谢物峰放射性/总峰放射性×100。当放射性峰高低于背景两倍时判定为未检出（ND），不计算放射性百分比。10-十一碳炔酸对托格列净代谢的抑制率计算公式：抑制率（%）=（1-I/C）×100（I/C分别代表存在/不存在抑制剂时的代谢物放射性百分比）。若抑制剂存在时放射性百分比为ND，则抑制率定义为100%。通过对比保留时间和质谱裂解模式与标准品（补充材料1）鉴定人肝细胞孵育中的[¹⁴C]托格列净及其代谢物。

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托格列净在人肝微粒体中的代谢 [4]
孵育体系包含1 mg/mL人肝微粒体、0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和NADPH生成系统（1.3 mM NADP⁺、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸、3.3 mM MgCl₂、0.4单位/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）。平行孵育混合物37℃预孵育15分钟。预孵育前加入抑制剂1-氨基苯并三唑（终浓度1 mM），对照组加入空白溶剂。反应通过加入终浓度10 μM的[¹⁴C]托格列净启动。抑制剂和底物溶于DMSO，终浓度<0.4%。孵育1小时后加入冰乙腈终止反应，5℃、15000 rpm离心5分钟，收集上清用于HPLC分析。1-氨基苯并三唑抑制率计算同上。

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托格列净在重组人CYP中的代谢 [4]
使用14种rhCYP（CYP1A2/2A6/2B6/2C8/2C9/2C18/2C19/2D6/2E1/3A4/3A5/4A11/4F2/4F3B）。孵育体系含200 pmol CYP/mL、补充微粒体蛋白（终浓度4 mg/mL）、NADPH生成系统和缓冲液（CYP2A6/2C9/4A11用0.1 M Tris-HCl缓冲液pH 7.5，其余用0.1 M磷酸钾缓冲液pH 7.4）。[¹⁴C]托格列净（终浓度1 μM）孵育及样本制备方法同人肝微粒体实验。DMSO终浓度0.2%，HPLC分析样本。

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CYP诱导研究 [4]
采用三位供体的肝细胞进行。铺板肝细胞在含10%胎牛血清的Modified Lanford's培养基中，分别暴露于托格列净（0.5/5/50 μM）48小时（37℃、5% CO₂、95%湿度）。托格列净溶于DMSO（终浓度0.1%），24小时更换培养基。移除培养基后用预温HBSS洗涤，加入1 μM 7-乙氧基试卤灵（CYP1A2）或100 μM睾酮（CYP3A4）底物溶液孵育1小时。反应终止后离心取上清进行HPLC分析（检测代谢物试卤灵或6β-羟基睾酮），沉淀用1 M NaOH裂解后BCA法测蛋白浓度（补充材料2）。

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可逆抑制实验测定IC50 [4]
孵育体系含0.2 mg/mL人肝微粒体、0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、CYP亚型选择性底物（CYP1A2:1 μM 7-乙氧基试卤灵；CYP2B6:100 μM安非他酮；CYP2C8:2 μM阿莫地喹；CYP2C9:5 μM双氯芬酸；CYP2C19:20 μM S-美芬妥英；CYP2D6:5 μM右美沙芬；CYP3A:5 μM咪达唑仑/10 μM硝苯地平/30 μM睾酮）及测试物（托格列净或M1，浓度梯度0.20-50 μM）。DMSO终浓度0.2%，对照组加等体积DMSO。三份平行样本37℃预孵育10分钟，加入1 mM NADPH启动反应，孵育5-30分钟后用含氘代内标的冰乙腈终止。离心后上清通过LC-MS/MS检测底物代谢物浓度（补充材料2）。酶活性百分比=（测试组代谢物浓度/对照组）×100。出现抑制时通过Origin软件非线性拟合计算IC50，抑制率（%）=100-酶活性百分比。

