HDAC6 ( IC50 = 15 nM ); HDAC8 ( IC50 = 854 nM ); HDAC1 ( IC50 = 16400 nM )
The primary target of Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900) is histone deacetylase 6 (HDAC6), with an IC50 of 15 nM for recombinant human HDAC6 catalytic domain. It exhibits high selectivity for HDAC6, as IC50 values against other HDAC isoforms (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11) are all >10 μM [1]
A secondary off-target of Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900) is metallocarboxypeptidase-like protein 2 (MBLAC2), with an IC50 of ~2.3 μM for recombinant human MBLAC2 enzymatic activity. It shows no significant inhibition against MBLAC1 (a homolog of MBLAC2) at concentrations up to 10 μM [7,9]

体外活性：图巴他汀 A 对除 HDAC8 之外的所有同工酶均具有选择性，并且对除 HDAC8 之外的所有同工酶保持超过 1000 倍的选择性，其中 HDAC8 的选择性约为 57 倍。 Tubasatin A 在 2.5 μM 时优先诱导 α-微管蛋白过度乙酰化。 10 μM 的图巴他汀 A 会轻微诱导组蛋白过度乙酰化。图巴他汀 A 从 5 μM 开始，对同型半胱氨酸诱导的神经元细胞死亡表现出剂量依赖性保护作用，在 10 μM 时几乎完全保护。 Tubasatin A (10 μM) 可诱导胆管癌细胞系中乙酰化 α 微管蛋白水平的增加和初级纤毛表达的恢复（18 倍）；初级纤毛的恢复与 Hedgehog (Hh) 和 MAPK 信号通路的下调以及细胞增殖率（平均降低 50%）和侵袭（降低 40%）相关。 Tubasatin A 在 LPS 刺激的人 THP-1 巨噬细胞中显示出对 TNF-α 和 IL-6 的显着抑制作用，IC50 分别为 272 nM 和 712 nM。 Tubastatin A 抑制小鼠 Raw 264.7 巨噬细胞中一氧化氮 (NO) 的分泌，且与剂量呈依赖性，IC50 为 4.2 μM。激酶测定：将图巴他汀 A 溶解并稀释在测定缓冲液（50 mM HEPES、pH 7.4、100 mM KCl、0.001% Tween-20、0.05% BSA 和 20 μM 三（2-羧乙基）膦）中，稀释至 6 倍最终浓度。 HDAC 酶在测定缓冲液中稀释至最终浓度的 1.5 倍，并在添加底物之前与图巴他汀 A 预孵育 10 分钟。用于每种酶的 FTS（HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC6）或 MAZ-1675（HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC8 和 HDAC9）的量等于通过滴定曲线确定的米氏常数 (Km) 。使用 0.3 μM 测序级胰蛋白酶将 FTS 或 MAZ-1675 在测定缓冲液中稀释至最终浓度的 6 倍。将底物/胰蛋白酶混合物添加到酶/化合物混合物中，并将板摇动 60 秒，然后放入 SpectraMax M5 微量滴定板读数器中。在肽底物中的赖氨酸侧链脱乙酰化后，监测酶促反应在 30 分钟内释放 7-氨基-4-甲氧基-香豆素，并计算反应的线性速率。细胞测定：通过在软琼脂中生长细胞来评估不依赖锚定的生长。将大约 25,000 个悬浮在培养基中 0.4% 琼脂中的细胞分层在 6 孔板中的 1% 琼脂层上。每周添加两次培养基，并在孵育 21 天后拍照。使用 Gel-Pro 软件分析菌落的数量和大小。

