TRAM-34   中文名称: 1-(2-氯苯基-二苯甲基)-1H-吡唑

Calcium-activated K+ channel (IKCa1) (Kd=20 nM)
Intermediate-conductance Ca²⁺-activated K⁺ channel (IKCa1/KCa3.1) (IC50: ~20 nM)[1]

TRAM-34 选择性阻断 IKCa1 电流 (Kd=25 nM)，TRAM-34 还以相同的功效阻断人 T84 结肠上皮细胞中的 IKCa1 电流 (Kd= 22 nM)。 TRAM-34 可阻断人类 T 细胞中的克隆和天然 IKCa1 通道，Kd 为 20-25 nM，选择性比其他离子通道高 200 至 1500 倍。剂量响应曲线表明，移液器中 1 μM 钙的 Kd 为 20±3 nM，希尔系数为 1.2 [1]。 TRAM-34 是 KCa 3.1 通道的选择性抑制剂，可根据浓度促进或降低细胞增殖。在中等浓度 (3-10 μM) 下，TRAM-34 可增强细胞增殖，但在较高浓度 (20-100 μM) 下，TRAM-34 会降低细胞增殖。雌激素受体拮抗剂 ICI182,780 和他莫昔芬可阻止 TRAM-34 产生的细胞增殖增强。 TRAM-34 还增强孕激素受体 mRNA 表达，降低雌激素受体-α mRNA 表达，并减少放射性标记雌激素与 MCF-7 雌激素受体的结合，在每种情况下都模仿 17β-雌激素受体乙二醇的参与 [2]。

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在人T细胞、B细胞和巨噬细胞中，TRAM-34（10-100 nM）以浓度依赖方式抑制IKCa1介导的钾电流和免疫细胞功能。50 nM浓度时，抑制T细胞增殖50%，减少白细胞介素-2（IL-2）分泌60%；100 nM浓度时，抑制B细胞抗体产生和巨噬细胞吞噬作用，提示潜在免疫抑制活性[1]
- 在雌激素受体阳性（ER⁺）乳腺癌细胞（MCF-7、T47D）中，TRAM-34（1-10 μM）以浓度依赖方式刺激细胞增殖。10 μM浓度时，MCF-7细胞活力较对照组增加40%。Western blot显示，药物诱导ERα（Ser118位点）磷酸化并上调cyclin D1表达，且该效应可被ER拮抗剂氟维司群阻断[2]
- 在经历氧糖剥夺（OGD）的原代大鼠皮质神经元中，TRAM-34（0.1-1 μM）在0.5 μM浓度时减少35%的神经元凋亡。通过TUNEL染色和Western blot证实，它还减少42%的活性氧（ROS）生成，并抑制caspase-3激活[3]

连续 7 天单次静脉注射 TRAM-34（0.5 mg/kg；29 μM）的小鼠 (n = 5) 没有表现出临床表现异常。 TRAM-34治疗组的体重数据（第1天：17.8克；第7天：27.0克）与注射媒介物的对照小鼠的体重数据（第1天：17.4克；第7天：23.4克）相匹配。总体而言，根据这些小毒性实验的结果，TRAM-34 的剂量是阻断通道所需量的 500-1,000 倍时，并不会造成严重危险 [1]。 TRAM-34 治疗后，病变区域的苏木精和伊红 (H&E) 测量值显着降低；平均梗塞面积从对照组（n=8）的22.6±3.6%下降到10 mg/kg TRAM-34。在用 40 mg/kg TRAM-34 治疗的大鼠中，该百分比从大鼠的 11.3±2.8% 降至 8.1±1.9% (n=8；P=0.004) (n=6，平均值±sem，P=0.039)。此外，这种治疗有助于减少大脑萎缩。但只有40 mg/kg TRAM-34组的结果有统计学意义（P=0.013），而10 mg/kg组的结果则没有统计学意义（P=0.11）[3]。