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时间依赖性抑制实验 [4]
孵育体系含1 mg/mL人肝微粒体、0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）及测试物（托格列净10-100 μM或M1 10-50 μM）。DMSO终浓度0.25%，对照组加等体积DMSO。37℃预热10分钟后加入1 mM NADPH启动预孵育。分别在0.5-15分钟（CYP1A2/2C9:0.5/2.5/4.5/8/15 min；CYP3A:0.5/3/6/10/14.5 min）取样转移至含新鲜NADPH的预温底物溶液（终浓度：微粒体0.1 mg/mL，NADPH 1.1 mM）。底物：CYP1A2用1 μM 7-乙氧基试卤灵或10 μM他克林；CYP2C9用20/25 μM双氯芬酸；CYP3A用10 μM咪达唑仑。单份（托格列净）或三份（M1）孵育10/15分钟后，用含氘代内标的冰乙腈终止反应。离心后上清LC-MS/MS分析（补充材料2）。相对代谢物生成率=（孵育后代谢物浓度/0.5分钟预孵育对照组）×100。通过相对代谢物生成率的自然对数与预孵育时间作图，估算酶活性损失速率常数（kobs，min⁻¹）。

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人血浆蛋白结合实验 [4]
采集5名空腹健康男性志愿者肝素抗凝血（经伦理委员会批准），4℃、3000 rpm离心20分钟获得血浆，混合后当日使用。采用平衡透析法：将充分溶胀的透析膜固定于透析装置，三份平行样本（含M1 0.1/1 μg/mL的血浆与PBS）在37℃、40 rpm振荡孵育20小时。LC-MS/MS测定PBS和血浆中M1浓度。血浆游离分数（fP）和蛋白结合率计算公式： 其中CB和CP分别为PBS和血浆中M1浓度。

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SGLT抑制研究 [4]
将hSGLT2 cDNA克隆至pcDNA3.1载体，转染CHO-K1细胞建立稳定表达株。细胞接种96孔板培养4天后，用无钠缓冲液（含140 mM胆碱氯、2 mM KCl、1 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES/Tris pH 7.4）洗涤两次。平行样本在含1 mM [¹⁴C]AMG及测试物（托格列净或其代谢物）的无钠/含钠缓冲液（无钠缓冲液+140 mM NaCl）中37℃孵育40分钟。DMSO终浓度0.4%。反应终止后用含10 mM非放射性AMG的无钠缓冲液洗涤两次，细胞裂解后通过TopCount-NXT 测定放射性。钠依赖性AMG摄取量=含钠缓冲液AMG摄入量-无钠缓冲液摄入量。IC50值通过SAS临床前软件包进行多元逻辑回归计算。

RT-PCR[2]
细胞类型： 管状上皮细胞
测试浓度： 3 nM 和 30 nM
孵育时间：24小时
实验结果：抑制高糖暴露诱导的肾小管细胞中MCP -1基因表达。

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细胞凋亡分析[2]
细胞类型： 管状上皮细胞
测试浓度： 3 nM 和 30 nM
培养时间：8天
实验结果：抑制高糖诱导的细胞凋亡。

动物/疾病模型： db/db 小鼠[1] ]
剂量： 0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg 或 10 mg/kg
给药途径： 口服；每日一次；持续 4 周
实验结果： 观察到急性血糖降低，糖化血红蛋白呈剂量依赖性降低，在 3 mg/kg 和 10 mg/kg 剂量下显著阻止了 IRI 水平的降低，且食物摄入量或体重无差异。\n

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\n\n长期给药\n将 db/db 小鼠随机分为四组，各组小鼠在 8 周龄时 24 小时尿白蛋白排泄量和体重均匹配。 db/db小鼠分别饲喂标准饲料或含0.005%或0.015%托格列净或0.045%氯沙坦的饲料，持续8周。托格列净的含量根据之前的药代动力学数据（Suzuki等，2012）以及db/db小鼠的预估食物消耗量确定，以完全抑制SGLT2，但不影响SGLT1。db/+m小鼠饲喂标准饲料。定期检测血糖、糖化血红蛋白、血浆胰岛素、血浆肌酐、尿糖、尿肌酐和尿白蛋白水平。从尾静脉或下腔静脉采集血样，用于检测血糖、糖化血红蛋白、血浆胰岛素和血浆肌酐水平。使用代谢笼收集尿液，以测定尿糖、尿肌酐和尿白蛋白的排泄量。治疗8周后，在异氟烷麻醉下，通过腹主动脉采集全血处死动物。分离肾脏和胰腺，用于后续所述的组织学分析。作为这些研究的一部分，另取一组db/db小鼠（16周龄，n = 9），饲喂含0.015%托格列净的饲料4天。随后，在第4天的10:00、15:00和20:00，分别处死3只小鼠，在麻醉下通过腹主动脉采集全血，并通过离心获得血浆样本，以测定血浆托格列净浓度。尿液和血浆样本储存在−80°C直至使用。\n