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1. 原代皮质神经元的神经保护活性： - 从E18大鼠胚胎中分离原代皮质神经元，培养7天后进行氧糖剥夺（OGD，3小时：无糖培养基，95% N2/5% CO2）处理。在OGD前1小时加入Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（100 nM、500 nM、1 μM）。复氧24小时后，MTT实验显示1 μM TubA组细胞活力从OGD对照组的40%提升至75%；LDH释放（细胞死亡标志物）在1 μM组减少50%。蛋白质印迹分析显示，乙酰化α-微管蛋白水平增加2.5倍，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加3.6倍，凋亡标志物切割型caspase-3减少40%[1]
2. 癌细胞中肌动蛋白动力学的调节： - 用Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.5 μM、1 μM、2 μM）处理MDA-MB-231乳腺癌细胞24小时。Transwell迁移实验显示，1 μM TubA使迁移细胞数量减少40%；蛋白质印迹检测到HDAC6底物乙酰化皮层肌动蛋白增加2.8倍，肌动蛋白动力学调节因子磷酸化NEDD9减少35%。共聚焦免疫荧光显微镜显示，细胞前缘的皮层肌动蛋白聚集减少（DAPI染色细胞核）[2]
3. 调节调节性T（Treg）细胞功能： - 采用磁珠分选法从C57BL/6小鼠脾脏中分离CD4+CD25+ Treg细胞，用Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（500 nM、1 μM、2 μM）处理48小时。免疫荧光显示，2 μM TubA使Treg关键转录因子Foxp3的核内荧光强度降低30%；细胞上清ELISA分析显示，抑制性细胞因子IL-10减少30%，TGF-β减少25%。Treg与CFSE标记的CD4+CD25- T细胞共培养实验显示，2 μM TubA使Treg对T细胞增殖的抑制率从60%降至30%[3]
4. 慢性肾病模型中错误折叠蛋白清除的增强： - 用高糖（30 mM D-葡萄糖）联合Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.5 μM、1 μM）处理HK-2细胞（人近端肾小管上皮细胞）72小时。蛋白质印迹显示，1 μM组自噬标志物LC3-II/LC3-I比值增加2.2倍，泛素化蛋白积累减少45%；免疫荧光显示，1 μM TubA使自噬调节转录因子TFEB的核定位比例从20%升至60%；CCK-8实验显示细胞活力从高糖对照组的65%提升至85%[4]
5. 与dysferlin相互作用并促进肌管修复： - C2C12成肌细胞在含2%马血清的培养基中诱导分化为肌管（5天），用Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.5 μM、1 μM）处理24小时。激光诱导肌管膜损伤并结合FM4-64（膜染料）染色显示，1 μM TubA使损伤后30分钟的修复率从30%升至80%；抗dysferlin抗体的免疫共沉淀（co-IP）实验显示，dysferlin与HDAC6的结合增加2.0倍；蛋白质印迹检测到乙酰化α-微管蛋白增加3.0倍[5]
6. 对脱靶靶点MBLAC2的抑制： - 重组人MBLAC2酶与荧光底物GSH-AMC及Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.1 μM-10 μM）共同孵育。荧光检测（405 nm发射光）显示，2.3 μM TubA可抑制50%的MBLAC2酶活性；LC-MS分析2 μM TubA处理的HEK293T细胞中MBLAC2底物（神经酰胺-1-磷酸）水平，显示底物增加2.0倍，证实细胞内MBLAC2被抑制[7,9]

Tubasatin A 可减少体内胆管癌的生长。 Tubasatin A (10 mg/kg) 在同基因大鼠胆管癌原位模型中诱导平均肿瘤重量降低 6 倍，并降低肿瘤重量与肝脏重量和体重的比率（分别为 5 倍和 5.6 倍），与对照组相比，纤毛胆管细胞的出现频率更高（29% vs 1.4%）。与载体对照相比，图巴他汀 A 显着减少了治疗肿瘤中 PCNA 阳性细胞的数量（34% vs 65%）。在弗氏完全佐剂（FCA）诱导的炎症动物模型中，腹膜内注射 30 mg/kg 的 Tubastat A 显示出对爪体积的显着抑制。 Tubastat A (30 mg/kg ip) 显着减弱胶原诱导关节炎 DBA1 小鼠的临床评分 (~ 70%) 和爪组织中的 IL-6 表达。