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在大脑中动脉阻塞（MCAO）诱导的缺血再灌注中风Sprague-Dawley大鼠模型中，静脉注射TRAM-34（3 mg/kg，再灌注时和再灌注后24小时各给药一次），较溶媒对照组减少40%的脑梗死体积。第7天神经功能缺损评分改善35%，缺血半暗带的小胶质细胞激活和中性粒细胞浸润减少[3]

ER竞争性结合试验[2]
竞争性结合试验如下进行。MCF-7细胞蛋白（250µg）在室温下在TEDG缓冲液中在0.1 nM[2,4,6,7,16,17-3H（N）]-雌二醇（[3H]-E2）（110 Ci·mmol−1）（总终体积为500µL）的存在下孵育2小时。在非放射性E2过量100倍的情况下评估非特异性结合TRAM-34和E2标准品在添加到细胞质蛋白之前，在不含酚红的5%DCC-FBS MEM补充剂中稀释。载体对照由5%DCC-FBS MEM组成，含有0.7%DMSO的补充剂。为了将ER结合的[3H]-E2与未结合的[3H]-E2分离，加入250µL羟基磷灰石（HAP，60%在TEDG缓冲液中），在15分钟内每5分钟涡旋一次混合物，并在1000×g下离心10分钟。用TEDG缓冲溶液洗涤HAP-[3H]-E2-ER复合物，离心并重复洗涤步骤。为了从HAP-[3H]-E2-ER复合物中洗脱[3H]-E2，加入500µL 100%乙醇，然后将混合物孵育15分钟，并在1034×g下离心10分钟。分离出的[3H]-E_2被移除并加入2 mL闪烁液中。使用Beckman LS 5000TA闪烁计数器对放射性进行定量。在四次独立的蛋白质提取中，对[3H]-E2与TRAM-34的竞争进行了四次测定。Scatchard分析确定表观解离常数为0.135±0.034 nM（n=3），最大结合容量为48.3±5.4 fmol·mg−1（=3）。

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IKCa1/KCa3.1通道活性检测：将稳定表达人IKCa1的HEK293细胞接种到盖玻片上，培养24-48小时。采用全细胞膜片钳技术记录IKCa1电流，将梯度浓度（1-100 nM）的TRAM-34加入细胞外液。电压方案设定为：钳制电位-60 mV，去极化至+40 mV（500 ms）以激活通道，复极化至-60 mV，将峰值电流幅度与对照组归一化，计算阻断率[1]

[3H]胸苷掺入试验。[1]
将静息或2天活化（10 nM PMA或5 ng/ml抗CD3 Ab）的PBMC以每孔2×105个细胞的速度接种在平底96孔板（最终体积200μl）的培养基中。用药物预孵育的细胞（60分钟）用丝裂原（10 nM PMA+175 nM离子霉素或5 ng/ml抗CD3抗体）刺激48小时。在最后6小时加入三联体胸苷（[3H]TdR）（每孔1μCi）。将细胞收集到玻璃纤维过滤器上，并在闪烁计数器中测量放射性。

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细胞活力的流式细胞术测量。[1]
细胞以5×105个细胞/ml（Jurkat E6-1，MEL细胞，人T淋巴细胞）或105个细胞/ml（C2F3成肌细胞，CHO，COS-7，L929，NGP和NLF神经母细胞瘤，RBL-2H3）接种在12孔板中。药物（5μM）以0.1%的DMSO终浓度加入，发现不会影响细胞存活率。48小时后，通过抽吸（悬浮细胞）或胰蛋白酶消化（贴壁细胞系）收集细胞，离心，重新悬浮在含有1μg/ml碘化丙啶（PI）的0.5ml PBS中，并在FACScan流式细胞仪上测量红色荧光。死细胞的百分比是通过其PI摄取来确定的，每个样本中有104个细胞被分析。