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\n\n托格列净以0.6 mg/ml的浓度溶于生理盐水中，并进行系列稀释。[5]
\n血液和尿液采集的输注方案[5]
\n\n葡萄糖滴定诱导高血糖条件下的尿糖排泄试验（方案1）。[5]
\n每只动物分别通过静脉导管V1以15 ml·kg−1·h−1的速率和通过静脉导管V2以10 ml·kg−1·h−1的速率输注生理盐水，持续60分钟。接下来，通过静脉导管V1以2 ml/kg（推注）加15 ml·kg⁻¹·h⁻¹的速率输注托格列净或根皮苷溶液，同时通过静脉导管V2以10 ml·kg⁻¹·h⁻¹的速率持续输注生理盐水。所用托格列净和根皮苷溶液的浓度是根据从单独的药代动力学研究（数据未显示）中获得的药代动力学参数确定的，以维持托格列净的血浆浓度为4、13.3、40、133或400 ng/ml，根皮苷的血浆浓度为40、133、400或1333 ng/ml。具体而言，为使托格列净血浆浓度达到 400 ng/ml，所需的输注速率为 1.2 mg/kg（推注）和 0.5 mg·kg⁻¹·h⁻¹（持续输注）；为使根皮苷血浆浓度达到 1333 ng/ml，所需的输注速率为 0.15 mg/kg（推注）和 2.8 mg·kg⁻¹·h⁻¹（持续输注）。托格列净或根皮苷输注 60 分钟后，通过静脉导管 V2 以 10 ml·kg⁻¹·min⁻¹ 的速率，从 10% 开始，每隔 30 分钟逐步增加葡萄糖溶液（10%、20%、30%、40% 和 50%），以使血浆葡萄糖浓度升高至 400 mg/dl 以上。每隔 15 分钟用肝素化注射器采集 0.25 ml 血样；使用血浆葡萄糖监测系统检测血样中的血浆葡萄糖水平，然后通过离心获得血浆样本，以测定血浆葡萄糖和肌酐水平以及托格列净或根皮苷的浓度。葡萄糖输注后，每隔 30 分钟通过膀胱导管收集尿液至预先称重的聚乙烯样本管中。用 0.5 ml 生理盐水冲洗导管以尽量减少残留尿液。尿量通过从收集的尿液加上样本管的重量中减去预先称重的样本管的重量来确定，其中收集的尿液比重为 1。尿液和血浆样本储存在 -80°C 直至使用。\n

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\n\n在葡萄糖钳夹试验（方案 2）诱导的低血糖和正常血糖条件下进行尿糖排泄率 (UGE) 测定。 [5]
\n每只动物均通过静脉导管 V1 以 15 ml·kg−1·h−1 的速率输注生理盐水，并通过静脉导管 V2 以 10 ml·kg−1·h−1 的速率输注生理盐水，持续 90 分钟。随后，通过静脉导管 V3 开始输注胰岛素（40 mU·kg−1·min−1，持续 3 分钟；20 mU·kg−1·min−1，持续输注）。胰岛素输注 30 分钟后，通过静脉导管 V1 开始以 2 ml/kg（推注）和 15 ml·kg−1·h−1（持续输注）的速率输注托格列净或根皮苷溶液，同时保持通过静脉导管 V2 以 10 ml·kg−1·h−1 的速率持续输注生理盐水。所用托格列净和根皮苷溶液的浓度按照方案 1 的方法确定。托格列净或根皮苷溶液输注 60 分钟后，通过静脉导管 V2 开始输注 20% 葡萄糖溶液，输注速率根据公式计算得出，以使血浆葡萄糖浓度达到约 100 mg/dl。葡萄糖输注结束后，每隔 5-10 分钟从颈静脉采集 0.01 ml 血液样本，使用 Accu-check Aviva 血糖仪测量血浆葡萄糖水平，并根据相同的公式调整葡萄糖输注速率。按照方案 1 的方法，额外采集并制备血液样本 (0.25 ml) 和尿液样本。在本方案中，我们将低血糖条件下的尿糖排泄 (UGE) 定义为胰岛素联合托格列净或胰岛素联合根皮苷输注期间最后 30 分钟的尿糖排泄，将正常血糖条件下的尿糖排泄定义为胰岛素联合托格列净或根皮苷输注葡萄糖的最后 30 分钟的尿糖排泄，如图 4 所示。\n

