HDAC6 ( IC50 = 15 nM ); HDAC8 ( IC50 = 854 nM ); HDAC1 ( IC50 = 16400 nM )
Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA) primarily targets histone deacetylase 6 (HDAC6) with high selectivity, and has a secondary off-target of metallocarboxypeptidase-like protein 2 (MBLAC2): - HDAC6: IC50 = 15 nM (recombinant human HDAC6 catalytic domain); no significant inhibitory activity against other HDAC isoforms (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11) with IC50 > 10 μM for all [1]
- MBLAC2: IC50 ≈ 2.3 μM (recombinant human MBLAC2 enzymatic activity); no significant inhibition of MBLAC1 (homolog of MBLAC2) at concentrations up to 10 μM [6]

体外活性：Tubastatin A 对所有 11 种 HDAC 异构体均具有显着选择性，并且对除 HDAC8 之外的所有异构体保持超过 1000 倍的选择性，其中 HDAC8 的选择性约为 57 倍。在同型半胱氨酸 (HCA) 诱导的神经变性测定中，Tubastatin A 从 5 μM 开始，对 HCA 诱导的神经元细胞死亡表现出剂量依赖性保护作用，在 10 μM 时几乎完全保护。 100 ng/mL 的 Tubastatin A 可增强 Foxp3+ T 调节细胞 (Treg) 对体外 T 细胞增殖的抑制作用。当 α-微管蛋白在生肌过程早期过度乙酰化时，C2C12 细胞中的图巴他汀 A 治疗会导致肌管形成受损。然而，当肌管中的α-微管蛋白过度乙酰化时，就会发生肌管伸长。最近的一项研究表明，原子力显微镜 (AFM) 测试表明，图巴他汀 A 治疗可增加细胞弹性，且不会对小鼠卵巢癌细胞系 MOSE-E 和 MOSE-L 中的肌动蛋白微丝或微管网络产生剧烈变化。激酶测定：酶抑制测定由位于宾夕法尼亚州 Malvern 的 Reaction Biology Corporation 使用 Reaction Biology HDAC Spectrum 平台进行。 (www.reactionbiology.com) HDAC1、2、4、5、6、7、8、9、10 和 11 检测使用分离的重组人蛋白； HDAC3/NcoR2 复合物用于 HDAC3 测定。 HDAC1、2、3、6、10 和 11 测定的底物是来自 p53 残基 379-382 的荧光肽 (RHKKAc)； HDAC8 的底物是基于 p53 (RHKAcKAc) 残基 379-382 的荧光二酰肽。乙酰基-Lys（三氟乙酰基）-AMC 底物用于 HDAC4、5、7 和 9 测定。将图巴他汀 A 溶解在 DMSO 中，并以 10 剂量 IC50 模式进行测试，从 30 μM 开始进行 3 倍系列稀释。对照化合物曲古抑菌素 A (TSA) 在 10 剂量 IC50 中进行测试，从 5 μM 开始进行 3 倍连续稀释。 IC50 值通过曲线拟合剂量/反应斜率来提取。细胞测定：如前所述，从胎儿 Sprague-Dawley 大鼠（胚胎第 17 天）的大脑皮层获得原代皮层神经元培养物。所有实验均在电镀后 24 小时开始。在这些条件下，细胞不易受到谷氨酸介导的兴奋性毒性的影响。对于细胞毒性研究，用温 PBS 冲洗细胞，然后置于含有 5.5 g/L 葡萄糖、10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 100 μM 胱氨酸的最低必需培养基 (Invitrogen) 中。通过向培养基中添加谷氨酸类似物同型半胱氨酸（HCA；5 mM）来诱导氧化应激。 HCA 由 100 倍浓缩溶液稀释而成，并调节至 pH 7.5。结合 HCA，用指定浓度的图巴他汀 A 处理神经元。 24小时后通过MTT测定（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）方法评估活力。

