TPPB

别名: tppb; 497259-23-1; alpha-APP Modulator; (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(Trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam; CHEMBL331344; (2E,4E)-N-((2S,5S)-5-(hydroxymethyl)-2-isopropyl-1-methyl-3-oxo-1,2,3,4,5,6-hexahydrobenzo[e][1,4]diazocin-8-yl)-5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)penta-2,4-dienamide; (2E,4E)-N-[(2S,5S)-5-(hydroxymethyl)-1-methyl-3-oxo-2-propan-2-yl-2,4,5,6-tetrahydro-1,4-benzodiazocin-8-yl]-5-[4-(trifluoromethyl)phenyl]penta-2,4-dienamide; PKC Activator V; (2E,4E)-N-[(2S,5S)-1,2,3,4,5,6-六氢-5-(羟基甲基)-1-甲基-2-(1-甲基乙基)-3-氧代-1,4-苯并二氮杂环辛四烯-8-基]-5-[4-(三氟甲基)苯基]-2,4-戊二烯酰胺
目录号: V16673 纯度: ≥98%
TPPB 是一种新型、有效且具有细胞渗透性的苯并内酰胺衍生蛋白激酶 C (PKC) 激活剂 (Ki = 11.9 nM),具有神经保护作用。
TPPB CAS号: 497259-23-1
产品类别: PKC
产品仅用于科学研究,不针对患者销售
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纯度: ≥98%

产品描述
TPPB 是一种新型、有效且具有细胞渗透性的苯并内酰胺衍生蛋白激酶 C (PKC) 激活剂 (Ki = 11.9 nM),具有神经保护作用。 TPPB 用于生物滴滤过滤器建模以减少苯乙烯。
生物活性&实验参考方法
靶点

PKC:11.9 nM (Ki)