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\n\n托格列净或根皮苷诱导的急性尿糖排泄对血浆葡萄糖水平和内源性葡萄糖生成 (EGP) 的影响（方案 3）。[5]
\n每只动物通过静脉导管 V1 以 25 ml·kg−1·h−1 的速率输注生理盐水，并通过静脉导管 V2 以 0.14 mg·kg−1·min−1 的速率输注 [U-13C]葡萄糖 (99%) 生理盐水。在 150 分钟的基础输注期后，开始通过静脉导管 V1 以 2 ml/kg（推注）和 25 ml·kg⁻¹·h⁻¹（持续）的速率输注托格列净（1.2 mg/kg 推注；0.5 mg·kg⁻¹·h⁻¹）或根皮苷（0.15 mg/kg 推注；2.8 mg·kg⁻¹·h⁻¹）。从托格列净或根皮苷输注开始后的 120 分钟内，按照方案 1 的方法采集并制备血液和尿液样本。

托格列净的人体代谢谱[4]
图1显示了[14C]托格列净与人肝细胞孵育5小时后的代谢谱。[14C]托格列净代谢为羧基化衍生物（M1）、仲羟基化衍生物、差向异构体-1和差向异构体-2（M2和M3）、伯羟基化衍生物（M4）和酮衍生物（M5）。孵育后各代谢物的放射性分别为：M1为30.9%，M2/M3为0.6%，M4为1.1%，M5为3.7%。各代谢物的化学结构如图2所示。

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代谢酶的鉴定[4]
为了阐明[14C]托格列净转化为M2/M3或M4是否由CYP酶催化，我们使用人肝微粒体评估了辅因子需求以及1 mM 1-氨基苯并三唑（一种非特异性CYP抑制剂）的作用。代谢物在NADPH生成系统存在下生成，1-氨基苯并三唑几乎完全抑制了M2/M3或M4的生成（表1）。

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CYP诱导和抑制[4]
体外CYP诱导和抑制研究在接近或高于临床研究中观察到的最大血浆浓度（Cmax）的浓度下进行；托格列净和M1的Cmax值分别为489和189 ng/mL（1.27和0.45 μM）。
在0.5–50 μM的浓度范围内，托格列净未诱导CYP1A2和CYP3A4活性（表3）。由于孵育混合物中托格列净与FBS结合，其游离浓度可能低于标称值。阳性对照诱导剂的结果见补充材料3（表S1）。
托格列净对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6或CYP3A活性均无可逆抑制作用（各CYP的IC50 > 50 μM）。 M1 对除 CYP2C19（IC50 = 27.1 ± 6.5 μM）以外的 CYP 同工酶均无抑制作用（各 CYP 的 IC50 > 50 μM）（表 4）。阳性对照抑制剂的结果见补充材料 3（表 S2）。此外，还评估了 CYP1A2、CYP2C9 和 CYP3A 活性的时间依赖性抑制情况；在托格列净浓度为 10–100 μM 以及 M1 浓度为 10–50 μM 的范围内均未观察到抑制作用（表 5）。阳性对照抑制剂的结果见补充材料 3（表 S3）。