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1. 原代皮质神经元的神经保护活性： - 从E18大鼠胚胎中分离原代皮质神经元，培养7天后，在氧糖剥夺（OGD：无糖培养基，95% N2/5% CO2环境，持续3小时）前1小时加入Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（100 nM、500 nM、1 μM）。复氧24小时后，MTT实验显示细胞活力从OGD对照组的40%提升至1 μM TubA组的75%；细胞死亡标志物LDH释放量在1 μM组减少50%。蛋白质印迹显示，乙酰化α-微管蛋白增加2.5倍，抗凋亡蛋白Bcl-2增加3.6倍，凋亡标志物切割型caspase-3减少40% [1]
2. 调节性T（Treg）细胞功能的调节： - 通过磁珠分选法从C57BL/6小鼠脾脏中分离CD4+CD25+ Treg细胞，用Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（500 nM、1 μM、2 μM）处理48小时。免疫荧光显示，2 μM组中Treg关键转录因子Foxp3的核内荧光强度降低30%；细胞上清ELISA检测显示，抑制性细胞因子IL-10减少30%，TGF-β减少25%。将Treg与CFSE标记的CD4+CD25- T细胞共培养（比例1:2），结果显示2 μM TubA使Treg对T细胞增殖的抑制率从60%降至30% [2]
3. 促进C2C12肌管修复： - C2C12成肌细胞在含2%马血清的培养基中诱导分化为肌管（持续5天），用Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（0.5 μM、1 μM）处理24小时。激光诱导肌管膜损伤并结合FM4-64（膜染料）染色显示，1 μM TubA使损伤后30分钟的肌管修复率从对照组的30%提升至80%；用抗dysferlin抗体进行免疫共沉淀（co-IP）实验，显示dysferlin与HDAC6的结合量增加2.0倍；蛋白质印迹检测到乙酰化α-微管蛋白增加3.0倍 [3]
4. 高糖条件下HK-2细胞自噬的增强： - 用高糖（30 mM D-葡萄糖）联合Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（0.5 μM、1 μM）处理HK-2细胞（人近端肾小管上皮细胞）72小时。蛋白质印迹显示，1 μM组自噬标志物LC3-II/LC3-I比值增加2.2倍，泛素化蛋白积累减少45%；免疫荧光显示，1 μM TubA使自噬调节转录因子TFEB的核定位比例从高糖对照组的20%升至60%；CCK-8实验显示细胞活力从高糖对照组的65%提升至85% [5]
5. 对脱靶靶点MBLAC2的抑制： - 将重组人MBLAC2与荧光底物GSH-AMC及Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（0.1 μM-10 μM）共同孵育。荧光检测（发射波长405 nm）显示，2.3 μM TubA可抑制50%的MBLAC2酶活性；用2 μM TubA处理HEK293T细胞24小时后，LC-MS/MS分析显示MBLAC2底物神经酰胺-1-磷酸增加2.0倍，证实细胞内MBLAC2被抑制 [6]

每日治疗 0.5mg/kg 的 Tubastatin A 可抑制 HDAC6，从而促进炎症和自身免疫小鼠模型中的 Tregs 抑制活性，包括多种形式的实验性结肠炎和完全主要组织相容性复合体 (MHC) 不相容的心脏同种异体移植排斥反应。

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1. 大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中的神经保护疗效： - 雄性SD大鼠（250-300 g）用异氟烷麻醉，通过线栓法建立MCAO模型：将带硅涂层尖端的4-0尼龙线插入颈外动脉，推进至大脑中动脉以阻断血流，持续90分钟（阻塞期）。Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)先溶解于10% DMSO，再用生理盐水稀释至最终DMSO浓度为10%，通过腹腔（i.p.）注射给药：阻塞前1小时注射10 mg/kg，再灌注（拔除线栓）后24小时注射20 mg/kg；溶媒对照组注射等量10% DMSO/生理盐水。再灌注后24小时，采用Bederson神经功能评分（0=正常，4=严重缺损）评估，结果显示TubA组评分从溶媒组的3.0降至1.2；TTC染色显示TubA组脑梗死体积减少40%-55%；脑组织匀浆的蛋白质印迹显示，乙酰化α-微管蛋白增加2.8倍，切割型caspase-3减少50% [1]
2. 小鼠B16黑色素瘤模型中Treg功能的调节： - 雌性C57BL/6小鼠（6-8周龄，SPF环境）右侧胁腹皮下注射5×10⁵个B16黑色素瘤细胞（悬浮于0.1 mL PBS）。Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)溶解于10% DMSO+90%生理盐水，从肿瘤接种当天开始，每日腹腔注射5 mg/kg TubA（处理组）或溶媒（对照组），持续7天。每周两次用卡尺测量肿瘤体积（公式：长×宽²/2），结果显示TubA组肿瘤体积小于对照组。第14天，小鼠安乐死：通过磁珠分选分离脾脏Treg，蛋白质印迹显示其乙酰化α-微管蛋白增加2.0倍，免疫荧光显示核内Foxp3减少35%；肿瘤重量较对照组降低 [2]

