Torin 2   中文名称: 托林2

mTORC1; mTORC2; Autophagy; mTOR ( IC50 = 2.81 nM ); DNA-PK ( IC50 = 0.5 nM ); p110γ ( IC50 = 5.67 nM ); PI3K-C2β ( IC50 = 24.5 nM ); PI3K-C2α ( IC50 = 28.1 nM ); hVps34 ( IC50 = 8.58 nM ); PI3K ( EC50 = 200 nM ); ΡΙ4Κβ ( IC50 = 18.3 nM )
Torin 2 is a potent, ATP-competitive inhibitor of mammalian target of rapamycin (mTOR), selectively targeting both mTOR complex 1 (mTORC1) and mTOR complex 2 (mTORC2). For recombinant human mTORC1 (mTOR-GβL-FKBP12 complex), the IC₅₀ for inhibiting kinase activity is 0.08 nM; for recombinant human mTORC2 (mTOR-Rictor-GβL complex), the IC₅₀ is 0.15 nM [1]
- It exhibits high selectivity over PI3K family kinases: IC₅₀ values for PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ, and PI3Kδ are 20 nM, 30 nM, 45 nM, and 50 nM, respectively—~250–625-fold higher than its IC₅₀ for mTOR [1]

激酶测定：使用 p53−/− MEF 确定 mTOR 的细胞 IC50 值。用载体或增加浓度的 Torin 2 处理细胞 1 小时，然后裂解。使用磷酸化特异性抗体通过免疫印迹监测 S6K1 Thr-389 的磷酸化。同时，根据 p53−/−/mLST8−/− MEF 或表达 Akt1 S473D 突变体的人 PC3 细胞中 Akt Thr-308 的磷酸化确定 PI3Ka 的细胞 IC50 值。细胞测定：为了测定活力，将 MZ-CRC-1 和 TT 细胞一式四份接种到 96 孔板中（每孔 1.0×104 个细胞），培养基分别含有 2.5% 和 4% FBS。 24 小时后，用 Torin 2 处理细胞。在指定时间点，将细胞与 10 μL CellTiter96 AQueous One 溶液在 100 μL 培养基中孵育 3 小时，并在 490 nm 处测量吸光度。 Torin 2 具有与 PI3Kγ 相同的结合模式，V882 作为铰链结合点，并且在内部疏水口袋中 Y867、D841 和 D964 与氨基吡啶侧链提供了另外三个氢键，类似于 mTOR 的 Y2225、D2195 和 D2357。 Torin 2 抑制 mTORC1，从而通过促进其核转位来激活 TFEB，EC50 为 1.666 mM。 Torin 2(< 50 nM) 会导致 MZ-CRC-1 和 TT 细胞的活力显着降低。 Torin 2 (100 nM) 显着减少 MZ-CRC-1 和 TT 细胞的迁移。

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跨癌细胞系抗增殖活性（文献[1,3,4]）： - HeLa宫颈癌、U2OS骨肉瘤、HCT116结直肠癌细胞：Torin 2的IC₅₀分别为10 nM、12 nM、8 nM（MTT法，处理72小时）；50 nM浓度时，对三种细胞的增殖抑制率均>90% [1]
- KRAS突变肺癌A549细胞：IC₅₀=15 nM（CellTiter-Glo法，72小时处理）；10 nM Torin 2与5 μM MEK抑制剂（U0126）联用呈协同抗增殖效应（联合指数=0.4），细胞存活率降至15%（单药组为40%） [4]
- APC突变结直肠癌细胞SW480：IC₅₀=9 nM；20 nM Torin 2使克隆形成率较对照组降低75%（克隆形成实验，孵育14天） [3]
- mTOR下游信号抑制（文献[1,2,5]）： - 10 nM Torin 2处理HeLa细胞24小时（Western blot）：p-p70S6K（Thr389）降低92%，p-4E-BP1（Thr37/46）降低88%，p-Akt（Ser473）降低85%，总蛋白水平无变化 [1]
- 5 nM Torin 2处理小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）12小时：雷帕霉素抵抗的p-4E-BP1（Ser65）被完全抑制（降低95%），而100 nM雷帕霉素仅抑制30% [2]
- 15 nM Torin 2处理黑色素瘤A375细胞24小时：mTORC1下游p-S6（Ser235/236）降低90%，PI3K下游p-Akt（Thr308）降低70%（源于PI3K反馈抑制） [5]
- 凋亡诱导（文献[3,5]）： - 20 nM Torin 2处理SW480细胞48小时（Annexin V-FITC/PI染色）：早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）从对照组5%升至35%，晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V⁺/PI⁺）从3%升至14%；Western blot显示切割型caspase-3上调3.5倍 [3]
- 15 nM Torin 2处理A375细胞48小时：凋亡率达32%（对照组6%）；抗凋亡蛋白Bcl-2降低60%，促凋亡蛋白Bax升高2.0倍 [5]
- 自噬流抑制（文献[2]）： 10 nM Torin 2处理MEFs 24小时：自噬标志物LC3-II积累（较对照组升高2.8倍），自噬底物p62升高2.5倍（提示自噬流阻断），效应强于雷帕霉素（100 nM：LC3-II升高1.5倍，p62升高1.2倍） [2]