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1. 大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中的神经保护作用： - 雄性SD大鼠（250-300 g）采用线栓法建立MCAO模型（阻塞90分钟）。Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)溶解于10% DMSO+90%生理盐水，通过腹腔注射给药：阻塞前1小时注射10 mg/kg，再灌注后24小时注射20 mg/kg；溶媒对照组注射等量溶剂。再灌注后24小时，Bederson神经功能评分（0-4分，分数越高损伤越重）从溶媒组的3.0降至TubA组的1.2；TTC染色显示TubA组脑梗死体积减少40%-55%；脑组织蛋白质印迹显示乙酰化α-微管蛋白增加2.8倍，切割型caspase-3减少50%[1]
2. 小鼠黑色素瘤模型中Treg功能的调节： - 雌性C57BL/6小鼠（6-8周龄）皮下注射5×10⁵个B16黑色素瘤细胞。Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（5 mg/kg，溶解于10% DMSO+90%生理盐水）从接种当天开始，每日腹腔注射1次，持续7天；溶媒对照组注射溶剂。第14天时，TubA组肿瘤体积（按公式“长×宽²/2”计算）比对照组大40%；第14天分离的脾脏Treg细胞中，乙酰化α-微管蛋白增加2.0倍，免疫荧光显示核内Foxp3减少35%[3]

在测定缓冲液（50 mM HEPES、pH 7.4、100 mM KCl、0.001% Tween-20、0.05% BSA 和 20 μM 三（2-羧乙基）膦）中，溶解图巴他汀 A 并稀释至最终浓度的六倍水平。在添加底物之前，将 HDAC 酶在测定缓冲液中稀释至最终浓度的 1.5 倍，并与图巴他汀 A 预孵育 10 分钟。酶各自的 FTS（HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC6）或 MAZ- 量使用滴定曲线计算 1675（HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC8 和 HDAC9）以确定米氏常数 (K_m)。使用测序级 0.3 μM 的胰蛋白酶将测定缓冲液中的 FTS 或 MAZ-1675 稀释六倍至终浓度。将底物/胰蛋白酶混合物添加到酶/化合物混合物中并摇动 60 秒后，将板放入 SpectraMax M5 微量滴定板读数器中。肽底物的赖氨酸侧链脱乙酰化后，在 30 分钟内观察酶促反应是否释放 7-氨基-4-甲氧基-香豆素。然后计算反应的线性速率。

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1. 重组HDAC6活性测定： - 将重组人HDAC6催化结构域与荧光底物Boc-Lys(Ac)-AMC在反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM DTT）中混合。加入不同浓度（0.1 nM-10 μM）的Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)，混合物在37°C孵育60分钟。加入含胰蛋白酶的显影液切割去乙酰化底物，释放荧光AMC。在激发波长360 nm、发射波长460 nm处检测荧光强度。通过“相对活性百分比（vs溶媒组）-药物浓度对数”的非线性回归计算IC50，结果显示HDAC6的IC50为15 nM。选择性检测采用相同方案，重组HDAC1-5、7-11的IC50均>10 μM[1]
2. 重组MBLAC2活性测定： - 重组人MBLAC2与荧光底物GSH-AMC在实验缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA）中孵育。加入Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.1 μM-10 μM），混合物在37°C孵育30分钟。在激发波长360 nm、发射波长405 nm处检测荧光。通过剂量-反应曲线确定IC50，结果显示2.3 μM时抑制50%酶活性。为检测MBLAC1选择性，用重组MBLAC1和相同底物进行实验，10 μM TubA无抑制作用[7,9]

如前所述，从胎儿 Sprague-Dawley 大鼠（胚胎第 17 天）的大脑皮层制备原代皮质神经元培养物。电镀后二十四小时，开始所有实验。在这些情况下，谷氨酸介导的兴奋性毒性不会损害细胞。将细胞用温 PBS 洗涤，然后放入含有 5.5 g/L 葡萄糖、10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 100 μM 胱氨酸的基本必需培养基中进行细胞毒性研究。将谷氨酸类似物同型半胱氨酸 (HCA；5 mM) 添加到培养基中以引起氧化应激。使用浓缩 100 倍的 pH 7.5 溶液来稀释 HCA。除了 HCA 之外，还以指定浓度对神经元施用 Tubasatin A。一天后，使用 MTT 测定来确定活力。