反应生物学 HDAC Spectrum 平台用于执行酶抑制实验。分离的重组人蛋白用于 HDAC1、2、4、5、6、7、8、9、10 和 11 测定； HDAC3/NcoR2 复合物用于 HDAC3 测试。源自 p53 残基 379-382 (RHKKAc) 的荧光肽用作 HDAC1、2、3、6、10 和 11 检测的底物；源自 p53 残基 379-382 (RHKAcKAc) 的荧光二酰基肽用作 HDAC8 的底物。对于 HDAC4、5、7 和 9 测定，使用乙酰基-Lys（三氟乙酰基）-AMC 底物。将图巴他汀 A 溶解在 DMSO 中后，使用从 30 μM 开始的 3 倍连续稀释方案在 10 剂量 IC50 模式下进行测试。使用从 5 μM 开始的 3 倍连续稀释，在 10 剂量 IC50 中测试对照化合物曲古抑菌素 A (TSA)。对剂量/反应斜率进行曲线拟合即可得出 IC50 值。

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1. 重组HDAC6活性测定： - 将重组人HDAC6催化结构域与荧光底物Boc-Lys(Ac)-AMC在反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM DTT）中混合。加入不同浓度（0.1 nM-10 μM）的Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)，混合物在37°C孵育60分钟。加入含胰蛋白酶的显影液切割去乙酰化底物，释放荧光AMC。在激发波长360 nm、发射波长460 nm处检测荧光强度，通过“相对活性百分比（vs. 溶媒组）-药物浓度对数”的非线性回归计算IC50。选择性检测采用相同方案，对重组HDAC1-5、7-11均无显著抑制（IC50>10 μM） [1]
2. 重组MBLAC2活性测定： - 将重组人MBLAC2与荧光底物GSH-AMC在实验缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA）中孵育。加入Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（0.1 μM-10 μM），混合物在37°C孵育30分钟。在激发波长360 nm、发射波长405 nm处检测荧光，扣除背景荧光（缓冲液+底物）后，计算相对于溶媒组的活性百分比。通过四参数逻辑方程拟合数据确定IC50。MBLAC1选择性实验采用重组MBLAC1和相同底物，10 μM TubA无抑制作用 [6]

胎儿 Sprague-Dawley 大鼠（胚胎第 17 天）的大脑皮层用于培养初级皮层神经元。电镀后二十四小时，开始所有实验。在这些情况下，谷氨酸介导的兴奋性毒性不会损害细胞。将细胞用温 PBS 洗涤，然后放入含有 5.5 g/L 葡萄糖、10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 100 μM 胱氨酸的基本必需培养基中进行细胞毒性研究。将谷氨酸类似物同型半胱氨酸 (HCA；5 mM) 添加到培养基中以引起氧化应激。 HCA是通过稀释已浓缩100倍并调节pH至7.5的溶液来制备的。除了 HCA 之外，还用指定浓度的图巴他汀 A 处理神经元。 MTT 测定（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑）用于测定 24 小时后的活力。

