Neflamapimod (VX745, VRT031745; VD31745)   中文名称: 奈拉莫德

p38α (IC50 = 10 nM); p38β (IC50 = 220 nM)

VX-745 选择性抑制 p38α 和 p38β MAPK，IC50 值分别为 10 nM 和 220 nM。然而，它不会抑制 p38γ MAPK 或大量其他激酶，IC50 值大于 20 M。VX-745 对人外周血单核细胞 (PBMC) 中 IL-1β 和 TNFα 的 IC50 分别为 56 和 52 nM ）分别进行测定。 IL-1 和 TNFα 诱导的 IL-6 和 IL-8 的产生以及 LPS 和 IL-1β 介导的 COX-2 的合成均被 VX-745 抑制。[1-3] VX-745 (60 nM-20 µM）可抑制骨髓基质细胞 (BMSC) 产生 IL-6 和 VEGF，而不影响其活力。此外，当 TNF-α 存在时，VX-745 可阻止 BMSC 分泌 IL-6。抑制多发性骨髓瘤 (MM) 细胞增殖和 BMSC 中由 MM 细胞粘附 BMSC 引起的 IL-6 分泌，表明 VX-745 可以抑制 BM 环境中的旁分泌 MM 细胞生长，并克服与细胞粘附相关的耐药性。 [4]

VX-745 对大鼠佐剂诱导性关节炎 (AA) 的 ED50 为 5 mg/kg。根据组织学结果，VX-745 可抑制 AA 大鼠中 93% 的骨吸收和 56% 的炎症。 VX-745 在传统软骨诱发的关节炎模型中显示出严重程度评分的剂量反应性下降。 [1-3] 与接受载体治疗的小鼠相比，VX-745（2.5、5 和 10 mg/kg）将 II 型胶原诱导关节炎 (CIA) 小鼠模型的炎症评分改善了 27%，31分别为 % 和 44%。此外，根据组织学评分，VX-745 对骨和软骨侵蚀具有 32-39% 的保护作用。 [5]

使用分光光度偶联酶测定，测定抑制 p38α 和 p38β 同系物的 IC50。将固定浓度的酶（15 nM p38α 或 p38β）与 VX-745 在 DMSO 中孵育 10 分钟。 30 °C，0.1 M HEPES 缓冲液，pH 7.5，含有 10% 甘油、10 mM MgCl2、2.5 mM 磷酸烯醇丙酮酸、200 µM NADH、150 µg/mL 丙酮酸激酶、50 µg/mL 乳酸脱氢酶和 200 µM EGF 受体肽（KRELVEPLTPSGEAPNQALLR）。对于 p38α 和 p38β 测定，分别使用 100 µM 和 70 µM ATP 来启动反应。为了跟踪反应进程，测量 340 nm 处吸光度的降低。作为抑制剂浓度的函数，IC50 是根据速率数据计算的。 [5]

在 96 孔培养板中，在存在或不存在 VX-745 的情况下，将 BMSC（5 × 104 细胞/孔）或 MM 细胞（3 × 104 细胞/孔）在 37 °C 下孵育 48 小时。 [3H]-胸苷 ([3H]TdR) 的摄取用于测量 DNA 合成。在 48 小时培养的最后 8 小时内，将 [3H]TdR（0.5 μCi/孔 [0.0185 MBq]）脉冲注入细胞中。通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 染料的吸光度，还可以确定 VX-745 对 MM 细胞和 BMSC 的生长抑制作用。

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DNA合成和生长抑制试验[4]
如前所述，对增殖进行了测量。MM细胞（3×104个细胞/孔）或BMSCs（5×104个电池/孔）在37°C下在96孔培养板中在有或没有Neflamapimod/VX-745的情况下孵育48小时。通过[3H]-胸苷（[3H]TdR）摄取来测量DNA合成。在48小时培养的最后8小时内，用[3H]TdR（0.5μCi/孔[.0185 MBq]）对细胞进行脉冲。如前所述，还通过测量3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）染料吸光度来评估VX-745对MM细胞和BMSCs的生长抑制作用。16所有实验均进行了四次。

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Neflamapimod/VX-745对BM旁分泌MM细胞生长的影响[4]
为了评估粘附在BMSCs上的MM细胞的生长刺激和信号传导，在有或没有Neflamapimod/VX-745的情况下，将3×104 MM.1S细胞在BMSC涂层的96孔板中培养48小时。如上所述测量DNA合成。如前所述，使用Duoset酶联免疫吸附试验（ELISA）测量BMSCs在有或没有MM.1S细胞以及有或没有VX-745的情况下48小时培养上清液中的IL-6和VEGF。