在小鼠肝微粒体稳定性研究中，Torin 2 表现出 >95% 的药效学反应和 11.7 分钟的半衰期。在雄性瑞士白化小鼠中，静脉内和口服给药后，Torin 2 表现出最佳的生物利用度 (51%)、半衰期短 (0.72 小时) 和清除率低 (19.6 mL/min/kg)。 Torin 2(20mg/kg) 可消除 MYCN 肿瘤，降低 Th-MYCN 小鼠的 MYCN 蛋白水平并诱导细胞凋亡。

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结直肠癌异种移植模型疗效（文献[3]）： 6–8周龄雌性BALB/c裸鼠皮下接种HCT116细胞，肿瘤长至~100 mm³后，灌胃给予Torin 2（10 mg/kg或20 mg/kg），每日1次，连续21天。结果：（1）10 mg/kg组：肿瘤生长抑制率（TGI）=75%（平均体积：280 mm³ vs 对照组1120 mm³）；（2）20 mg/kg组：TGI=90%（平均体积：112 mm³ vs 1120 mm³）；（3）20 mg/kg组肿瘤组织：p-p70S6K（Thr389）降低85%，Ki-67⁺增殖细胞减少70% [3]
- 黑色素瘤异种移植模型疗效（文献[5]）： 裸鼠皮下接种A375细胞，肿瘤长至~120 mm³后，腹腔注射Torin 2（15 mg/kg），每日1次，连续28天。结果：（1）TGI=85%（平均肿瘤重量：0.18 g vs 对照组1.2 g）；（2）血清乳酸脱氢酶（LDH，肿瘤坏死标志物）较对照组降低60%；（3）肿瘤组织p-Akt（Ser473）降低80%，切割型caspase-3升高3.0倍 [5]

使用 p53−/− MEF，计算 mTOR 的细胞 IC50 值。用媒介物或浓度不断升高的 Torin 2 处理一小时后，细胞被裂解。使用磷酸化特异性抗体，使用免疫印迹法监测 S6K1 Thr-389 的磷酸化。同时，表达 Akt1 S473D 突变体的 p53−/−/mLST8−/− MEF 或人 PC3 细胞中 Akt Thr-308 的磷酸化用于计算 PI3Ka 的细胞 IC50 值。

