TRPM4-IN-5

TRPM4 (IC50 = 1.5 μM)

TRPM4-IN-1（化合物 5）对过度表达 TRPM4 的 HEK293 细胞中的 TRPM4 电流具有有效的选择性 [1]。在 LNCaP（癌症）细胞中，TRPM4-IN-1 可逆地增加内源 TRPM4 电流。晚上，TRPM4-IN-1 (50 μM) 恢复转录的 TRPM4 变体 A432T 的功能表达 [1]。

Na+流入筛查试验[1]
表达TRPM4的细胞以每孔30000个细胞的密度，在100μL诱导培养基（如上所述）中，以96孔黑壁透明底聚D-赖氨酸涂层板上铺板。细胞接种后，在37°C的5%CO2培养箱中孵育48小时。在试验当天，每孔用100μL的试验缓冲液[单位：140 NMDG‐Cl、10 KCl、1 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES（pH 7.2）、NMDG̾OH和290至300 mOsM]代替诱导培养基，并在室温（RT）下孵育45分钟。随后，用每孔95μL的染料负载溶液代替测定缓冲液，该溶液是在补充了0.1%普朗尼克酸F‐127（Teflabs，TX，USA）和5μM Na+敏感染料Asante Natrium Green–II（ANGII）的测定缓冲液中制备的。将细胞在室温下在黑暗中孵育45分钟。孵育后，完全排空染料负载溶液，用72μL测定缓冲液替换，在黑暗中温育20分钟，然后在FLIPR TETRA®（美国加利福尼亚州Molecular Devices）上进行荧光读数。 为了使用Na+流入试验评估TRPM4抑制剂的效果，在96孔聚苯乙烯板的试验缓冲液中制备了10个复合板。所有原料，如TRPM4-IN-5，都溶解在DMSO中。为了通过激活TRPM4引发Na+内流，在96孔聚苯乙烯板中制备了一个5倍刺激缓冲板，其中含有（以mM计）700 NaCl、4 CaCl2、4 MgCl2、40 HEPES（pH 7.2，含NaOH）以及50μM离子霉素。背景对照孔含有不含离子霉素（W/O）的刺激缓冲液。 荧光团被氩激光的488nm谱线激发。发射用540±30nm带通滤光片过滤。在加载ANGII染料的平板上以1 Hz的频率测量初始基线荧光1分钟。然后加入10×复合平板上的8μL溶液，以1 Hz为间隔监测荧光5分钟。最后，为了激活TRPM4，加入刺激缓冲平板上的20μL溶液。在加入5分钟期间和之后以0.5 Hz的间隔采集荧光。将单个测定孔的数据归一化为初始基线荧光。荧光的初始上升被测量为曲线下面积（AUC），计数使用公式{[（Ionomycin−Compound）/（Ionommycin−W/O Ionomycine）]×100}进行归一化，以绘制抑制剂命中的浓度-反应曲线。筛选实验的实验者（L.C.O.）是盲法的，在验证苗头化合物之前，不知道化合物的任何化学性质（例如TRPM4-IN-5）。这些步骤总结为工作流程，如表1所示。

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电生理学[1]
将细胞接种在35 mm聚D-赖氨酸涂层培养皿中，培养基为添加了10%FBS和1μg·mL-1四环素（Invitrogen）的诱导培养基[无酚红DMEM培养基]。细胞接种后，在37°C的5%CO2培养箱中孵育48小时。电生理记录是在内外膜片钳配置下进行的，使用DMZ通用拉拔器从1.5 mm硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出贴片移液管（1-2μm尖端开口）。将移液管尖端抛光，使其在浴液中的移液管电阻为2-4MΩ。移液管溶液含有（以mM计）150 NaCl、10 HEPES、2 CaCl2（pH 7.4，含NaOH）。浴液含有（以mM计）150 NaCl、10 HEPES、2 HEDTA（pH 7.4，含NaOH）作为无Ca2+溶液。如前所述（Zhang等人，2005），通过向含有（以mM计）150NaCl、10HEPES（pH 7.4，含NaOH）的溶液中加入适当浓度的不含Ca2+螯合剂的CaCl2来制备含有0.1至2mM Ca2+的溶液。通过改进的快速溶液交换器将不同Ca2+浓度的浴溶液施加到细胞上。DMSO储备中的抑制剂在移液管溶液中稀释至适当浓度，并应用于细胞的细胞外侧。膜电流由Clampex 10通过Digidata 1332A控制的Multiclamp 700B放大器记录。数据以5 kHz进行低通滤波，以10 kHz进行采样。实验在室温（20-25°C）下进行。对于I-V关系，使用刺激方案记录电流，该方案包括从-80至+100 mV的0 mV保持电位开始200 ms的电压阶跃，然后是-100 mV的尾电压。为了构建浓度-反应曲线，在300μM Ca2+中记录的+100 mV稳态电流被归一化为没有任何抑制剂的电流。对于使用TRPM4-IN-5的救援实验，在进行膜片钳记录之前，将培养基替换为不添加任何抑制剂的浴液。