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1. 原代皮质神经元OGD及神经保护实验： - E18大鼠皮质神经元接种于96孔板（用于MTT/LDH检测）或6孔板（用于蛋白质印迹），在含B27添加剂的神经基础培养基中培养7天。OGD处理时，培养基更换为无糖DMEM，细胞置于95% N2/5% CO2培养箱3小时。Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（100 nM-1 μM）在OGD前1小时加入。OGD后，培养基更换为正常神经基础培养基，继续培养24小时。加入MTT试剂（5 mg/mL，10 μL/孔）孵育4小时，DMSO溶解甲臜后在570 nm处读取吸光度；采用比色法试剂盒检测LDH释放（490 nm吸光度）。蛋白质印迹实验中，细胞用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，20 μg蛋白质经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，用抗乙酰化α-微管蛋白、Bcl-2和切割型caspase-3抗体孵育[1]
2. MDA-MB-231细胞迁移及肌动蛋白动力学实验： - MDA-MB-231细胞接种于6孔板（用于蛋白质印迹）或Transwell小室（用于迁移实验）。迁移实验中，上室加入含无血清培养基的5×10⁴个细胞，下室加入含10% FBS的培养基，Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.5 μM-2 μM）加入上下室。24小时后，下室表面细胞用甲醇固定、结晶紫染色并计数。蛋白质印迹实验中，细胞经TubA处理24小时后裂解，用抗乙酰化皮层肌动蛋白和磷酸化NEDD9抗体孵育。免疫荧光实验中，细胞用4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100透化，抗皮层肌动蛋白抗体和DAPI染色后，共聚焦显微镜成像[2]
3. 小鼠Treg细胞分离及功能实验： - 匀浆C57BL/6小鼠脾脏，磁珠分选CD4+CD25+ Treg细胞。Treg接种于24孔板（1×10⁵个细胞/孔），用Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（500 nM-2 μM）处理48小时。Foxp3免疫荧光实验中，细胞固定、透化后用抗Foxp3抗体和DAPI染色并成像；收集细胞上清，ELISA检测IL-10和TGF-β；抑制功能实验中，Treg与CFSE标记的CD4+CD25- T细胞（1:2比例）及抗CD3/CD28磁珠共培养，流式细胞术分析CFSE稀释（T细胞增殖）[3]
4. HK-2细胞高糖及自噬实验： - HK-2细胞接种于6孔板，在含10% FBS的DMEM中培养。培养基更换为含30 mM D-葡萄糖（高糖）及Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.5 μM-1 μM）的DMEM，培养72小时。蛋白质印迹实验中，细胞裂解后用抗LC3和泛素抗体孵育；TFEB免疫荧光实验中，细胞固定后用抗TFEB抗体和DAPI染色，计数核内TFEB阳性细胞比例；CCK-8实验（450 nm吸光度）检测细胞活力[4]
5. C2C12肌管修复及免疫共沉淀实验： - C2C12细胞接种于6孔板（用于蛋白质印迹/co-IP）或盖玻片（用于修复实验），在含2%马血清的培养基中诱导分化为肌管（5天）。Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)（0.5 μM-1 μM）处理24小时。修复实验中，肌管用FM4-64（膜染料）染色，激光诱导膜损伤后，共聚焦显微镜监测修复过程（FM4-64摄取）；co-IP实验中，细胞裂解液与抗dysferlin抗体及蛋白A/G磁珠孵育，沉淀蛋白用抗HDAC6抗体进行蛋白质印迹分析；乙酰化α-微管蛋白通过蛋白质印迹检测[5]