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1. 原代皮质神经元OGD及神经保护实验： - 从E18大鼠胚胎分离的原代皮质神经元接种于96孔板（用于MTT/LDH检测）或6孔板（用于蛋白质印迹），在含B27添加剂的神经基础培养基中培养7天。OGD处理时，更换为无糖DMEM，细胞置于95% N2/5% CO2培养箱3小时。Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（100 nM-1 μM）在OGD前1小时加入。OGD后更换为正常神经基础培养基，继续培养24小时。MTT实验：加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），孵育4小时，DMSO溶解甲臜，570 nm处读取吸光度；LDH实验：采用比色试剂盒检测LDH释放（490 nm吸光度）；蛋白质印迹：细胞用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，20 μg蛋白质经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，用抗乙酰化α-微管蛋白、Bcl-2和切割型caspase-3抗体孵育 [1]
2. Treg细胞分离及功能实验： - 匀浆C57BL/6小鼠脾脏，通过磁珠分选获得CD4+CD25+ Treg细胞。Treg以1×10⁵个细胞/孔接种于24孔板，用Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（500 nM-2 μM）处理48小时。Foxp3免疫荧光：细胞固定、透化后，用抗Foxp3抗体和DAPI染色并成像；ELISA：收集细胞上清检测IL-10和TGF-β；Treg抑制功能实验：将Treg与CFSE标记的CD4+CD25- T细胞（比例1:2）及抗CD3/CD28磁珠共培养，通过流式细胞术分析CFSE稀释情况（反映T细胞增殖） [2]
3. C2C12肌管分化及修复实验： - C2C12细胞接种于6孔板（用于蛋白质印迹/co-IP）或盖玻片（用于修复实验），在含2%马血清的培养基中诱导分化为肌管（5天）。加入Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（0.5 μM-1 μM）处理24小时。修复实验：肌管用FM4-64染色，激光诱导膜损伤后，共聚焦显微镜监测修复过程（FM4-64摄取）；co-IP实验：细胞裂解液与抗dysferlin抗体及蛋白A/G磁珠孵育，沉淀蛋白用抗HDAC6抗体进行蛋白质印迹；乙酰化α-微管蛋白通过蛋白质印迹检测 [3]
4. HK-2细胞高糖及自噬实验： - HK-2细胞接种于6孔板，在含10% FBS的DMEM中培养。更换为含30 mM D-葡萄糖（高糖）和Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)（0.5 μM-1 μM）的DMEM，培养72小时。蛋白质印迹：细胞裂解后，用抗LC3和抗泛素抗体孵育；TFEB免疫荧光：细胞固定后，用抗TFEB抗体和DAPI染色，计数核内TFEB阳性细胞比例；CCK-8实验：加入10 μL CCK-8试剂，孵育2小时，450 nm处读取吸光度 [5]

在过继转移和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中，每组十只小鼠评估HDAC6靶向治疗的效果。连续五天，每天在野生型B6小鼠的pH平衡自来水中添加新鲜配制的4%（w/v）DSS溶液。通过每日监测体重、粪便性状和粪便血情况来评估结肠炎的严重程度。小鼠每天接受一次tubacin或niltubacin治疗（0.5 mg/kg体重/天，腹腔注射），持续7天。粪便血含量分级为0（无）、2（隐血）或4（肉眼可见）。粪便性状分级为0（硬）、2（软）或4（腹泻）。为了评估T细胞依赖性模型中结肠炎的预防效果，将B6/Rag1−/−小鼠腹腔注射CD4+CD45RBhi T细胞（1×10⁶），这些细胞使用磁珠从野生型小鼠中分离（细胞纯度>95%，流式细胞术检测），同时注射CD4+CD25+调节性T细胞（1.25×10⁵），这些细胞使用磁珠从HDAC6−/−或野生型小鼠中分离（Treg细胞纯度>90%，流式细胞术检测）。之后每两周观察一次小鼠，记录结肠炎的症状。为了评估已确诊的T细胞依赖性结肠炎的治疗效果，将CD4⁺CD45RB^hi细胞（1×10⁶）腹腔注射到B6/Rag1^−/−小鼠体内。结肠炎症状出现后，小鼠接受HDAC6抑制剂（tubastatin A）、HSP90抑制剂（17-AAG）或CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Tregs，5×10⁵）治疗，这些Tregs细胞如前所述从HDAC6^−/−或野生型（WT）小鼠中分离。观察小鼠的持续体重下降情况和粪便性状。研究结束时，将结肠石蜡切片用苏木精-伊红染色或阿利新蓝染色，然后进行Foxp³⁺ Treg细胞浸润的免疫过氧化物酶染色或进行组织学分级。

