Zaprinast   中文名称: 扎普司特

Phosphodiesterase (PDE5)

在共表达 FLAG-hGPR35 和四种外源 Gα 蛋白的转染子中，扎普司特 (0.1、0.3、1、3、10、30 μM) 在 HEK293 细胞中以浓度依赖性方式诱导细胞内兴奋 [2]。 Zaprinast（100 μM；5 分钟）可以促进 HEK293T 细胞中人 GPR35a C 末端尾部五种不同细胞的磷酸化 [4]。

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活化的神经胶质细胞产生的促炎细胞因子反过来可能通过自分泌和旁分泌途径增强神经胶质细胞的免疫/炎症反应。NO/cGMP信号传导代表了活化神经胶质细胞的反应之一。我们研究了神经胶质细胞产生促炎细胞因子是否受到NO依赖性下游cGMP信号的影响。在混合星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养中，cGMP选择性磷酸二酯酶抑制剂Zaprinast（0.1 mM）增强了基础和LPS（1.0微克/毫升）诱导的TNF-α和IL-1β的分泌。Zaprinast还增强了LPS或IFN-γ（100 U/ml）诱导的NO产生，在小胶质细胞培养中，但在星形胶质细胞培养物中，Zaprinast增强了细胞因子、TNF-α和IL-1β以及NO的基础和IFN-γ诱导的产生。Zaprinas特的这种上调被蛋白激酶G抑制剂KT5823（1.0μM）部分抑制。LPS诱导的TNF-α、IL-1β和NO的产生被可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ（50μM）和KT5823抑制。混合胶质细胞培养物的免疫组织化学分析表明，LPS/IFN-γ诱导的iNOS表达和扎普利司特增强的iNOS表达仅限于小胶质细胞。Zaprinast增强了混合培养中星形胶质细胞和小胶质细胞中IFN-γ（200 U/ml）诱导的MHC II类分子的表达，但在缺乏小胶质细胞旁分泌TNF-α的纯星形胶质细胞中没有增强这种IFN-γ诱导的表达。总之，与cGMP/蛋白激酶G信号传导相关的扎普利司特可能通过活化的小胶质细胞增加TNF-α和IL-1β的产生来增强中枢免疫/炎症反应。[1]

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我们发现，众所周知的环鸟苷酸特异性磷酸二酯酶抑制剂Zaprinast是G蛋白偶联受体GPR35的激动剂。在我们的细胞内钙动员试验中，扎普司特强烈激活了大鼠GPR35（几何平均EC（50）值为16nM），而适度激活了人GPR35（几何形状平均EC（50中）值为840nM）。我们还证明，当在人胚胎肾293（HEK 293）细胞中异源表达时，GPR35充当扎普利司特的Galpha（i/o）和Galpha（16）偶联受体。这些发现将促进GPR35的研究和GPR35调节剂的药物发现。[2]

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Zaprinast可以促进人GPR35a C末端尾部五种不同氨基酸的磷酸化。消除人和小鼠GPR35 C末端尾部的羟基氨基酸可以防止氮磷司特诱导的磷酸化。hGPR35a和mGPR35 C末端尾部的磷酸化位点是Zaprinast诱导的arrestin-3募集所必需的。大鼠GPR35 C末端尾部的磷酸化位点是扎普利司特诱导的arrestin-3募集所必需的[4]。

Zaprinast（3 和 10 mg/kg；腹腔注射）可降低休斯盒测试中的探索活动，并增加高架十字迷宫 (EPM) 中的空间记忆 [5]。hr> 鸟苷特异性环核苷酸信号传导被认为在血管系统中起着保护作用；然而，环鸟苷酸合成可溶性鸟苷酸环化酶或环鸟苷磷酸降解磷酸二酯酶的选择性药理学调节对血管重塑的影响尚未得到彻底研究。在这项研究中，进行了大鼠颈动脉球囊损伤，并检查了可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂YC-1或环鸟苷酸依赖性磷酸二酯酶-V抑制剂Zaprinast的生长调节作用。YC-1或Zaprinast/扎普利司特可提高血管环鸟苷单磷酸含量，减少内侧壁和新生内膜细胞增殖，刺激内侧和新生内膜的细胞凋亡，并以类似的方式显著减轻新生内膜重塑。有趣的是，1H-[1,2,4]恶二唑[4,3-a]喹喔啉-1-酮对可溶性鸟苷酸环化酶的抑制未能显著改变新生内膜的生长，与单独治疗相比，与YC-1联合使用的扎普利司特没有改变任何参数。这些结果提供了新的体内证据，表明YC-1和扎普利司特通过抗有丝分裂和促凋亡作用抑制损伤诱导的血管重塑，并可能为治疗血管增殖性疾病提供有前景的治疗方法。[3]