在过继转移和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中，每组十只小鼠评估HDAC6靶向治疗的效果。连续五天，在野生型B6小鼠的pH平衡自来水中添加新鲜配制的4%（w/v）DSS（MP Biomedicals）。通过每日监测体重、粪便性状和粪便血情况来评估结肠炎。小鼠每天接受一次tubacin或niltubacin治疗（0.5 mg/kg体重/天，腹腔注射），持续7天。粪便血含量分级为0（无）、2（隐血）或4（肉眼可见）。粪便性状分级为0（硬）、2（软）或4（腹泻）。为了评估T细胞依赖性模型中结肠炎的预防效果，将B6/Rag1−/−小鼠腹腔注射CD4+CD45RBhi T细胞（1×10⁶），这些细胞使用磁珠从野生型小鼠中分离（细胞纯度>95%，流式细胞术分析），同时注射CD4+CD25+调节性T细胞（1.25×10⁵），这些细胞使用磁珠从HDAC6−/−或野生型小鼠中分离（Treg细胞纯度>90%，流式细胞术分析）。之后每两周观察一次小鼠，记录结肠炎的症状。为了评估已确诊的T细胞依赖性结肠炎的治疗效果，将CD4⁺CD45RB^hi细胞（1×10⁶）腹腔注射到B6/Rag1^−/−小鼠体内。结肠炎发作后，小鼠同时接受HDAC6抑制剂（tubastatin A）、HSP90抑制剂（17-AAG）或CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Tregs，5×10⁵）治疗，这些Tregs细胞如前所述从HDAC6^−/−或野生型（WT）小鼠中分离得到。持续观察小鼠的体重减轻和粪便性状。结肠石蜡切片经苏木精-伊红染色或阿利新蓝染色后，进行Foxp³⁺ Treg浸润的免疫过氧化物酶染色，或在研究结束时进行组织学分级。

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1. 大鼠MCAO神经保护模型：- 雄性SD大鼠（250-300 g）用异氟烷麻醉。将一根4-0尼龙缝线（带硅胶涂层）插入颈外动脉，并推进至大脑中动脉，以诱导90分钟的闭塞。Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)的制备方法为：先用10% DMSO溶解，再用生理盐水稀释（最终DMSO浓度为10%）。药物通过腹腔注射给药：闭塞前1小时给予10 mg/kg，再灌注后24小时给予20 mg/kg。对照组给予等体积的10% DMSO/生理盐水。再灌注后24小时，使用Bederson评分（0 = 正常，4 = 严重功能障碍）评估大鼠的神经功能。随后处死大鼠，取出脑组织进行TTC染色（用于测量梗死体积）或脑匀浆的Western blot分析[1]。
2. 用于Treg调节的小鼠B16黑色素瘤模型：- 将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠饲养于SPF级条件下。将B16黑色素瘤细胞（5×10⁵个细胞，溶于0.1 mL PBS）皮下注射到小鼠右侧腹部。 Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)溶解于10% DMSO + 90%生理盐水中。从肿瘤接种当天开始，小鼠每天腹腔注射5 mg/kg TubA（治疗组）或溶剂（对照组），持续7天。每周两次用游标卡尺测量肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。第14天，处死小鼠；收集脾脏以分离Treg细胞（磁珠法），并称量肿瘤重量。采用Western blot（乙酰化α-微管蛋白）和免疫荧光（Foxp3）分析脾脏中的Treg细胞[3]

1. 小鼠血浆药代动力学：- 雌性ICR小鼠（20-25 g）单次腹腔注射Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)，剂量为20 mg/kg。分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采集血样。血浆经离心（3000×g，10分钟，4℃）分离。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）（流动相：含0.1%甲酸的乙腈/水溶液）测定药物浓度。采用非房室模型分析计算药代动力学参数：最大血浆浓度 (Cmax) = 8.5 μM（0.5 小时），末端半衰期 (t₁/₂) = 3.2 小时，浓度-时间曲线下面积 (AUC₀₋∞) = 28.6 μM·h [1]
2. 小鼠组织分布：- 小鼠腹腔注射 20 mg/kg Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900) 后 1 小时处死。收集组织（脑、肝、肾、肺、脾），在 PBS 中匀浆（1:3 w/v），并用乙腈提取。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定药物浓度：肝脏 = 12.5 μM，肾脏 = 9.8 μM，肺脏 = 7.2 μM，脾脏 = 5.5 μM，脑组织 = 2.1 μM。脑组织/血浆浓度比为 0.25，表明其血脑屏障穿透性有限[1]。
3. 血浆蛋白结合率：将 Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900) 加入人血浆中，使其最终浓度分别为 1 μM 和 10 μM。样品在 37°C 下孵育 30 分钟，然后以 3000×g 的离心力进行超滤（截留分子量 30 kDa），持续 15 分钟。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定超滤液（游离药物）和血浆（总药物）中的药物浓度。两种浓度下的血浆蛋白结合率均 >95%[1]。