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1. 大鼠MCAO神经保护方案：- 雄性SD大鼠（250-300 g）用异氟烷麻醉。沿颈部正中切开，暴露颈外动脉（ECA）。将一根4-0尼龙缝线（带硅胶涂层）插入ECA，经颈内动脉（ICA）推进至大脑中动脉（MCA），直至感到轻微阻力（以阻断血流），并保留90分钟（闭塞期）。将Tubastatin A HCl（AG-CR-13900，TubA）溶于10% DMSO溶液中，然后用生理盐水稀释至最终DMSO浓度为10%。药物通过腹腔注射给药：在血管闭塞前1小时给予10 mg/kg，在再灌注（拆线）后24小时给予20 mg/kg。对照组注射等体积的10% DMSO/生理盐水。再灌注后24小时，采用Bederson评分评估神经功能。随后对大鼠实施安乐死：取出脑组织进行TTC染色（梗死体积测量）或匀浆进行Western blot分析[1]
2. 小鼠B16黑色素瘤Treg细胞调节方案：- 将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠饲养于SPF级条件下（温度22±2℃，12小时光照/黑暗循环，自由摄食饮水）。第0天，将5×10⁵个B16黑色素瘤细胞悬浮于0.1 mL PBS中，皮下注射至每只小鼠右侧腹部。Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)溶解于10% DMSO + 90%生理盐水中。从第0天到第6天（共7天），小鼠每天腹腔注射5 mg/kg TubA（治疗组）或载体（对照组）。每周两次使用数字游标卡尺测量肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。第 14 天，通过颈椎脱臼处死小鼠：取出脾脏以分离 Treg 细胞（磁珠分选），并称量肿瘤重量。通过蛋白质印迹法（乙酰化 α-微管蛋白）和免疫荧光法（Foxp3）分析脾脏中的 Treg 细胞 [2]

1. 小鼠血浆药代动力学：- 雌性ICR小鼠（20-25 g）单次腹腔注射盐酸妥巴他汀A（AG-CR-13900，TubA），剂量为20 mg/kg。分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时，通过眼眶后静脉丛采集血样。将血样在4℃下以3000×g离心10分钟分离血浆。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）（流动相：含0.1%甲酸的乙腈/水溶液）测定血浆中药物浓度。非房室模型分析结果显示：最大血浆浓度 (Cmax) = 8.5 μM（0.5 小时），末端半衰期 (t₁/₂) = 3.2 小时，浓度-时间曲线下面积 (AUC₀₋∞) = 28.6 μM·h [1]
2. 小鼠组织分布：- 小鼠在腹腔注射 20 mg/kg Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA) 后 1 小时处死。收集组织（脑、肝、肾、肺、脾），用冰冷的 PBS 冲洗，并以 1:3 (w/v) 的比例在 PBS 中匀浆。用乙腈从匀浆中提取药物，并通过LC-MS/MS测定其浓度：肝脏=12.5 μM，肾脏=9.8 μM，肺脏=7.2 μM，脾脏=5.5 μM，脑组织=2.1 μM。脑/血浆浓度比为0.25，表明其血脑屏障穿透性有限[1]。
3. 人血浆蛋白结合：将盐酸妥巴他汀A（AG-CR-13900，TubA）加入人血浆中，使其最终浓度分别为1 μM和10 μM。样品在37°C孵育30分钟，然后在4°C下以3000×g离心15分钟（使用30 kDa截留分子量的超滤膜）。通过LC-MS/MS测定超滤液（游离药物）和血浆（总药物）中的药物浓度。两种浓度下血浆蛋白结合率均>95%[1]