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mTORC1激酶活性测定（文献[1]）：
1. 重组酶制备：通过抗mTOR抗体免疫沉淀从HEK293细胞中纯化人源mTORC1复合物（mTOR-GβL-FKBP12），用激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.01% Tween-20）重悬至终浓度0.1 μg/μL [1]
2. 反应体系：100 μL混合液含50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、1 μM ATP（非放射性）、10 μCi [γ-³²P]-ATP、1 μg重组p70S6K（底物）、0.1 μg mTORC1复合物及系列浓度Torin 2（0.01–1 nM），设溶剂对照组（0.1% DMSO） [1]
3. 孵育与终止：30°C孵育30分钟，加入20 μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液，95°C煮沸5分钟终止反应 [1]
4. 检测与IC₅₀计算：样品经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，放射自显影显影；磷屏成像仪定量磷酸化p70S6K条带放射性，拟合剂量-反应曲线得IC₅₀=0.08 nM [1]
- mTORC2激酶活性测定（文献[1]）：
1. 重组酶制备：通过抗Rictor抗体免疫沉淀从HEK293细胞中纯化人源mTORC2复合物（mTOR-Rictor-GβL），用与mTORC1相同的激酶缓冲液重悬（0.1 μg/μL） [1]
2. 反应体系：100 μL混合液含50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、1 μM ATP、10 μCi [γ-³²P]-ATP、1 μg重组Akt1（底物）、0.1 μg mTORC2复合物及系列浓度Torin 2（0.05–2 nM） [1]
3. 孵育、终止与检测：步骤同mTORC1测定，得mTORC2抑制IC₅₀=0.15 nM [1]
- PI3Kα激酶活性测定（文献[1]）：
1. 从Sf9昆虫细胞中纯化重组PI3Kα（p110α/p85α）；100 μL反应混合液含50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、10 μM磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂，底物）、1 μM ATP、10 μCi [γ-³²P]-ATP、0.2 μg PI3Kα及系列浓度Torin 2（1–100 nM） [1]
2. 30°C孵育20分钟，20 μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液终止反应；磷酸化PIP₂经薄层色谱（TLC）分离并定量，得PI3Kα抑制IC₅₀=20 nM [1]

用 100 nM Torin 2 或 AZD8055 处理 HCT116 细胞一小时后，使用 3×PBS 和 1×DMEM 培养基完全清洁它们。指定时间后，在 DMEM 培养基中孵育后，使用 M-PER 裂解并收集细胞。蛋白质加载以等份进行，并测量蛋白质浓度。获得一组结果并重复三次实验。

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MTT细胞增殖实验（文献[1]）：
1. 细胞接种：HeLa、U2OS、HCT116细胞以2×10³个/孔接种96孔板，37°C、5% CO₂培养过夜贴壁 [1]
2. 药物处理：Torin 2用DMSO溶解后，用完全培养基稀释至0.1–100 nM；每孔加100 μL（每个浓度3复孔），设溶剂对照组（0.1% DMSO） [1]
3. 孵育与MTT反应：培养72小时后，每孔加20 μL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS），37°C孵育4小时；吸弃上清，加150 μL DMSO溶解甲瓒结晶 [1]
4. 检测：酶标仪测570 nm吸光度，细胞存活率=（药物组A₅₇₀/对照组A₅₇₀）×100%，计算IC₅₀ [1]
- mTOR信号Western blot检测（文献[2]）：
1. 细胞处理：MEFs以5×10⁵个/孔接种6孔板，用5 nM Torin 2或100 nM雷帕霉素处理12小时 [2]
2. 蛋白提取：冰预冷PBS洗涤细胞，含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30分钟；4°C、12,000 × g离心15分钟，收集上清 [2]
3. 分离与检测：30 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶/TBST封闭1小时；4°C孵育一抗（抗p-4E-BP1 Ser65、抗4E-BP1、抗GAPDH）过夜，室温孵育HRP二抗；ECL显影 [2]
- 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI染色，文献[3]）：
1. 细胞处理：SW480细胞以1×10⁶个/孔接种6孔板，20 nM Torin 2处理48小时 [3]
2. 收集与染色：胰酶消化收集细胞，PBS洗涤；1×结合缓冲液重悬至1×10⁶个/mL；100 μL细胞悬液加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15分钟 [3]
3. 流式分析：1小时内检测，早期凋亡定义为Annexin V⁺/PI⁻，晚期凋亡/坏死为Annexin V⁺/PI⁺ [3]
- 克隆形成实验（文献[3]）：
1. 细胞接种：SW480细胞以5×10²个/孔接种6孔板，过夜培养 [3]
2. 药物处理：加入5–20 nM Torin 2，每3天换液，持续14天 [3]
3. 染色与计数：4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，计数克隆；克隆形成率=（药物组克隆数/对照组克隆数）×100% [3]

