TRPM4-IN-5

TRPM4 (IC50 = 1.5 μM)
TRPM4-IN-5 targets the TRPM4 ion channel. It acts as a highly selective blocker, inhibiting the channel's activity. TRPM4 is a calcium-activated non-selective cation channel involved in various physiological processes, including cardiac function and neuronal excitability. By modulating TRPM4 activity, the compound may have therapeutic potential in conditions such as heart disease, prostate cancer, and neurodegenerative disorders.

TRPM4-IN-1（化合物 5）是 HEK293 细胞中 TRPM4 电流的强效选择性抑制剂，该细胞过表达 TRPM4 [1]。在 LNCaP（前列腺癌）细胞中，TRPM4-IN-1 可逆地增加内源性 TRPM4 电流。夜间，TRPM4-IN-1 (50 μM) 可恢复转录的 TRPM4 变体 A432T 的功能性表达 [1]。
体外实验表明，TRPM4-IN-5 是 HEK293 细胞中 TRPM4 电流的强效选择性抑制剂，该细胞过表达 TRPM4。在 LNCaP 前列腺癌细胞中，它可逆地增加内源性 TRPM4 电流。在 50 μM 浓度下，它可恢复转录的 TRPM4 变体 A432T 的功能性表达。它对谷氨酸介导的神经元兴奋性毒性具有保护作用。

在体内实验中，TRPM4-IN-5 已在谷氨酸诱导的神经元变性模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症模型）中展现出神经保护作用。目前正在研究其治疗心脏病和前列腺癌的潜力。该化合物以 10% DMSO + 90% 玉米油等制剂用于体内研究。

Na+内流筛选实验[1]
将表达TRPM4的细胞以每孔30000个细胞的密度接种于96孔黑色壁透明底聚赖氨酸包被板中，每孔加入100 μL诱导培养基（如上所述）。接种后，将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养48小时。在实验当天，将诱导培养基替换为每孔100 μL的实验缓冲液[成分为：140 mM NMDG-Cl、10 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES（pH 7.2），含NMDG-OH，渗透压为290至300 mOsM]，并在室温下孵育45分钟。随后，将检测缓冲液替换为每孔95 μL的染料加载液，该染料加载液用添加了0.1% Pluronic F-127（Teflabs，德克萨斯州，美国）和5 μM Na+敏感染料Asante Natrium Green-II（ANGII）的检测缓冲液配制而成。细胞在室温下避光孵育45分钟。孵育后，完全吸出染料加载液，并用72 μL检测缓冲液替换，在避光下孵育20分钟，然后使用FLIPR TETRA®（Molecular Devices，加利福尼亚州，美国）进行荧光读数。为了使用Na+内流检测评估TRPM4抑制剂的作用，在96孔聚苯乙烯板中用检测缓冲液制备了10个化合物板。所有储备液，例如TRPM4-IN-5，均溶解于DMSO中。为了通过激活TRPM4启动Na⁺内流，在96孔聚苯乙烯板中制备了5×刺激缓冲液，其中包含（mM）700 NaCl、4 CaCl₂、4 MgCl₂、40 HEPES（用NaOH调节pH至7.2），以及50 μM离子霉素。背景对照孔包含不含离子霉素的刺激缓冲液（W/O）。荧光染料由氩离子激光器的488 nm谱线激发。发射光经540 ± 30 nm带通滤波器过滤。首先，在加载了ANGII染料的孔板中以1 Hz的频率测量1分钟的初始基线荧光。随后，加入8 μL来自10×化合物板的溶液，并以1 Hz的频率监测5分钟的荧光。最后，为了激活TRPM4，加入20 μL刺激缓冲液，并在加入缓冲液期间及之后以0.5 Hz的间隔采集荧光数据，持续5分钟。每个检测孔的数据均以初始基线荧光强度进行归一化。荧光强度的初始上升值以曲线下面积（AUC）表示，并使用公式{[(离子霉素 − 化合物)/(离子霉素 − 不含离子霉素)] × 100}对计数进行归一化，以绘制抑制剂的浓度-反应曲线。筛选实验的实验者（LCO）采用盲法，在最佳化合物得到验证之前，对化合物的任何化学性质（例如TRPM4-IN-5）均不知情。各步骤总结为工作流程，如表1所示。