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代谢物对 hSGLT2 的体外药理活性[4]
托格列净、M1、M2、M3、M4 和 M5 对 hSGLT2 的 IC50 值分别为 0.0039、2.7、0.015、0.014、0.0049 和 0.016 μM（表 6）。所有代谢物的体外抑制效力均低于托格列净。
据报道，健康受试者口服20 mg [14C]托格列净后，血浆浓度-时间曲线下面积（AUC0-24h）分别为：托格列净1814 ng·h/mL，M1 2215 ng·h/mL，M2/M3 225 ng·h/mL，M5 136 ng·h/mL，且M1是尿液和粪便中的主要代谢物。这些结果表明，托格列净在人体内的主要代谢物是M1。本研究采用人肝细胞研究了[14C]托格列净的代谢，发现托格列净的体外主要代谢物为M1，与体内结果一致（图1）。此外，根据人肝细胞实验（补充材料 4），M1 由 M4 生成。另一方面，考虑到代谢物的结构，预计托格列净会经由 M2/M3 转化为 M5（图 2）。M4 是托格列净主要代谢物 M1 的中间体；因此，参与 M4 生成的酶对托格列净的代谢至关重要。在本研究中，我们重点关注 M4 的生成，并利用重组人细胞色素 P450 (rhCYP)、人肝微粒体和人肝细胞鉴定了负责将托格列净转化为 M4 的代谢酶。
表 1 显示，某些 CYP 酶催化了 [14C]托格列净 的氧化。与14种rhCYP的反应表明，托格列净转化为M2/M3是由CYP2C18、CYP3A4和CYP3A5催化的，而转化为M4是由CYP2C18、CYP4A11和CYP4F3B催化的（表2）。此外，在人肝细胞中，10-十一炔酸几乎完全抑制了托格列净转化为M4的过程。 10-十一炔酸是月桂酸ω-和(ω-1)-羟基化的已知抑制剂，它能抑制CYP4A11和CYP4F3B，因为它抑制了[14C]月桂酸（CYP4A11的底物）和[3H]白三烯B4（CYP4F3B的底物）的代谢，但不抑制双氯芬酸（CYP2C18的底物）的代谢（补充材料5）。体外实验结果似乎存在一些不一致：使用rhCYP的数据表明，托格列净主要通过CYP2C18转化为M4（表2），但使用人肝细胞的抑制实验表明，它主要通过CYP4A11和/或CYP4F3B转化。由于缺乏这些不常见药物代谢酶的背景数据，我们只能做出有限的解释，但我们认为CYP4A11和/或CYP4F3B对托格列净转化为M4的贡献可能高于CYP2C18，因为肝细胞的酶活性能够反映体内情况。此外，尽管目前尚不清楚哪些酶参与了M4转化为M1的过程，但考虑到代谢物的结构，醇脱氢酶和醛脱氢酶可能是其中的关键酶。本研究发现，多种酶参与了托格列净的代谢。考虑到托格列净的总体清除不仅依赖于多种代谢酶，还依赖于15.5%的尿液排泄，因此预计任何合用药物都不会改变托格列净的暴露量。
这项使用重组人细胞色素P450（rhCYP）的研究表明，CYP3A4/5参与了托格列净代谢为M2/M3的过程；然而，在人体内，主要代谢物明确并非M2/M3或M5，而是M1。这意味着CYP3A4/5并非主要的代谢酶。事实上，有报道称酮康唑对托格列净暴露量的影响在临床上并不显著。
托格列净对CYP1A2和CYP3A4缺乏诱导作用是一个良好的特性（表3）。此外，托格列净和M1对大多数CYP同工酶均无可逆抑制作用（各CYP的IC50 > 50 μM），仅M1对CYP2C19有较弱的抑制作用（IC50 = 27.1 μM）（表4）。Bjornsson等人指出，对于可逆抑制，如果Cmax与抑制常数(Ki)的比值低于0.1，则不会发生相互作用。据报道，健康受试者口服20 mg [14C]托格列净后，托格列净和M1的Cmax值分别为489 ng/mL和189 ng/mL（1.27 μM和0.45 μM）。因此，托格列净和M1对各CYP酶的Cmax/IC50值分别计算低于0.025和0.017，表明托格列净和M1的抑制效力不具有临床意义。托格列净和M1均未显示出对CYP1A2、CYP2C9和CYP3A的时间依赖性抑制效力（表5）。这些结果表明托格列净对CYP酶的抑制效力不具有临床意义。尽管缺乏体外数据，但我们认为托格列净对其代谢相关酶（CYP2C18、CYP4A11和CYP4F3B）没有抑制/诱导作用，因为健康受试者连续7天重复服用20 mg托格列净后，其暴露量未发生显著变化。此外，据报道，在评估托格列净和M1对转运蛋白的抑制作用时，预计不会出现由托格列净和M1引起的转运蛋白相关药物相互作用：人多药耐药蛋白（MDR）1、有机阴离子转运蛋白（OAT）1、OAT3、有机阳离子转运蛋白（OCT）2和有机阴离子转运多肽（OATP）1B1（数据未显示）。
考虑到托格列净和M1在人血浆中的fp值分别为0.17和0.45（浓度为0.1 μg/mL，因为其Cmax见表6），且它们的AUC0-24h值分别为1814和2215 ng·h/mL，预计M1不会显示出额外的疗效，因为M1对托格列净的体内抑制效力估计为0.005。 M2/M3 和 M5 也被认为不影响体内疗效：M2/M3 和 M5 的 AUC0–24h 值分别为 225 和 136 ng·h/mL，即使它们的 fp 值为 1，M2/M3 和 M5 相对于托格列净的体内效价估计分别为 0.2 和 0.1。由于 M4 的暴露量无法检测到，因此认为它不会影响体内疗效。
结论 [4]
托格列净的总体消除不仅由多种代谢酶介导，还通过尿液排泄，这表明托格列净的暴露量不易受任何合用药物的影响。此外，托格列净似乎不会引起同时服用药物的显著药物相互作用，因为它对 CYP 没有诱导效力，而且托格列净及其主要代谢物 M1 对 CYP 没有临床相关的抑制效力。