体外研究 (In Vitro)
使用从阿尔茨海默病患者获得的细胞系,TPPB (compound 5e)(化合物 5e)在 1 μM 剂量下显着增加 sAPPα 分泌 [1]。在 PC12 细胞中,TPPB 通过抗 Aβ25-35 引起神经毒性。在1μM的剂量下,TPPB可以抵消Aβ25-35引起的细胞损伤。 Aβ25-35 治疗可抑制 Akt、PKC、MARCKS 和 MAPK 的磷酸化; TPPB 增加了这种磷酸化。 Aβ25-35 诱导的 caspase-3 激活被 TPPB 抑制 [2]。
通过对来源于AD患者的细胞系的研究,大多数化合物在1 μM浓度下显著增强了sAPPα的分泌,而在0.1 μM浓度下,TPPB(化合物5e)和化合物5f均显著增强了sAPPα分泌。在1 μM时,化合物5c−h对sAPPα分泌的促进作用高于对照化合物8-(1-癸炔基)苯内酰胺(BL)。令人感兴趣的是高亲脂性配体5i的活性缺失,其分子量为11nm。另一方面,它的饱和对应物5j,具有类似的Ki和ClogP,在分泌酶试验中保持活性。在增生研究中,5f在100 μg时表现出适度的反应,5e在300 μg时表现出适度的反应,这表明5f的效力比PKC激活剂mezerein低约30倍,比TPA低100倍。5e的活性大约比5f低3倍。基于对其他强效PKC配体不饱和的影响,我们可以预测5e在大多数试验中保留生物活性,但会显示出明显的促肿瘤活性丧失。因此,化合物5e成为了一种可行的候选化合物,用于寻找能够调节淀粉样蛋白加工的阿尔茨海默病治疗药物。 在之前的研究中,研究者报道了蛋白激酶C (PKC)激活因子TPPB可以通过增加α-分泌酶活性来调节APP加工。在这项研究中,他们进一步研究了TPPB对Aβ(25-35)诱导的PC12细胞神经毒性的潜在神经保护作用。结果表明,浓度为1 μM的TPPB可拮抗Aβ(25-35)诱导的细胞损伤。此外,PKC、Akt和MAPK抑制剂可阻断细胞活力的神经保护作用。实验还表明,TPPB可以增加Akt、PKC、MARCKS和MAPK的磷酸化,而这些磷酸化被Aβ(25-35)抑制。最后,TPPB抑制了Aβ诱导的caspase-3的激活(25-35)。综上所述,本实验提示TPPB对a β(25-35)诱导的PC12细胞神经毒性具有一定作用,并可能提示其治疗AD的潜力。[2]
体内研究 (In Vivo)
增生实验。[1]
TPPB (compound 5e)和5f局部应用于外种Sencar小鼠剃毛后的背部后,评估其诱导增生的作用。根据表皮细胞层数估计增生程度(表2)。将5e和5f的效力与TPA和mezerein的效力进行比较。单次应用1 μg TPA或单次应用3 μg mezerein后观察到可检测到的增生。5f和5e分别在100 μg和300 μg下表现出适度的反应,表明5f的效力比甲泽林低约30倍,比TPA低约100倍。5e的活性大约比5f低3倍。在四次应用后观察到类似的关系,尽管增生的程度更明显。
对远交 Sencar 小鼠的剃光背部进行局部给药后,评估 TPPB 是否会诱导增生,并在 300 μg 剂量下显示出中等反应 [1]。
酶活实验
酸式焦磷酸钠α测试。[1]
分泌的sAPPα的浓度使用常规免疫印迹技术测量,随后对其他地方描述的方案进行轻微修改。每个培养皿/处理中沉淀的蛋白提取物装入新鲜制备的8%丙烯酰胺Tris-HCl微型容器中,用SDS - PAGE分离。样品的体积被校正为每皿的总细胞蛋白。然后电泳将蛋白质转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂牛奶饱和,以阻止非特异性结合。阻断膜与市售抗体6E10(1:500)在4°C下孵育过夜,该抗体在条件培养基 中识别sAPPα。 清洗后,用辣根过氧化物酶偶联抗小鼠IgG二抗室温孵育。然后使用增强的化学发光检测信号,随后使用超膜ECL曝光。使用BioRad GS-800校准扫描密度计和Multianalyst软件,通过密度测定定量波段强度。
细胞实验
将2×104个嗜铬细胞瘤PC12细胞接种到96孔板的每个孔中24小时后,将细胞与一系列浓度(0.1、0.5、1、5、10、20μM)的TPPB一起孵育。 12至24小时后,用含有终浓度0.5g/L的MTT的培养基替换原始培养基4小时。通过 MTT 测定评估细胞活力[2]。
当进行细胞活性,LDH和caspase-3实验时,细胞使用1μM TPPB(溶解在DMSO)或车辆与20μMβ1 h然后24 h。蛋白质磷酸化检测时,细胞使用1μM TPPB 1 h,然后用20μM的β2 h。各种激酶抑制剂使用时,他们说TPPB治疗前30分钟然后暴露于一个β的侮辱。 对于磷酸激酶检测,在药物治疗前24小时用含有0.5% FBS的DMEM代替原培养基。[2]
MTT测定[2]
用MTT法测定细胞活力。简单地说,在96孔板的每孔中分别镀2 × 104个细胞24 h后,细胞与一系列浓度的药物孵育。12 ~ 24 h后,将原培养基替换为含MTT的培养基,终浓度为0.5 g/L,培养4 h。然后丢弃培养基,加入DMSO进行比色测定。在自动减去背景信号后,在Tecan Sunrise Eliza-Reader上测定λ = 570/630 nm处的吸收。结果以对照组细胞的百分比表示。
乳酸脱氢酶(LDH)释放测定[2]
根据制造商提供的方案,检测从受损细胞中释放的LDH。简单地说,在药物处理后的指定时间点,收集细胞,250 g离心10分钟,然后将100 μL上清小心地转移到光学透明的96孔板的相应孔中。每孔加入100 μL反应液,室温孵育30 min(避光)。500 nm处的吸光度用微滴板阅读器测量。自动减去背景信号后计算细胞毒性百分比。结果以对照组的百分比表示。
Western Blotting分析[2]
20微克蛋白质与5倍上样缓冲液(0.313 M Tris-HCl (pH 6.8), 25°C, 10% SDS, 0.05%溴酚蓝,50%甘油)和20倍还原剂(2 M DTT)混合煮沸5分钟,上样于7.5% SDS -聚丙烯酰胺电泳凝胶上。电泳后,蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜用5%脱脂乳饱和,用一抗(β-actin: 1:10 000, phospho-PKC: 1:10 000, phospho-MARCKS: 1:10 000, phospho-Akt: 1:10 000, phospho-MAPK: 1:10 000, phospho-MAPK: 1:10 000, caspase-3: 1:10 000)在4℃下孵育过夜。在tris-buffered saline (TBS)中温和搅拌洗涤30分钟后,将膜与辣根过氧化物酶偶联抗小鼠/兔IgG二抗在脱脂乳中室温孵育1小时。使用ECL Western Blotting检测试剂盒开发信号。
夹心ELISA [2]
采用夹心ELISA法检测磷酸化Akt、Akt和cleaved caspase-3的活性。简单地说,在药物治疗后,收集细胞并用裂解缓冲液处理。超声和离心后,上清液转移到新的微管中,在- 70°C保存以备将来使用。检测前,将样品在- 160°C冻干20 h,并在样品缓冲液中重悬。然后按照生产商的说明书添加检测抗体、二抗和底物。在450 nm处用微滴板阅读器测定信号,结果以对照组的百分比表示。
动物实验
增生研究[1]
小鼠在治疗开始时为7周龄,处于毛发生长周期的休止期。化合物溶解于0.2 mL丙酮中,分别每周涂抹一次或两次,共涂抹四次。每个剂量组治疗两只动物,最后一次涂抹后72小时处死动物。从每只动物身上取两块处理过的皮肤,用中性缓冲福尔马林固定,并用苏木精-伊红染色进行组织学分析(切片染色由美国马里兰州盖瑟斯堡的American Histolabs公司完成)。使用TPA(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)和美泽瑞因。
参考文献