II 型胶原诱导性关节炎 (CIA) 小鼠模型 (DBA/1J)
2.5、5 和 10 mg/kg
每日两次灌胃

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雄性 DBA/1 小鼠的 II 型胶原诱导性关节炎 (CIA) 模型 [5]
在 10 周龄雄性 DBA/1 小鼠中建立了 CIA 模型，并进行了一些小的修改。小鼠通过两次皮内注射进行免疫，两次注射间隔3周，每次注射100 μL乳剂，该乳剂由鸡II型胶原蛋白（200 μg溶于10 mM乙酸）与弗氏完全佐剂按1:1 (v/v) 比例混合制备。
加强免疫后，对小鼠进行2-3周的观察，直至其双前爪出现局灶性腕关节肿胀，相当于关节炎严重程度评分达到2级。此时，将小鼠随机分为五组：

1. 水对照组：10 mL/kg，口服（po），每日两次（bid），n = 14
2. 100%丙二醇（PG）溶剂对照组：10 mL/kg，口服（po），每日两次（bid），n = 8
3. 丙二醇（PG）中奈弗拉马匹莫德组：10 mg/kg，口服（po），每日两次（bid），n = 7
4. 奈弗拉匹莫德（Neflamapimod）溶于丙二醇（PG）：5 mg/kg，口服，每日两次，n = 10
5. 奈弗拉匹莫德（Neflamapimod）溶于丙二醇（PG）：2.5 mg/kg，口服，每日两次，n = 11

关节炎评分：
使用5级评分系统，每隔一天评估一次临床症状：

• 1级：腕部红斑
• 2级：腕部局部肿胀
• 3级：腕部完全肿胀
• 4级：腕部和手掌肿胀
• 5级：腕部、手掌和手指肿胀

使用双侧前爪的综合评分绘制疾病进展图。

组织病理学评估：
在第20天，处死小鼠，收集前爪，进行矢状切片，并用苏木精-伊红（H&E）染色。关节炎症分级如下：
• 1级：滑膜浸润至关节腔
• 2级：软骨侵蚀
• 3级：软骨和骨侵蚀
• 4级：严重侵蚀伴血管翳形成

表3总结了化合物3/Neflamapimod在三种动物中的药代动力学参数。大鼠和犬的全身清除率略高于肝血流量，且化合物3在所有三种动物中均表现出显著的血管外分布，这可由稳态分布容积所证实。在雄性BALB/c小鼠、Sprague-Dawley大鼠和比格犬中，对化合物3在TPGS/PEG-400/水（2:7:1）中的口服药代动力学特征进行了表征。单剂量研究结果表明，化合物3在所有三种动物中均具有良好的生物利用度（分别为87%、56%和69%）。与静脉给药相比，化合物3口服给药后的半衰期更长，提示其在三种动物中的消除过程受吸收速率限制。化合物3既不是人肝细胞色素P450同工酶的显著抑制剂，也不是其诱导剂。化合物 3 对 CYP 3A4、2D6、2C19、2C9 和 1A2 的抑制 IC50 值均大于 40 μM。化合物 3 与血浆蛋白的结合率在大鼠和犬中分别为 98% 和 92%。

[1]. American Chemical Society, 2000, IDDB3.

[2]. Curr Opin Investig Drugs . 2001 Aug;2(8):1070-6.

[3]. IDrugs . 2000 Sep;3(9):983-9.

[4]. Blood . 2003 Jan 15;101(2):703-5.

[5]. ACS Med Chem Lett, 2011, 2(10), 758-763.

VX-745 属于嘧啶并哒嗪类化合物，其结构为 6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮，在 2 位和 5 位分别被 (2,4-二氟苯基)硫基和 2,6-二氯苯基取代。它具有 EC 2.7.11.24（丝裂原活化蛋白激酶）抑制剂、抗炎药和细胞凋亡诱导剂的作用。它是一种嘧啶并哒嗪、二氟苯、二氯苯和芳基硫醚。
Neflamapimod 已用于阿尔茨海默病和轻度认知障碍治疗的研究试验。