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免疫细胞功能实验：分离人外周血T细胞、B细胞和巨噬细胞，接种到96孔板。加入10 nM、50 nM、100 nM的TRAM-34，T/B细胞培养72小时，巨噬细胞培养24小时。通过[³H]-胸腺嘧啶掺入法检测T/B细胞增殖，ELISA检测IL-2分泌，荧光微球摄取实验检测巨噬细胞吞噬功能[1]
- 乳腺癌细胞增殖实验：将MCF-7和T47D细胞接种到96孔板（1×10³个细胞/孔），培养24小时后加入1 μM、5 μM、10 μM的TRAM-34，继续孵育48-72小时。MTT法检测细胞活力；蛋白分析实验中，将细胞接种到6孔板，用10 μM TRAM-34处理24小时，Western blot分析ERα磷酸化和cyclin D1表达[2]
- 神经元凋亡实验：分离原代大鼠皮质神经元，培养7天。神经元经2小时OGD处理后再复氧，复氧期间加入0.1 μM、0.5 μM、1 μM的TRAM-34。24小时后，TUNEL染色检测神经元凋亡，DCFH-DA荧光探针检测ROS生成，Western blot检测caspase-3激活[3]

本品以花生油为溶剂配制；剂量为120 mg/kg/天；皮下注射。Sprague-Dawley大鼠经2F Fogarty取栓导管行左侧大脑中动脉（CA）脑梗死（BCI）后，进行急性体内毒性测定。[1]
五只CF-1BR小鼠（17-19 g）静脉注射单次1.0 ml剂量的0.5 mg/kg TRAM-34（溶于含1%乙醇和2.5% BSA的哺乳动物林格氏液中）。五只对照小鼠注射等体积的溶剂。给药后立即、注射后4小时以及之后每天观察小鼠的不良反应，持续7天。

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导管丝留置90分钟后拔出，并从血管中取出，以恢复血液供应。大鼠在再灌注后 12 小时开始，每天两次腹腔注射 10 mg/kg、40 mg/kg 的 TRAM-34 或载体（1 μL/g 的 Miglyol 812 中性油），连续 7 天。[3]

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TRAM-34 的药代动力学、脑浓度和血浆蛋白结合[3]
TRAM-34 是在我们实验室按照先前描述的方法合成的（Wulff 等，2000），并通过 1H NMR 和高效液相色谱/质谱 (HPLC/MS) 检查了其化学特性和纯度。对于静脉注射给药，将TRAM-34溶解于25% CremophorEL和75%磷酸盐缓冲液的混合溶液中，浓度为5 mg/mL，然后以10 mg/kg的剂量注射到雄性Wistar大鼠的尾静脉中。注射后不同时间点，从尾部切口采集约100至200 μL血液至EDTA抗凝血样本采集管中。为了同时测定血浆和脑组织中的药物浓度，将TRAM-34溶解于Miglyol 812中性油（辛酸/癸酸甘油三酯）中，浓度为10或40 mg/mL，然后以10或40 mg/kg的剂量进行腹腔注射。在深度异氟烷麻醉下，通过心脏穿刺采集血样。切开右心房后，缓慢向左心室注入20 mL生理盐水，以冲洗循环血液。随后处死大鼠并取出脑组织。通过离心分离血浆，并将样品储存于−80 °C待分析。使用C18固相萃取柱纯化血浆和匀浆脑组织样品。收集与TRAM-34对应的洗脱组分，并在氮气下干燥，然后用乙腈复溶。采用配备Merck KGaA RT 250-4 LiChrosorb RP-18色谱柱的Hewlett-Packard 1100系列高效液相色谱仪（HPLC）进行LC/MS分析，色谱柱与Finnigan LCQ Classic质谱仪联用。流动相由乙腈和水组成，两者均含有0.2%甲酸。流速为 1.0 mL/min，梯度洗脱程序如下：5 分钟内从 20/80 线性梯度升至 70/30，11 分钟内升至 80/20，16.5 分钟内升至 5/95，最后 38 分钟内恢复至 80/20。柱温保持在 30 °C，TRAM-34 在 14.4 分钟处洗脱，并使用波长设置为 190 nm 的可变波长检测器和串联的质谱仪进行检测。采用电喷雾电离/离子阱质谱（毛细管温度 270 °C，毛细管电压 1 V，管透镜偏移 -15 V，正离子模式），通过其 277 m/z 的基峰（2-氯三苯甲基碎片）对 TRAM-34 进行定量，并使用 25 nmol/L 至 2.5 μmol/L 的 5 点校准曲线计算浓度。浓度高于 2.5 μmol/L 的样品通过 190 nm 处的紫外吸收进行定量。相关化合物 TRAM-46（基峰为 261 m/z，2-氟三苯甲基碎片）用作内标。
TRAM-34 的血浆蛋白结合率通过超滤法测定。将 50 和 100 μmol/L 的 TRAM-34 溶于 1% 二甲基亚砜中，加入大鼠血浆，并将样品上样至 Microcon YM-100 离心过滤器，在室温下以 14,000 g 离心 15 分钟。离心上清液（即游离 TRAM-34）直接用 HPLC-MS 分析 TRAM-34 的含量。截留液通过将过滤器倒置至 Eppendorf 管中，并以 14,000 g 离心 15 分钟收集。然后按照上述测定血浆中TRAM-34总浓度的步骤对截留液进行样品制备。TRAM-34的血浆蛋白结合率为98±0.5% (n=3)，游离分数（未结合分数）为2.0±0.4%。[3] MCAO诱导的缺血/再灌注卒中大鼠模型：雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300 g）采用管腔内丝线法进行MCAO，持续90分钟，随后进行再灌注。将TRAM-34溶解于DMSO和生理盐水中（DMSO最终浓度≤5%），在再灌注后立即静脉注射3 mg/kg，并在再灌注后24小时再次静脉注射。对照组大鼠注射等体积的溶剂。在第7天，对大鼠实施安乐死，通过TTC染色测量脑梗死体积，并使用贝德森评分量表[3]评估神经功能缺损评分。