[1]. New amide-bearing benzolactam-based protein kinase C modulators induce enhanced secretion of the amyloid precursor protein metabolite sAPPalpha. J Med Chem. 2003 Jan 30;46(3):364-73.

[2]. Neuroprotective effects of new protein kinase C activator TPPB against Aβ25-35 induced neurotoxicity in PC12 cells. Neurochem Res. 2012 Oct;37(10):2213-21.

其他信息
蛋白激酶C (PKC) 参与淀粉样前体蛋白 (APP) 的加工。β-分泌酶和γ-分泌酶对APP的异常加工会导致39-43个氨基酸的Aβ片段的产生,该片段具有神经毒性,并被认为在阿尔茨海默病的发病机制中起着重要作用。PKC激活可增强α-分泌酶的活性,从而减少β-分泌酶的淀粉样蛋白生成产物。本文描述了10种新型苯并内酰胺V8基PKC激活剂的合成,这些激活剂的侧链具有不同的饱和度和亲脂性,并通过酰胺基团连接到芳香环上。测得的佛波酯与PKCα结合的抑制Ki值在纳摩尔范围内,并且与它们的亲脂性具有一定的相关性。在合成的10种苯并内酰胺类化合物中,化合物5g和5h表现出最佳的结合亲和力。利用源自阿尔茨海默病患者的细胞系,大多数研究化合物在1 μM浓度下即可显著增强sAPPα的分泌,而化合物5e(TPPB)和5f在0.1 μM浓度下即可达到此效果。在1 μM浓度下,化合物5c-h对sAPPα分泌的增强作用高于对照化合物8-(1-癸炔基)苯并内酰胺(BL)。值得注意的是,高亲脂性配体5i(Ki为11 nM)未表现出活性。另一方面,其饱和类似物5j(具有相近的Ki和ClogP值)在分泌酶测定中仍保持活性。在增生研究中,化合物 5f 在 100 μg 剂量下显示出适度的反应,化合物 5e 在 300 μg 剂量下也显示出适度的反应,这表明 5f 的效力比 PKC 激活剂 mezerein 低约 30 倍,比 TPA 低约 100 倍。化合物 5e 的活性比 5f 低约 3 倍。基于其他强效 PKC 配体的不饱和效应,我们预测化合物 5e 在大多数检测中将保持生物活性,但其促肿瘤活性会显著降低。因此,化合物 5e 成为寻找能够调节淀粉样蛋白加工的阿尔茨海默病治疗药物的可行候选化合物。[1]
鉴于目前的研究结果,我们认为像 5e (TPPB) 这样能够增强 sAPPα 分泌的化合物值得进一步研究,作为治疗阿尔茨海默病的潜在药物。此类化合物可单独使用,也可与β-分泌酶抑制剂联合使用,以减少神经毒性β-淀粉样蛋白肽的形成,从而延缓疾病进展[1]。阿尔茨海默病(AD)的病理特征是海马体中存在老年斑,这些老年斑主要由一种称为β-淀粉样蛋白(Aβ)的多肽在细胞外沉积组成。大量研究表明,正是这种Aβ肽的沉积和聚集导致神经元功能障碍,最终发展为痴呆。降低Aβ沉积或减轻其神经毒性一直是AD治疗的目标之一[2]。本文的实验结果表明,新型PKC激活剂TPPB能够保护PC12细胞免受Aβ25-35的损伤,这已通过细胞活力检测和形态学变化得到证实。 TPPB 可纠正 Aβ25–35 引起的 Akt、PKC、MARCKS 和 MAPK 磷酸化减弱,并通过 PKC 介导的信号通路抑制 Aβ 诱导的 caspase-3 活化。其他 PKC 激动剂(如 PMA)激活 PKC 已被证实可增加 sAPPα 的释放并减少 Aβ 肽的分泌。但 PMA 的致癌性限制了其临床应用。其他 PKC 激动剂(如 bryostatin 1 和甲基偶氮甲醇乙酸酯)均可增加 sAPPα 的释放,但它们激活 α-分泌酶的确切机制尚不清楚。TPPB 可通过增加 α-分泌酶活性和减少 Aβ 分泌来调节 APP 加工;本研究数据表明,TPPB 可抑制 Aβ25–35 诱导的神经毒性。考虑到 sAPPα 和 Aβ 的不同作用以及上述激酶在 AD 病理生理学中可能发挥的神经保护作用,我们推测 TPPB 可能具有治疗 AD 的潜力,但还需要进一步研究。[2]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C27H30N3O3F3
分子量
501.5406
精确质量
501.223
元素分析
C, 64.66; H, 6.03; F, 11.36; N, 8.38; O, 9.57
CAS号
497259-23-1
PubChem CID
9935767
外观&性状
Light yellow to yellow solid powder
密度
1.2±0.1 g/cm3
沸点
728.8±60.0 °C at 760 mmHg
闪点
394.6±32.9 °C
蒸汽压
0.0±2.5 mmHg at 25°C
折射率
1.572
LogP
3.09
tPSA
85.16
氢键供体(HBD)数目
3
氢键受体(HBA)数目
7
可旋转键数目(RBC)
6
重原子数目
36
分子复杂度/Complexity
806
定义原子立体中心数目
2
SMILES
CC(C)[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=C(N1C)C=CC(=C2)NC(=O)/C=C/C=C/C3=CC=C(C=C3)C(F)(F)F)CO
InChi Key
WOLVEMPZUIFSII-IHHOKICGSA-N
InChi Code
InChI=1S/C27H30F3N3O3/c1-17(2)25-26(36)32-22(16-34)15-19-14-21(12-13-23(19)33(25)3)31-24(35)7-5-4-6-18-8-10-20(11-9-18)27(28,29)30/h4-14,17,22,25,34H,15-16H2,1-3H3,(H,31,35)(H,32,36)/b6-4+,7-5+/t22-,25-/m0/s1
化学名
(2E,4E)-N-[(2S,5S)-5-(hydroxymethyl)-1-methyl-3-oxo-2-propan-2-yl-2,4,5,6-tetrahydro-1,4-benzodiazocin-8-yl]-5-[4-(trifluoromethyl)phenyl]penta-2,4-dienamide
别名
tppb; 497259-23-1; alpha-APP Modulator; (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(Trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam; CHEMBL331344; (2E,4E)-N-((2S,5S)-5-(hydroxymethyl)-2-isopropyl-1-methyl-3-oxo-1,2,3,4,5,6-hexahydrobenzo[e][1,4]diazocin-8-yl)-5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)penta-2,4-dienamide; (2E,4E)-N-[(2S,5S)-5-(hydroxymethyl)-1-methyl-3-oxo-2-propan-2-yl-2,4,5,6-tetrahydro-1,4-benzodiazocin-8-yl]-5-[4-(trifluoromethyl)phenyl]penta-2,4-dienamide; PKC Activator V;
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO : ~125 mg/mL (~249.23 mM)
溶解度 (体内实验)
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (4.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液。
例如,若需制备1 mL的工作液,可将100 μL 22.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中,混匀;再向上述溶液中加入50 μL Tween-80,混匀;然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备:将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中,得到澄清溶液。