[1]. Tofogliflozin, a potent and highly specific sodium/glucose cotransporter 2 inhibitor, improves glycemic control in diabetic rats and mice. J Pharmacol Exp Ther. 2012 Jun;341(3):692-701.

[2]. Tofogliflozin, A Highly Selective Inhibitor of SGLT2 Blocks Proinflammatory and Proapoptotic Effects of Glucose Overload on Proximal Tubular Cells Partly by Suppressing Oxidative Stress Generation. Horm Metab Res. 2016 Mar;48(3):191-5.

[3]. Tofogliflozin, a novel sodium-glucose co-transporter 2 inhibitor, improves renal and pancreatic function in db/db mice. Br J Pharmacol. 2013 Oct;170(3):519-31.

[4]. In vitro profiling of the metabolism and drug-drug interaction of tofogliflozin, a potent and highly specific sodium-glucose co-transporter 2 inhibitor, using human liver microsomes, human hepatocytes, and recombinant human CYP. Xenobiotica 2015 Mar;45(3):230-8.

[5]. Selective SGLT2 inhibition by tofogliflozin reduces renal glucose reabsorption under hyperglycemic but not under hypo- or euglycemic conditions in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2013 Feb 15;304(4):E414-23.

托格列净已用于研究2型糖尿病治疗和预防的临床试验。钠/葡萄糖协同转运蛋白2 (SGLT2) 是肾脏葡萄糖重吸收的主要介质，也是糖尿病治疗中一个新兴的分子靶点。我们发现了一种新型高效选择性SGLT2抑制剂——托格列净 (CSG452)，并研究了其作为抗糖尿病药物的疗效和药理学特性。托格列净在SGLT2过表达细胞中竞争性抑制SGLT2，其对人、大鼠和小鼠SGLT2的抑制Ki值分别为2.9 nM、14.9 nM和6.4 nM。在所有正在临床开发的SGLT2抑制剂中，托格列净对人SGLT2的选择性高于对人SGLT1、SGLT6和钠/肌醇转运蛋白1的选择性。此外，在一系列检测葡萄糖相关生理过程（如葡萄糖摄取、葡萄糖氧化、糖原合成、肝糖生成、葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖苷酶反应）的测试中，均未观察到托格列净与任何受体的相互作用。单次灌胃给予托格列净可增加Zucker糖尿病肥胖大鼠的肾脏葡萄糖清除率并降低其血糖水平。托格列净还可改善GK大鼠餐后血糖波动。在db/db小鼠中，连续4周的托格列净治疗可降低糖化血红蛋白水平，并在最后一次给药后4天的口服葡萄糖耐量试验中改善葡萄糖耐量。在用托格列净治疗的血糖正常的SD大鼠中未观察到血糖降低。这些结果表明，托格列净以特异性方式抑制SGLT2，通过增加肾脏葡萄糖清除率降低血糖水平，并在低血糖风险下改善2型糖尿病的病理状况。[1]

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最近，我们发现了一种强效且高选择性的SGLT2抑制剂，托格列净（Sato等人，2010）。由于家族性肾性糖尿患者数量较少，人们对长期使用SGLT2抑制剂的安全性担忧程度较低（通常认为这是因为该类患者病情较轻），因此，对这类新兴药物进行深入、多维度的分析对于药物研发，特别是针对2型糖尿病的药物研发，具有重要意义。
在本研究中，我们体外和体内研究了托格列净（CSG452）的药理学特征，不仅评估了其对其他SGLT的选择性，还评估了其对葡萄糖相关生理过程的影响，例如葡萄糖摄取、葡萄糖氧化、糖原合成、肝葡萄糖生成、葡萄糖刺激的胰岛素分泌和葡萄糖苷酶反应。我们发现托格列净对SGLT2具有高度特异性（在我们测试的SGLT2抑制剂中，其对SGLT2相对于其他SGLT成员的选择性最高），并且它通过抑制肾脏对葡萄糖的重吸收来降低血糖水平，从而改善2型糖尿病的病理状况，且低血糖风险较低。[1]