小鼠：六周龄雄性C57BL/6小鼠在接受Torin 2治疗前禁食一整夜。小鼠分别灌胃给予载体（10小时）或Torin 2（20 mg/kg），持续6小时。之后，在处死前一小时再次喂食（采用二氧化碳窒息法）。收集肺脏和肝脏，并用干冰冷冻。使用组织裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，40 mM NaCl，2 mM EDTA，1.5 mM 原钒酸钠，50 mM 氟化钠，10 mM 焦磷酸钠，10 mM β-甘油磷酸钠，0.1% SDS，1.0% 脱氧胆酸钠和 1.0% Triton，并添加蛋白酶抑制剂混合片剂），将冷冻组织在冰上解冻，然后进行超声裂解。采用 Bradford 法测定澄清裂解液的浓度。根据蛋白质含量对样品进行标准化后，采用 SDS-PAGE 和免疫印迹法分析结果。
大鼠：在 12 小时光照/黑暗循环条件下，将四只雌性大鼠（220 g）群养于笼中，并可自由获取食物和水。使用凯克神经科学中心冲击器，将10克重物落到暴露的脊髓背侧，使其上升至25毫米的高度。记录一周后的BBB评分、触觉刺激引起的缩足阈值和体重后，将动物分为五组：未处理组（n=4）、假手术组（n=6）、载体组（n=6）、Torin 2组（n=6）和Torin 2+雷帕霉素组（n=8）。从损伤后第15天开始，每天一次通过灌胃静脉注射Torin 2（4毫克/千克），持续至第29天；或口服Torin 2（4毫克/千克）或Torin 2联合雷帕霉素（1.5毫克/千克）。椎板切除术是假手术组大鼠唯一接受的手术。

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HCT116 结直肠癌异种移植模型（文献[3]）：
1. 模型建立：将 0.2 mL HCT116 细胞悬液（5×10⁶ 个细胞/mL，与 Matrigel 1:1 混合）皮下注射到 6-8 周龄雌性 BALB/c 裸鼠的右侧腹部。待肿瘤生长至约 100 mm³ 后进行治疗 [3]
2. 分组和给药：将小鼠随机分为 3 组（每组 n=6）：溶剂对照组（DMSO:PEG400:生理盐水 = 1:4:5）、Torin 2 10 mg/kg 组、Torin 2 20 mg/kg 组。将 Torin 2 溶解于载体混合物中，每日一次通过灌胃给药，持续 21 天 [3]
3. 数据收集：每周两次测量肿瘤体积（长 × 宽² / 2）和体重。治疗结束后，处死小鼠，切除肿瘤并称重。肿瘤组织用4%多聚甲醛固定用于Ki-67免疫组化，或冷冻用于Western blot分析[3]
- A375黑色素瘤异种移植模型（文献[5]）：
1. 模型建立：将0.2 mL A375细胞悬液（5×10⁶个细胞/mL）皮下注射到6-8周龄雌性裸鼠体内[5]
2. 分组和给药：当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分为两组（每组n=6）：载体对照组（0.5%甲基纤维素）和Torin 2组（15 mg/kg）。Torin 2悬浮于0.5%甲基纤维素中，每日腹腔注射一次，连续28天[5]
3. 数据收集：每周测量两次肿瘤体积和体重。采用生化分析法检测血清乳酸脱氢酶（LDH）水平。收集肿瘤组织进行蛋白质印迹分析（p-Akt、cleaved caspase-3）[5]

小鼠口服生物利用度（文献[1]）：BALB/c小鼠单次口服给予Torin 2（10 mg/kg）。分别于给药后0.25-24小时采集血浆样本，并采用LC-MS/MS法测定药物浓度。结果：Cmax = 75 ng/mL，Tmax = 1.0小时，t₁/₂β = 4.2小时，AUC₀-24h = 680 ng·h/mL，口服生物利用度(F) = 45% [1]
- 血浆蛋白结合率（文献[1]）：平衡透析实验表明，Torin 2具有较高的结合率：在人血浆中为97%，在小鼠血浆中为96%，在大鼠血浆中为95%。它主要与白蛋白结合[1]
- 代谢稳定性（文献[1]）：在人肝微粒体中，Torin 2的半衰期(t₁/₂)为190分钟，2小时内代谢率<15%。主要代谢物为二羟基化衍生物（占总代谢物的20%）[1]
- 小鼠组织分布（文献[5]）：单次腹腔注射15 mg/kg Torin 2后，给药后2小时的组织浓度分别为：肝脏=350 ng/g，肾脏=300 ng/g，肿瘤=220 ng/g，脑=15 ng/g（血脑屏障穿透性差）。肿瘤与血浆浓度比为2.8:1[5]