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (4.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加,逐一添加), 澄清溶液。
例如,若需制备1 mL的工作液,可将 100 μL 22.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案:
1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL;

3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用!
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 1.9939 mL 9.9693 mL 19.9386 mL
5 mM 0.3988 mL 1.9939 mL 3.9877 mL
10 mM 0.1994 mL 0.9969 mL 1.9939 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);

4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。

计算器

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度,具体如下:

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示:
假如化合物的分子量为350.26 g/mol,在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少?
  • 在分子量(MW)框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在“体积”框中输入5,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式,您可以计算体积和浓度。

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如,可以输入C1、C2和V2来计算V1,具体如下:

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液?
使用方程式C1V1=C2V2,其中C1=10mM,C2=25μM,V2=25 ml,V1未知:
  • 在C1框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在C2框中输入25,然后选择正确的单位(μM)
  • 在V2框中输入25,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL(0.1 ml)出现在V1框中
g/mol

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成,具体如下:

注:化学分子式大小写敏感:C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量(分子量)的说明:
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量),请输入化学/分子式,然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义:
  • 分子质量(或分子量)是一种物质的一个分子的质量,用统一的原子质量单位(u)表示。(1u等于碳-12中一个原子质量的1/12)
  • 摩尔质量(摩尔重量)是一摩尔物质的质量,以g/mol表示。
/

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器(澄清溶液)
第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量)
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶/难溶于水的化合物),不同的产品和批次配方组成不同,如对配方有疑问,可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外,请注意这只是一个配方计算器,而不是特定产品的确切配方。
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计算结果:

工作液浓度 mg/mL;

DMSO母液配制方法 mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。

体内配方配制方法μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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