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： HEK293 细胞
测试浓度： 50 μM
孵育时间：
孵育持续时间：过夜
实验结果：部分挽救 A432T 的总表达和表面表达。

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复合细胞毒性试验[1]
在RAW 264.7和HeLa细胞中研究了化合物4、5（TRPM4-IN-5）和6的细胞毒性，以确定其抗增殖作用。将细胞以每孔2000个细胞的速度接种在96孔板上的100μL培养基中。孵育过夜后，加入不同浓度的化合物，并在37°C下与溶剂对照一起孵育72小时。之后，将细胞与MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑，终浓度0.5 mg·mL-1）在37°C下孵育4小时，并用DMSO溶解。在550nm（吸光度）下测量平板，计算并绘制与细胞存活/增殖相关的IC50值。紫杉醇用作阳性对照。实验在至少三个独立的实验中进行，每个实验一式三份。

[1]. Identification of potent and selective small molecule inhibitors of the cation channel TRPM4. Br J Pharmacol. 2018 Jun; 175(12): 2504–2519.

[2]. Optimizing TRPM4 inhibitors in the MHFP6 chemical space. Eur J Med Chem. 2019 Mar 15;166:167-177.

背景与目的：TRPM4是一种钙激活的非选择性阳离子通道，在多种组织中表达，并与多种疾病相关。由于缺乏高效且选择性强的抑制剂，TRPM4尚未被证实为治疗靶点。我们旨在通过结合计算机模拟和细胞筛选方法，发现一系列新型小分子抑制剂，使其具有亚微摩尔级的活性，并比已报道的TRPM4抑制剂具有更高的选择性。实验方法：我们开发了一种高通量筛选兼容的检测方法，利用钠离子敏感染料记录细胞中TRPM4介导的钠离子内流。我们利用该方法筛选了一组化合物，这些化合物是通过基于配体的虚拟筛选获得的，筛选过程中使用了已知的弱活性和非选择性TRPM4抑制剂作为种子分子。我们使用常规电生理方法在过表达TRPM4的HEK293细胞和内源性表达TRPM4的前列腺癌细胞系LNCaP中验证了这些先导化合物的活性和选择性。本研究利用蛋白质印迹法和电生理实验研究了化合物 5 的化学伴侣特性。主要结果：我们鉴定出一系列卤代邻氨基苯甲酰胺类化合物，它们具有亚微摩尔级的抑制活性和良好的选择性，能够抑制 TRPM4 蛋白。此外，我们首次证明，本研究中发现的最有前景的化合物 5 能够挽救一种天然存在的 TRPM4 变体（该变体表现出表达和功能缺失）。结论和意义：化合物 5 的发现——一种高效且选择性的 TRPM4 抑制剂，并具有额外的化学伴侣特性——为研究 TRPM4 在人类疾病中的作用以及开发临床候选药物提供了新的契机。[1]

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我们近期报道了 4-氯-2-(2-氯苯氧基)乙酰胺基)苯甲酸 (CBA) 是首个高效 TRPM4 抑制剂，TRPM4 是一种与心脏疾病和前列腺癌相关的阳离子通道。本文报道了 CBA 的构效关系 (SAR) 研究，并由此获得了两种新的高效类似物。为了设计和解释我们的构效关系（SAR），我们使用了交互式彩色编码的三维图，这些图展示了使用MHFP6（最多六个键的MinHash指纹）计算的化合物之间的相似性。MHFP6是一种新型分子指纹，在虚拟筛选研究的基准测试中优于其他指纹。我们通过可视化基准测试集中活性化合物与诱饵分子和药物的结构多样性，进一步说明了我们方法的普适性。MHFP6化学空间三维图可能对构效关系研究的设计、解释和结果交流具有普遍的帮助。改进后的WebMolCS可通过http://gdb.unibe.ch访问，其代码可在https://github.com/reymond-group/webMolCS获取，供离线使用。[2]

C15H11CL2NO4

340.16

339.006

C, 52.97; H, 3.26; Cl, 20.84; N, 4.12; O, 18.81

351424-20-9

2264067

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

576.4±50.0 °C at 760 mmHg

302.4±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.656

4.95

75.6

2

4

5

22

407

0

C1=CC=C(C(=C1)OCC(=O)NC2=C(C=CC(=C2)Cl)C(=O)O)Cl

CVQCJPCMPGKEDH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H11Cl2NO4/c16-9-5-6-10(15(20)21)12(7-9)18-14(19)8-22-13-4-2-1-3-11(13)17/h1-7H,8H2,(H,18,19)(H,20,21)

4-chloro-2-[[2-(2-chlorophenoxy)acetyl]amino]benzoic acid

TRPM4IN-5; TRPM4 IN5; TRPM4-IN-1; 4-chloro-2-[[2-(2-chlorophenoxy)acetyl]amino]benzoic acid; CBA; TRPM4-IN-5; CHEMBL4525597; 4-Chloro-2-(2-(2-chlorophenoxy)acetamido)benzoic acid; 4-chloro-2-{[(2-chlorophenoxy)acetyl]amino}benzoic acid; TRPM4-IN-5

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~244.97 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.11 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。