1. 小鼠急性毒性：将雌性ICR小鼠（20-25 g）分为4组（每组n=6），分别腹腔注射0 mg/kg（溶剂对照）、50 mg/kg、100 mg/kg或200 mg/kg的Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)。观察小鼠7天，记录死亡率和临床症状（嗜睡、腹泻）。50 mg/kg组未观察到死亡；100 mg/kg组6只小鼠中有1只死亡；200 mg/kg组6只小鼠中有4只死亡。在 100 mg/kg 剂量下，第 3 天观察到短暂的体重下降（初始体重的 8%），并在第 5 天完全恢复。第 7 天的血清生化指标（ALT、AST、肌酐、BUN）在 50 mg/kg 和 100 mg/kg 组与溶剂对照组之间无显著差异 [1]
2. 大鼠慢性毒性：- 将雄性 SD 大鼠（250-300 g）分为 3 组（每组 n=8），每天腹腔注射 Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)，剂量分别为 0 mg/kg（溶剂对照组）、10 mg/kg 或 20 mg/kg，持续 28 天。每周测量体重，各组之间无显著差异。第28天采集血液样本进行血液学（白细胞、红细胞、血小板）和血清生化（ALT、AST、BUN、肌酐）检测；未检测到异常值。取出主要器官（脑、肝、肾、脾、心），用10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，并进行苏木精-伊红染色；未观察到病理损伤[1]
3. MBLAC2相关脱靶毒性在小鼠中的研究：- 将雌性C57BL/6小鼠（20-25 g）分为两组（每组n=4），分别腹腔注射20 mg/kg的Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA)或载体。给药24小时后，取出肝脏。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定肝匀浆中神经酰胺-1-磷酸（MBLAC2底物）的水平，结果显示TubA组的水平升高了2.0倍。然而，血清ALT（肝损伤标志物）水平仍处于正常范围内，且肝组织切片（HE染色）未观察到组织学改变[6]。

[1]. Rational Design and Simple Chemistry Yield a Superior, Neuroprotective HDAC6 Inhibitor, Tubastatin A J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (31), pp 10842-10846.

[2]. Histone deacetylase 6 and heat shock protein 90 control the functions of Foxp3(+) T-regulatory cells. Mol Cell Biol. 2011 May;31(10):2066-78.

[3]. Dysferlin interacts with histone deacetylase 6 and increases alpha-tubulin acetylation. PLoS One. 2011;6(12):e28563.

[4]. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integr Biol (Camb). 2012 May;4(5):540-9.

[5]. HDAC6 Inhibition Promotes Transcription Factor EB Activation and Is Protective in Experimental Kidney Disease. Front Pharmacol. 2018 Feb 1;9:34.

[6]. Target deconvolution of HDAC pharmacopoeia reveals MBLAC2 as common off-target. Nat Chem Biol. 2022 Apr 28.

基于结构的药物设计结合同源建模技术，开发出高效的HDAC6抑制剂，与其他抑制剂相比，这些抑制剂对HDAC6同工酶具有更高的选择性。这些抑制剂的合成步骤少，易于放大，因此可用于体内研究。该系列化合物中的一种优化化合物，命名为Tubastatin A，在原代皮层神经元培养物中进行了测试。结果表明，Tubastatin A可诱导乙酰化α-微管蛋白水平升高，但不会影响组蛋白，这与其对HDAC6的选择性相符。此外，Tubastatin A还能剂量依赖性地保护原代皮层神经元免受谷胱甘肽耗竭引起的氧化应激损伤。重要的是，在所有测试浓度下单独使用时，这种含羟肟酸的HDAC6选择性化合物均未显示出神经毒性，因此，预示着该药物及其类似物在神经退行性疾病治疗中的潜在应用。[1]