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背景和目的：尽管抑制肾脏钠-葡萄糖协同转运蛋白2 (SGLT2) 对2型糖尿病患者具有稳定的降血糖作用，但SGLT2抑制对2型糖尿病肾功能障碍的影响仍有待确定。为了更精确地评估SGLT2抑制剂的肾脏保护作用，我们比较了托格列净（一种特异性SGLT2抑制剂）和氯沙坦（一种血管紧张素II受体拮抗剂）对db/db小鼠肾功能和β细胞功能的影响。
实验方法：通过对db/db小鼠肾小球大小、系膜基质扩张和胰岛β细胞数量的定量图像分析，研究了托格列净或氯沙坦治疗8周对肾脏和β细胞功能的影响。同时测量了血糖、糖化血红蛋白和胰岛素水平，以及尿白蛋白和肌酐水平。
在之前的研究中，我们报道了托格列净对分离的胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌没有直接影响（Suzuki等，2012）。影像学分析显示，托格列净治疗的db/db小鼠的β细胞数量显著增加（图7D、E），提示保留的胰岛细胞数量可能有助于维持血浆胰岛素分泌。db/db-SGLT2−/−小鼠β细胞功能的保留与β细胞数量的增加和β细胞凋亡发生率的降低相关（Jurczak等，2011）。在0.015%托格列净组中测得的血浆托格列净浓度足以特异性抑制mSGLT2。因此，托格列净治疗的db/db小鼠β细胞数量的增加很可能是由与SGLT2−/− db/db小鼠类似的机制引起的。由于目前尚无人体临床研究直接探讨SGLT2抑制剂对β细胞丢失的影响，因此其在2型糖尿病中的有益作用仍有待确定。
本研究存在一些局限性。首先，由于缺乏db/db小鼠的血流动力学数据，因此之前讨论的氯沙坦和托格列净通过其血流动力学效应发挥肾脏保护作用的机制仍属推测。其次，尽管托格列净降低ACR的机制被认为与其降低血糖密切相关，但托格列净的作用究竟有多少依赖于葡萄糖毒性的降低，又有多少独立于葡萄糖，仍有待阐明。
总之，我们已证实，在2型糖尿病小鼠模型中，长期使用托格列净抑制SGLT2可以预防肾脏和胰腺功能障碍。需要进一步研究来评估托格列净在保护 2 型糖尿病患者肾功能和 β 细胞方面的治疗价值。[3]