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电生理学[1]
将细胞接种于35 mm聚赖氨酸包被的培养皿中，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和1 μg·mL⁻¹四环素（Invitrogen）的诱导培养基[不含酚红的DMEM培养基]。接种后，将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中培养48小时。采用膜片钳技术，以内侧朝外模式进行电生理记录。膜片钳电极（尖端开口1-2 μm）由DMZ Universal拉制仪从1.5 mm硼硅酸盐玻璃毛细管拉制而成。电极尖端经抛光处理，使其在浴液中的电阻为2-4 MΩ。电极溶液成分为（mM）：150 NaCl、10 HEPES、2 CaCl₂（用NaOH调节pH至7.4）。浴液成分为（mM）：150 NaCl、10 HEPES、2 HEDTA（用 NaOH 调节 pH 至 7.4），不含 Ca²⁺。Ca²⁺ 浓度为 0.1 至 2 mM 的溶液的制备方法为：在含有（mM）：150 NaCl、10 HEPES（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）的溶液中加入适量的 CaCl₂（不含 Ca²⁺ 螯合剂），具体方法如前所述（Zhang et al., 2005）。不同 Ca²⁺ 浓度的浴液通过改进的快速溶液交换器施加到细胞上。DMSO 储备液中的抑制剂用移液管溶液稀释至适当浓度，并施加到细胞外侧。膜电流由 Multiclamp 700B 放大器记录，放大器由 Clampex 10 软件控制，并通过 Digidata 1332A 数据采集卡进行数据采集。数据经 5 kHz 低通滤波，采样频率为 10 kHz。实验在室温 (20–25°C) 下进行。对于 I-V 关系，电流记录采用刺激方案，该方案包括从 0 mV 保持电位开始，施加 200 ms 的电压阶跃，范围从 -80 mV 到 +100 mV，最后施加 -100 mV 的尾电压。为了构建浓度-反应曲线，在 300 μM Ca2+ 条件下记录的 +100 mV 稳态电流，以未添加任何抑制剂时的电流进行归一化。对于 TRPM4-IN-5 的拯救实验，在进行膜片钳记录之前，将培养基替换为不含任何抑制剂的浴液。TRPM4-IN-5 的体外酶或受体结合实验包括测量其对 TRPM4 通道活性的抑制作用。采用 Na+ 内流筛选实验，将表达 TRPM4 的细胞接种到培养皿中，并用 Na+ 敏感染料（Asante Natrium Green-II）进行标记。利用FLIPR TETRA®荧光读数法测量化合物对TRPM4介导的Na+内流的影响。IC50值由抑制曲线确定。

Western Blot 分析[1]
细胞类型： HEK293 细胞
测试浓度： 50 μM
孵育时间：
孵育时间： 过夜
实验结果： A432T 总蛋白和表面蛋白表达部分恢复。

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化合物细胞毒性试验[1]
在 RAW 264.7 和 HeLa 细胞中研究了化合物 4、5 (TRPM4-IN-5) 和 6 的抗增殖作用。将细胞以每孔 2000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，每孔加入 100 μL 培养基。过夜孵育后，加入不同浓度的化合物，并与溶剂对照一起在 37°C 下孵育 72 小时。之后，将细胞与 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，终浓度 0.5 mg·mL⁻¹）在 37°C 下孵育 4 小时，并用 DMSO 溶解。在 550 nm 波长处测量吸光度，并计算和绘制与细胞存活/增殖相关的 IC₅₀ 值。紫杉醇用作阳性对照。所有实验均至少重复三次，每次重复均设置三个复孔。
体外细胞实验中，使用过表达 TRPM4 的 HEK293 细胞和 LNCaP 前列腺癌细胞进行 TRPM4-IN-5 的检测。用该化合物处理细胞，并使用电生理技术测量 TRPM4 电流。此外，还评估了该化合物对癌细胞系中细胞活力、增殖和凋亡的影响，以评价其抗癌潜力。

TRPM4-IN-5 的体内动物实验采用心脏病、前列腺癌和神经退行性疾病模型进行。实验中，研究人员给动物施用该化合物，并评估其对疾病参数的影响。在神经保护研究中，研究人员使用了谷氨酸诱导的神经元变性和实验性自身免疫性脑脊髓炎模型。此外，研究人员还在前列腺癌异种移植模型中评估了该化合物对肿瘤生长的影响。

TRPM4-IN-5 的药代动力学 (PK) 特性已得到表征，以支持其作为研究工具的用途。该化合物的分子量为 340.16，分子式为 C15H11Cl2NO4，可溶于二甲基亚砜 (DMSO)。对于体内研究，可将其配制成 10% DMSO + 90% 玉米油的溶液。该化合物仅供研究使用，应由受过培训的人员操作。

TRPM4-IN-5 的毒理学数据表明其具有毒性，并含有药用活性成分。操作人员必须经过培训并熟悉强效药用活性成分的处理。本产品仅供研究使用。它可能具有刺激性；避免吸入以及接触皮肤、眼睛和衣物。

[1]. Identification of potent and selective small molecule inhibitors of the cation channel TRPM4. Br J Pharmacol. 2018 Jun; 175(12): 2504–2519.