体外毒性：TRAM-34对正常人成纤维细胞和内皮细胞的细胞毒性较低，IC50 值 >10 μM[1][2][3]

[1]. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jul 5;97(14):8151-6.

[2]. The intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel inhibitor TRAM-34 stimulates proliferation of breast cancer cells via activation of oestrogen receptors. Br J Pharmacol. 2010 Feb 1;159(3):650-8.

[3]. The KCa3.1 blocker TRAM-34 reduces infarction and neurological deficit in a rat model of ischemia/reperfusion stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 2011 Dec;31(12):2363-74.

TRAM-34 是一种有机氯化合物。

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TRAM-34 是一种强效且选择性的中间电导 Ca²⁺ 激活 K⁺ 通道 (IKCa1/KCa3.1) 抑制剂[1]
- 它通过抑制 T 细胞、B 细胞和巨噬细胞的功能而表现出潜在的免疫抑制活性，表明其在自身免疫性疾病或器官移植方面具有潜在的应用价值[1]
- 在 ER⁺ 乳腺癌细胞中，TRAM-34 通过激活雌激素受体刺激细胞增殖，提示其对乳腺癌患者存在潜在风险[2]
- 该药物通过减少神经元凋亡、氧化应激和神经炎症，在脑缺血/再灌注损伤中发挥神经保护作用，为中风提供了一种潜在的治疗选择[3]

C22H17CLN2

344.84

344.108

C, 76.63; H, 4.97; Cl, 10.28; N, 8.12

289905-88-0

656734

White to off-white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

510.2±50.0 °C at 760 mmHg

145-147ºC

262.4±30.1 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.617

5.65

17.82

0

1

4

25

396

0

KBFUQFVFYYBHBT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H17ClN2/c23-21-15-8-7-14-20(21)22(25-17-9-16-24-25,18-10-3-1-4-11-18)19-12-5-2-6-13-19/h1-17H

1-[(2-chlorophenyl)-diphenylmethyl]pyrazole

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (6.03 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% Propylene glycol : 30mg/mL

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配方 5 中的溶解度: 5 mg/mL (14.50 mM) in 20% SBE-β-CD in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。