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在血糖升高的情况下，托格列净对 RGR 的抑制作用在 133–400 ng/ml 时达到饱和，约为 60%（图 3A），此时 rSGLT2 预计几乎完全被抑制，而 rSGLT1 则不被抑制。相反，在浓度为 400–1333 ng/ml 的根皮苷对 RGR 的抑制作用未观察到饱和现象（图 3B），导致 1333 ng/ml 根皮苷对 RGR 的抑制作用强于 400 ng/ml 托格列净（73 ± 5%，1333 ng/ml 根皮苷；61 ± 5%，400 ng/ml 托格列净；P < 0.05）。在 1333 ng/ml 根皮苷浓度下，预计 rSGLT2 几乎完全被抑制，而 rSGLT1 也被显著抑制约 50%。因此，根皮苷（1333 ng/ml）和托格列净（400 ng/ml）之间RGR抑制率（%）的差异归因于根皮苷对rSGLT1的部分抑制。综上所述，在血糖升高的情况下，rSGLT2对大鼠RGR的贡献约为60%。
在低血糖和正常血糖条件下，采用葡萄糖钳夹技术（方案2），根皮苷在400 ng/ml和1333 ng/ml浓度下分别使RGR降低约25-35%和50-60%，此时rSGLT2几乎完全被抑制，而rSGLT1部分被抑制。相比之下，即使在被认为几乎完全抑制rSGLT2的浓度下，托格列净在低血糖条件下也仅使RGR略微降低（1-5%）（图6）。由于根皮苷和托格列净的实际浓度维持在同一水平（表2），且在测定RGR抑制期间血浆葡萄糖水平和肌酐清除率保持稳定（表3和表4），因此托格列净对RGR的抑制作用极小是由于未抑制rSGLT1所致。在SGLT2基因敲除小鼠中，有研究提出SGLT1在血糖正常条件下对RGR的贡献更大。我们的结果不仅有力地支持了这些观点，而且表明SGLT1在低血糖条件下对RGR起主导作用。为了评估SGLT1的这种主导作用是否仅在SGLT2完全抑制的情况下才能观察到，需要测量近端肾小管不同节段的实际葡萄糖浓度梯度。
最后，我们同时比较了尿葡萄糖生成率（UGE）和内源性葡萄糖生成率（EGP），以评估SGLT抑制剂的降血糖潜力。在血糖正常的情况下，托格列净诱导的尿糖排泄（UGE）和内源性葡萄糖生成（EGP）均增加，同时血浆葡萄糖浓度略有下降。即使在以 400 ng/ml 的浓度输注托格列净 120 分钟后，血浆葡萄糖水平仍维持在 100 mg/dl 以上。增加的 EGP（1–2 mg·kg−1·min−1）与托格列净诱导的 UGE 水平几乎相同。这些结果表明，在血糖正常的情况下，托格列净诱导的 UGE 可以通过 EGP 的增加得到完全补偿。
相反，与托格列净相比，根皮苷在血糖正常的情况下诱导的 UGE 更大，这可能是由于其同时抑制了 SGLT1 和 SGLT2 所致。在根皮苷组中，尽管内源性葡萄糖生成率（EGP）也升高（约4 mg·kg⁻¹·min⁻¹，高于托格列净组），但血浆葡萄糖水平的降低幅度却大于托格列净组。由于根皮苷诱导的尿糖排泄率（UGE）（约6 mg·kg⁻¹·min⁻¹）明显高于EGP的升高幅度，提示SGLT1和SGLT2双重抑制引起的UGE升高并未被EGP的升高完全补偿。在正常血糖条件下，根皮苷治疗大鼠或人体的研究并未提及实际的降血糖作用。即使在我们的实验中，持续输注根皮苷120分钟也未观察到实际的低血糖。然而，根皮苷诱导的尿糖排泄（UGE）水平与基础内源性葡萄糖生成（EGP）的约75%相当（图7），这表明同时抑制SGLT1和SGLT2可能导致低血糖和正常血糖条件下UGE过度，进而引发持续性低血糖。需要进一步研究以了解代偿性EGP增加的机制以及SGLT抑制剂持续诱导UGE的长期影响。
在本研究中，我们探讨了在正常大鼠中，SGLT1抑制伴随SGLT2抑制可能导致低血糖的风险。尽管我们的结果表明高特异性SGLT2抑制剂具有更好的疗效，但仍需要在糖尿病条件下进行实验，以精确评估这些化合物的潜在风险。此外，还需要阐明在不同血糖条件下SGLT1和SGLT2对RGR贡献不同的机制。
总之，研究发现SGLT1对RGR的贡献在低血糖条件下大于高血糖条件，而选择性SGLT2抑制剂托格列净在高血糖条件下对RGR的抑制作用更强。这表明，与SGLT1/2抑制剂相比，SGLT2选择性抑制剂（如托格列净）引起低血糖的风险更低。[5]

C22H26O6.H2O

404.45

404.184

C, 65.33; H, 6.98; O, 27.69

1201913-82-7

Tofogliflozin;903565-83-3

46908928

White to off-white solid powder

0.932

108.61

5

7

4

29

521

5

CCC1=CC=C(C=C1)CC2=CC3=C(CO[C@@]34[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O4)CO)O)O)O)C=C2.O

ZXOCGDDVNPDRIW-NHFZGCSJSA-N

InChI=1S/C22H26O6.H2O/c1-2-13-3-5-14(6-4-13)9-15-7-8-16-12-27-22(17(16)10-15)21(26)20(25)19(24)18(11-23)28-22;/h3-8,10,18-21,23-26H,2,9,11-12H2,1H3;1H2/t18-,19-,20+,21-,22+;/m1./s1

(3S,3'R,4'S,5'S,6'R)-5-[(4-ethylphenyl)methyl]-6'-(hydroxymethyl)spiro[1H-2-benzofuran-3,2'-oxane]-3',4',5'-triol;hydrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.18 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.18 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。