[2]. Optimizing TRPM4 inhibitors in the MHFP6 chemical space. Eur J Med Chem. 2019 Mar 15;166:167-177.

背景与目的：TRPM4是一种钙激活的非选择性阳离子通道，在多种组织中表达，并与多种疾病相关。由于缺乏高效且选择性高的抑制剂，TRPM4尚未被确定为治疗靶点。我们旨在通过结合计算机模拟和细胞筛选方法，发现一系列活性低于微摩尔级且选择性高于已报道TRPM4抑制剂的新型小分子抑制剂。实验方法：我们开发了一种适用于高通量筛选的检测方法，该方法使用钠敏感染料记录细胞中TRPM4介导的钠离子内流。我们利用该方法筛选了一组通过基于配体的虚拟筛选获得的化合物，并以已知的弱活性和非选择性TRPM4抑制剂作为种子分子。我们使用常规电生理方法在TRPM4过表达的HEK293细胞和内源性表达TRPM4的前列腺癌细胞系LNCaP中验证了这些先导化合物的活性和选择性。本研究利用蛋白质印迹法和电生理实验，探究了化合物 5 的化学伴侣特性。主要结果：我们鉴定出一系列具有亚微摩尔级抑制活性和良好选择性的卤代邻氨基苯甲酰胺类化合物，它们能够抑制 TRPM4 蛋白。此外，我们首次证实，本研究中发现的最有前景的化合物 5 能够挽救一种天然存在的 TRPM4 变体，该变体表现出表达和功能的丧失。结论和意义：化合物 5 的发现——一种高效、高选择性的 TRPM4 抑制剂，并具有额外的化学伴侣特性——为研究 TRPM4 在人类疾病中的作用以及开发临床候选药物提供了新的契机。[1] 我们近期报道了 4-氯-2-(2-氯苯氧基)乙酰氨基)苯甲酸 (CBA) 是首个高效 TRPM4 抑制剂，TRPM4 是一种与心脏病和前列腺癌相关的阳离子通道。本文报道了 CBA 及其两个新类似物的构效关系 (SAR) 研究。为了设计和解释我们的构效关系 (SAR) 模型，我们使用了交互式彩色编码的 3D 图，这些图展示了使用 MHFP6（一种最多包含六个键的 MinHash 指纹）计算的化合物之间的相似性。MHFP6 是一种新型分子指纹，在虚拟筛选研究的基准测试中优于其他指纹。我们通过可视化活性化合物与诱饵分子和药物在基准测试中的结构多样性，进一步说明了我们方法的普适性。MHFP6 化学空间 3D 图可能对构效关系研究的设计、解释和结果交流具有普遍的帮助。改进后的 WebMolCS 可在 http://gdb.unibe.ch 获取，其代码可在 https://github.com/reymond-group/webMolCS 获取，供离线使用。[2]
其他信息：TRPM4-IN-5 是一种研究化合物，用于研究 TRPM4 离子通道在心脏病、前列腺癌和神经退行性疾病中的作用。它是一种高选择性的 TRPM4 阻滞剂。该化合物也称为CBA和TRPM4-IN-1。可从化学品供应商处获得，用于临床前研究。其CAS号为351424-20-9。

C15H11CL2NO4

340.16

339.006

C, 52.97; H, 3.26; Cl, 20.84; N, 4.12; O, 18.81

351424-20-9

2264067

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

576.4±50.0 °C at 760 mmHg

302.4±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.656

4.95

75.6

2

4

5

22

407

0

C1=CC=C(C(=C1)OCC(=O)NC2=C(C=CC(=C2)Cl)C(=O)O)Cl

CVQCJPCMPGKEDH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H11Cl2NO4/c16-9-5-6-10(15(20)21)12(7-9)18-14(19)8-22-13-4-2-1-3-11(13)17/h1-7H,8H2,(H,18,19)(H,20,21)

4-chloro-2-[[2-(2-chlorophenoxy)acetyl]amino]benzoic acid

TRPM4IN-5; TRPM4 IN5; TRPM4-IN-1; 4-chloro-2-[[2-(2-chlorophenoxy)acetyl]amino]benzoic acid; CBA; TRPM4-IN-5; CHEMBL4525597; 4-Chloro-2-(2-(2-chlorophenoxy)acetamido)benzoic acid; 4-chloro-2-{[(2-chlorophenoxy)acetyl]amino}benzoic acid; TRPM4-IN-5

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~83.33 mg/mL (~244.97 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.11 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。