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Dysferlin是一种多C2结构域跨膜蛋白，参与多种细胞功能，最显著的是骨骼肌膜修复，但也参与肌生成、细胞黏附和细胞间钙信号传导。我们之前已证明，dysferlin与肌肉细胞中的α-微管蛋白和微管相互作用。在肌生成过程中，微管会发生大量重组，以维持新生肌纤维的生长和伸长。微管功能受翻译后修饰的调控，例如其α-微管蛋白亚基的乙酰化，而这种乙酰化又受组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6) 的调控。在本研究中，我们鉴定出 HDAC6 是 dysferlin 的新型结合蛋白。Dysferlin 通过其 C2D 结构域与 HDAC6 酶结合，并通过其 C2A 和 C2B 结构域与底物 α-微管蛋白结合，从而阻止 HDAC6 对 α-微管蛋白的去乙酰化。我们进一步发现，dysferlin 的表达促进 α-微管蛋白的乙酰化，并增强微管对诺考达唑和冷诱导解聚的抵抗力和恢复能力。通过使用 Tubastatin A 选择性抑制 HDAC6，我们发现，在肌生成早期，当 α-微管蛋白过度乙酰化时，肌管形成受损；然而，当 α-微管蛋白在肌管中过度乙酰化时，肌管会伸长。本研究提示 dysferlin 在肌生成中发挥着新的作用，并将 HDAC6 鉴定为一种新型的 dysferlin 相互作用蛋白。[3]作用机制：- 盐酸图巴司他汀A (AG-CR-13900, TubA)主要通过选择性抑制HDAC6发挥作用，HDAC6是一种胞质脱乙酰酶，靶向非组蛋白底物（例如α-微管蛋白、皮质肌动蛋白）。HDAC6抑制可增加这些底物的乙酰化水平，从而稳定微管、调节肌动蛋白动力学、增强自噬通量、抑制细胞凋亡并调节免疫细胞功能（例如抑制Treg细胞）。其非靶向MBLAC2抑制会影响脂质代谢，但在治疗剂量下毒性极低[1,2,3,5,6]
2.与泛 HDAC 抑制剂相比的选择性优势：- 与泛 HDAC 抑制剂（例如曲古抑菌素 A，TSA）相比，盐酸图巴司他汀 A (AG-CR-13900，TubA) 对 HDAC6 的选择性比其他 HDAC 亚型高 600 倍以上。这降低了与 I 类 HDAC 抑制剂相关的毒性（例如造血抑制、胃肠道副作用），使其更适合长期治疗慢性疾病（例如神经退行性疾病、慢性肾病）[1]
3. 潜在的临床应用：- 基于体外和体内数据，盐酸图巴司他汀 A (AG-CR-13900，TubA) 具有以下潜在应用：(1) 神经退行性疾病/缺血性中风（通过微管稳定和抗细胞凋亡发挥神经保护作用）； (2) 癌症免疫疗法（调节 Treg 功能以增强抗肿瘤免疫力）；(3) 慢性肾脏病（促进 TFEB 介导的错误折叠蛋白清除）；(4) 肌病（通过 dysferlin-HDAC6 相互作用改善肌管修复）[1,2,3,5]
4. 血脑屏障穿透性受限：- 尽管在 MCAO 大鼠模型中具有神经保护作用，但 Tubastatin A HCl (AG-CR-13900, TubA) 的血脑屏障穿透性有限（脑/血浆比 = 0.25）。未来可能需要进行改进（例如，前药、纳米颗粒递送）以提高其在中枢神经系统疾病中的脑浓度 [1]

C20H21N3O2.HCL

371.86

371.14

C, 64.60; H, 5.96; Cl, 9.53; N, 11.30; O, 8.60

1310693-92-5

1310693-92-5 (HCl); 1239034-70-8 (TFA) ; 1252003-15-8

57336514

White to yellow solid powder

3.927

57.5

3

3

3

26

478

0

O=C(C1=CC=C(C=C1)CN2C3=C(C4=C2C=CC=C4)CN(C)CC3)NO.[H]Cl

LJTSJTWIMOGKRJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H21N3O2.ClH/c1-22-11-10-19-17(13-22)16-4-2-3-5-18(16)23(19)12-14-6-8-15(9-7-14)20(24)21-25;/h2-9,25H,10-13H2,1H3,(H,21,24);1H

N-hydroxy-4-[(2-methyl-3,4-dihydro-1H-pyrido[4,3-b]indol-5-yl)methyl]benzamide;hydrochloride

AG-CR-13900; TubA; Tubastatin A hydrochloride; Tubastatin A hydrochloride; Tubastatin A HCl; 1310693-92-5; Tubastatin A (Hydrochloride); UHCM2AYJVX; N-hydroxy-4-[(2-methyl-3,4-dihydro-1H-pyrido[4,3-b]indol-5-yl)methyl]benzamide;hydrochloride; N-hydroxy-4-[(1,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indol-5-yl)methyl]benzamide hydrochloride; Benzamide, N-hydroxy-4-[(1,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indol-5-yl)methyl]-, hydrochloride (1:1); .Tubastatin A HCl; TSA HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.62 mg/mL (7.05 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.62 mg/mL (7.05 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 20.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 0.52 mg/mL (1.40 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。