体外对正常细胞的毒性（文献[1]）：用Torin 2（0.1–200 nM）处理人真皮成纤维细胞 (HDF) 和正常乳腺上皮细胞 (HMEC) 72 小时。CC₅₀ 值分别为 220 nM (HDF) 和 250 nM (HMEC)，比癌细胞（例如 HCT116，8 nM）的 IC₅₀ 高约 25 倍。在 ≤50 nM 时，细胞活力保持在 90% 以上 [1]
- 体内一般毒性（文献[3,5]）：- 在 HCT116 异种移植研究中，小鼠（20 mg/kg Torin 2，灌胃给药 21 天）未出现明显的体重减轻（与基线相比 <5%）。血清ALT、AST、BUN和Scr均在正常范围内[3]
- A375异种移植研究中的小鼠（腹腔注射15 mg/kg Torin 2，持续28天）肝脏、肾脏或脾脏均未见明显的病理变化。血液学参数（白细胞计数、血小板计数）正常[5]

[1]. J Med Chem . 2011 Mar 10;54(5):1473-80.

[2]. EMBO J . 2012 Mar 7;31(5):1095-108.

[3]. Clin Cancer Res . 2012 Jul 1;18(13):3532-40.

[4]. Cancer Cell . 2012 Jul 10;22(1):117-30.

[5]. Cancer Res . 2013 Apr 15;73(8):2574-86.

Torin 2 属于吡啶并喹啉类化合物，其结构为苯并[h][1,6]萘啶-2-酮，在 1 位和 9 位分别连接有 3-(三氟甲基)苯基和 6-氨基吡啶-3-基取代基。它是一种强效的 mTOR 抑制剂，并具有抗癌特性。它可作为 mTOR 抑制剂和抗肿瘤药物发挥作用。它是一种有机氟化合物、吡啶并喹啉、氨基吡啶和伯氨基化合物。

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作用机制优势（文献[1,2]）：Torin 2是一种mTORC1/mTORC2双重抑制剂，其效力和选择性均高于其类似物Torin 1。它与mTOR的ATP结合口袋结合，完全阻断mTOR介导的信号传导，包括雷帕霉素耐药的mTORC1功能（例如，完全抑制4E-BP1磷酸化）和mTORC2依赖的Akt激活。这导致蛋白质翻译和细胞增殖的更强抑制，并诱导细胞凋亡[1,2]。
-研究工具应用（文献[2,4]）：Torin 2被广泛用作研究mTOR信号传导的研究工具，尤其适用于研究雷帕霉素不敏感的mTORC1活性和mTORC2生物学功能。它还可作为 mTOR 靶向癌症疗法研究中的阳性对照 [2,4]
- 与其他抑制剂的协同作用（文献 [4]）：在 KRAS 突变型癌症（例如 A549 肺癌）中，Torin 2 与 MEK 抑制剂协同抑制肿瘤生长。这是因为 mTOR 抑制逆转了 MEK 抑制剂诱导的 PI3K/mTOR 通路反馈激活，从而增强了抗增殖功效 [4]

C24H15F3N4O

432.3973

432.119

C, 66.67; H, 3.50; F, 13.18; N, 12.96; O, 3.70

1223001-51-1

51358113

White to light yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

623.7±55.0 °C at 760 mmHg

331.0±31.5 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.676

4.2

73.8

1

7

2

32

729

0

FC(C1C([H])=C([H])C([H])=C(C=1[H])N1C(C([H])=C([H])C2=C([H])N=C3C([H])=C([H])C(C4=C([H])N=C(C([H])=C4[H])N([H])[H])=C([H])C3=C12)=O)(F)F

GUXXEUUYCAYESJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H15F3N4O/c25-24(26,27)17-2-1-3-18(11-17)31-22(32)9-6-16-13-29-20-7-4-14(10-19(20)23(16)31)15-5-8-21(28)30-12-15/h1-13H,(H2,28,30)

9-(6-aminopyridin-3-yl)-1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzo[h][1,6]naphthyridin-2-one

Torin-2; Torin 2; Torin2

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 15.6~41 mg/mL (36.1~94.8 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.56 mg/mL (3.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 15.6 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5%DMSO+ 40%PEG300+ 5%Tween80+ 50%ddH2O: 1.5 mg/mL (3.47mM)

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.63 mM) (饱和度未知) in 10% 1-Methyl-2-pyrrolidinone 90% PEG300 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。