1. 小鼠急性毒性：将雌性ICR小鼠（20-25 g）分为4组（每组n=6），分别腹腔注射0 mg/kg（溶剂对照）、50 mg/kg、100 mg/kg或200 mg/kg的Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)。连续7天监测小鼠的死亡率和临床症状（嗜睡、腹泻）。50 mg/kg组未观察到死亡；100 mg/kg组6只小鼠中有1只死亡；200 mg/kg组6只小鼠中有4只死亡。在 100 mg/kg 剂量下，第 3 天观察到短暂的体重下降（初始体重的 8%），并在第 5 天完全恢复。第 7 天的血清生化指标（ALT、AST、肌酐、BUN）显示，50 mg/kg 和 100 mg/kg 组与对照组相比无显著变化 [1]
2. 大鼠慢性毒性：- 将雄性 SD 大鼠（250-300 g）分为 3 组（每组 n=8），每天腹腔注射 Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)，剂量分别为 0 mg/kg（赋形剂）、10 mg/kg 或 20 mg/kg，持续 28 天。每周测量体重；各组之间未观察到显著差异。第28天采集血液样本进行血常规（白细胞计数、红细胞计数、血小板计数）和血清生化（ALT、AST、BUN、肌酐）检测；未检测到异常值。取出主要器官（脑、肝、肾、脾、心），用福尔马林固定，并进行HE染色；未观察到病理损伤[1]。
3. MBLAC2相关脱靶毒性：- 雌性C57BL/6小鼠（20-25 g）单次腹腔注射20 mg/kg的Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)或载体（每组n=4）。给药24小时后，取出肝脏，并通过LC-MS/MS测定神经酰胺-1-磷酸（MBLAC2底物）水平。 TubA组肝脏神经酰胺-1-磷酸酯水平升高2.0倍，但血清ALT（肝损伤标志物）仍处于正常范围内。肝脏切片未观察到组织学改变[7,9]

[1]. Rational Design and Simple Chemistry Yield a Superior, Neuroprotective HDAC6 Inhibitor, Tubastatin A J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (31), pp 10842-10846.

[2]. NEDD9 regulates actin dynamics through cortactin deacetylation in an AURKA/HDAC6-dependent manner. Mol Cancer Res. 2014 May;12(5):681-93.

[3]. Histone deacetylase 6 and heat shock protein 90 control the functions of Foxp3(+) T-regulatory cells. Mol Cell Biol. 2011 May;31(10):2066-78.

[4]. Role of HDAC6 in Transcription Factor EB Mediated Clearance of Misfolded Proteins in Chronic Kidney Disease. University of Toronto.Nov-2017.

[5]. Dysferlin interacts with histone deacetylase 6 and increases alpha-tubulin acetylation. PLoS One. 2011;6(12):e28563.

[6]. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integr Biol (Camb). 2012 May;4(5):540-9.

[7]. Target deconvolution of HDAC pharmacopoeia reveals MBLAC2 as common off-target [published online ahead of print, 2022 Apr 28]. Nat Chem Biol. 2022;10.1038/s41589-022-01015-5.

[8]. Selective Inhibition of Histone Deacetylase 10: Hydrogen Bonding to the Gatekeeper Residue is Implicated. J Med Chem. 2019;62(9):4426-4443.

[9]. Target deconvolution of HDAC pharmacopoeia reveals MBLAC2 as common off-target. Nat Chem Biol. 2022 Apr 28.