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VX-745 是一种领先的抗炎候选药物，属于丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 小分子抑制剂，由 Vertex Pharmaceuticals Inc. 与 Kissei Pharmaceutical Co Ltd. 合作开发，用于治疗类风湿性关节炎 (RA) [214928]。Vertex 于 1999 年 11 月启动了一项 II 期试点试验，将 VX-745 作为一种潜在的抗炎药物用于治疗 RA [346067]。 2000年6月，II期临床试验仍在进行中[371819]。2001年1月，Vertex公司启动了一项针对类风湿关节炎（RA）成年患者的随机、双盲、安慰剂对照II期临床试验，旨在评估临床反应率、患者自述健康状况以及药物活性的药效学指标[395083]。在2000年5月举行的美国化学学会第33届年会上，有报道称VX-745对多种p38 MAPK亚型具有活性，包括p38α、p38β和p38γ[368149]。 VX-745靶向p38 MAPK可抑制炎症介质的释放，包括白细胞介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子（TNF）α，已知这些炎症介质与类风湿关节炎（RA）的病理生理过程加剧有关[273648]、[368149]、[371548]、[372054]、[408713]。[2]p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是MAPK家族的成员，可被细胞因子和生长因子激活，但其在多发性骨髓瘤（MM）发病机制中的作用尚不清楚。本研究表明，特异性p38 MAPK抑制剂VX-745可抑制骨髓基质细胞（BMSCs）中白细胞介素6（IL-6）和血管内皮生长因子（VEGF）的分泌，且不影响其细胞活力。VX-745还能抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的BMSCs中IL-6的分泌。更重要的是，VX-745可抑制MM细胞增殖以及MM细胞黏附于BMSCs后诱导的BMSCs中IL-6的分泌，提示其可抑制骨髓微环境中MM细胞的旁分泌生长，并克服细胞黏附相关的耐药性。因此，这些研究将p38 MAPK确定为克服MM耐药性、改善患者预后的新型治疗靶点。 [4]本文描述了新型、选择性、口服活性2,5-二取代的6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮类p38α抑制剂的合成。利用酶-配体复合物的结构信息指导筛选化合物，最终鉴定出一类含有先前未报道的双环杂环核心结构的新型p38α抑制剂。进一步研究该系列化合物的构效关系，最终发现了5-(2,6-二氯苯基)-2-(2,4-二氟苯硫基)-6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮 (VX-745)。VX-745具有优异的酶活性和选择性，良好的药代动力学特征，并在炎症模型中表现出良好的体内活性。为了评估化合物 3 的体内治疗潜力，我们采用了小鼠胶原诱导性关节炎模型（模拟人类类风湿性关节炎），其中 DBA/1J 小鼠用鸡 II 型胶原蛋白免疫两次。当每只爪子的炎症评分达到 2 分时开始治疗，此时腕关节出现局部肿胀。结果显示，与治疗结束时接受载体处理的小鼠相比，每天两次分别接受 2.5、5 和 10 mg/kg 化合物 3 治疗 20 天的小鼠，其炎症评分分别改善了 27%、31% 和 44%（表 4；详见补充信息）。此外，组织学评分显示骨和软骨侵蚀的保护率达到32-39%。
化合物3 (VX-745) 和本研究中描述的其他类似物是已知的首批5-苯基-2-(苯硫基)-6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮类化合物作为p38抑制剂的实例。这些化合物在体外分离的PBMC和全血中均显示出对关键炎症介质IL-1β和TNFα产生的强效抑制作用。化合物3还在类风湿性关节炎动物模型中显示出抗炎功效，并被指定用于进一步开发。[5]

C19H9CL2F2N3OS

436.26

434.981

C, 52.31; H, 2.08; Cl, 16.25; F, 8.71; N, 9.63; O, 3.67; S, 7.35

209410-46-8

3038525

Yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

578.9±60.0 °C at 760 mmHg

303.9±32.9 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.692

4.79

72.56

0

5

3

28

762

0

ClC1C([H])=C([H])C([H])=C(C=1C1C(N=C([H])N2C=1C([H])=C([H])C(=N2)SC1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1F)F)=O)Cl

VEPKQEUBKLEPRA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H9Cl2F2N3OS/c20-11-2-1-3-12(21)17(11)18-14-5-7-16(25-26(14)9-24-19(18)27)28-15-6-4-10(22)8-13(15)23/h1-9H

5-(2,6-dichlorophenyl)-2-(2,4-difluorophenyl)sulfanylpyrimido[1,6-b]pyridazin-6-one

VD31745; VX 745; VX745; 209410-46-8; Neflamapimod; 5-(2,6-Dichlorophenyl)-2-((2,4-difluorophenyl)thio)-6H-pyrimido[1,6-b]pyridazin-6-one; Neflamapimod [USAN]; VRT-031,745; VRT 031745; VD 31745; VX-745; VRT-031745, VD-31745; VRT031745

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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