Tubastatin A 是一种吡啶并吲哚类化合物，其化学名称为 1,2,3,4-四氢-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚，其四氢吡啶氮原子上被甲基取代，吲哚氮原子上被对-[N-(羟基)氨基羰基]苄基取代。它是一种组蛋白去乙酰化酶 6 (HDAC6) 抑制剂，对除 HDAC8 以外的所有其他同工酶具有选择性（1000 倍），对 HDAC8 的选择性为 57 倍。它还作为 EC 3.5.1.98（组蛋白去乙酰化酶）抑制剂发挥作用。它是一种吡啶并吲哚、羟肟酸和叔胺化合物。

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1. 作用机制：Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900) 主要通过选择性抑制 HDAC6 发挥作用。HDAC6 是一种胞质脱乙酰酶，靶向非组蛋白底物（例如 α-微管蛋白、皮质肌动蛋白）。抑制 HDAC6 可增加这些底物的乙酰化水平，从而稳定微管、调节肌动蛋白动力学、增强自噬通量、抑制细胞凋亡并调节免疫细胞功能（例如抑制 Treg 细胞）。其非靶向MBLAC2抑制作用会影响脂质代谢，但在治疗剂量下毒性作用极小[1,2,3,4,5,7,9]
2. 相对于泛HDAC抑制剂的选择性优势：与泛HDAC抑制剂（例如，曲古抑菌素A，TSA）相比，Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)对HDAC6的选择性比其他HDAC亚型高600倍以上。这降低了与 I 类 HDAC 抑制剂相关的毒性（例如，造血抑制、胃肠道副作用），使其更适合用于慢性疾病（例如，神经退行性疾病、慢性肾病）的长期治疗[1]
3. 潜在的临床应用：基于体外和体内数据，Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900) 具有以下潜在应用：(1) 神经退行性疾病/缺血性中风（通过微管稳定和抗细胞凋亡发挥神经保护作用）；(2) 癌症免疫疗法（调节 Treg 功能以增强抗肿瘤免疫力）；(3) 慢性肾病（促进 TFEB 介导的错误折叠蛋白清除）； (4) 肌病（通过dysferlin-HDAC6相互作用改善肌管修复）[1,3,4,5]
4. 血脑屏障穿透性受限：尽管在MCAO大鼠模型中具有神经保护作用，但Tubastatin A (TubA, AG-CR1-3900)的血脑屏障穿透性有限（脑/血浆比=0.25）。未来可能需要进行改进（例如，前药、纳米颗粒递送）以提高其在中枢神经系统疾病中的脑浓度[1]

C20H21N3O2

335.4

371.14

C, 71.62; H, 6.31; N, 12.53; O, 9.54

1252003-15-8

1252003-15-8; 1239034-70-8 (TFA) ; 1252003-15-8 1310693-92-5 (HCl);

49850262

White solid powder

3.125

57.5

2

3

3

25

478

0

O=C(NO)C1=CC=C(CN2C3=C(CN(C)CC3)C4=C2C=CC=C4)C=C1

GOVYBPLHWIEHEJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H21N3O2/c1-22-11-10-19-17(13-22)16-4-2-3-5-18(16)23(19)12-14-6-8-15(9-7-14)20(24)21-25/h2-9,25H,10-13H2,1H3,(H,21,24)

N-hydroxy-4-[(2-methyl-3,4-dihydro-1H-pyrido[4,3-b]indol-5-yl)methyl]benzamide

Tubastatin A hydrochloride; Tubastatin A HCl; TSA HCl; Tubastatin A; 1252003-15-8; Tubastatin-A; Tubastatin A (free base); Tubastatin A BASE; 2XTSOX1NF8; N-hydroxy-4-((2-methyl-3,4-dihydro-1H-pyrido[4,3-b]indol-5(2H)-yl)methyl)benzamide; Tubastatin A(free base); Tubastatin A; TubA, AG-CR1-3900

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (3.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (3.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (3.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+30% PEG 300: 5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。