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大鼠颈动脉球囊损伤模型[3]
图1显示了受伤14天后大鼠球囊损伤LCA的代表性显微照片。用空水凝胶治疗的受伤LCA（图1A）显示出同心且明显的新生内膜，具有清晰界定的内侧壁和弹性层。图1B显示了受伤的Zaprinast治疗的LCA，其新生内膜明显减弱，偶尔在内层附近出现一层薄薄的非同心层。图1C显示了受伤的YC-1治疗的LCA，同样显示了新生内膜发育的减少。图1D显示了用扎普利司特和YC-1联合治疗的受伤LCA，观察到新生内膜显著减少，但与单独使用扎普利司坦或YC-1治疗的切片相比，没有观察到相加效应。图1E显示了经ODQ处理的血管，其具有明显的同心新生内膜（与对照组相似），而图1F显示了ODQ和YC-1处理的血管。损伤后14天获得的相应组织形态计量学数据如图2所示。图2A、2C和2D清楚地显示，与溶媒对照组相比，用扎普司特、YC-1或扎普司特加YC-1治疗的受损LCA新生内膜生长显著且可比的衰减。与赋形剂对照组相比，用ODQ治疗的受损动脉的单独队列未能显示出新生内膜形成的可观察变化，暴露于ODQ和YC-1联合治疗的动脉未能完全逆转YC-1对新生内膜生长的抑制作用。有趣的是，与溶媒对照组相比，单独或与YC-1联合暴露于扎普利司特的LCA显示出明显的内侧壁扩大（图2B）。对所有治疗组LCA内外弹性层周长的分析显示，14天后没有显著差异（数据未显示）。

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在EPM测试中，与对照组相比，Zaprinast（10mg/kg）和rolipram（0.1mg/kg）均显著降低了第二天的潜伏期，而在PA测试中，只有rolipram。在休斯盒试验中，扎普利司特（10mg/kg）和罗利普兰（0.1mg/kg）均显著减少了进入新区域的次数和在新区域花费的时间。 结论：我们的研究表明，Zaprinast和rolipram都能增强EPM中的空间记忆，而rolipram在PA测试中似乎比Zaprinast具有更多的情绪记忆增强作用。在休斯盒试验中，扎普利司特和罗利普兰都降低了探索性活动，这可归因于药物的抗焦虑作用。[5]

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在mPEM测试中，Zaprinast和rolipram对学习和记忆的影响[5]
在采集期（训练；第1天）之前服用扎普利司特（3和10 mg/kg）和罗利普兰（0.05和0.01 mg/kg）时，各组的第一天潜伏期（TL1）没有显著差异（H=7.12；p=0.12，图1）。与对照组相比，Zaprinast（10mg/kg）和rolipram（0.1mg/kg）在第二天显著缩短了潜伏期（TL2）（Kruskal-Wallis H=16.36；分别为p<0.05和p<0.01）（图1）。在每个药物治疗组的TL1和TL2比较中，对照组、扎普利司特10 mg/kg组和罗利普兰（0.05和0.1 mg/kg）组的TL2显著降低（p<0.05），但扎普利司特3 mg/kg组之间的这一指标没有显著差异（p>0.05）（图1）。

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Zaprinast和rolipram在被动回避测试中对学习和记忆的影响[5]
当在被动回避试验的采集阶段之前服用扎普利司特（3和10 mg/kg）和罗利普兰（0.05和0.1 mg/kg）时，各组的第一天潜伏期没有显著差异[F（4.34）=2.12，p>0.05，图2]。与对照组相比，罗利泮（0.1mg/kg）显著延长了滞留潜伏期，扎普利司特具有部分作用；然而，当药物在采集期之前给药时，这种影响没有达到显著性[F（4.34）=4.64；p<0.01图2]。在比较每个药物治疗组的第一天和第二天潜伏期时，对照组、扎普利司特10mg/kg组和罗利普兰（0.05和0.1mg/kg）组的滞留潜伏期显著延长（p<0.05），但扎普利司特3mg/kg组之间的这一指标没有显著差异（p>0.05；图2）。

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Zaprinast和rolipram对Hughes盒中探索活动的影响[5]
在Hughes框中评估新侧的条目总数[F（4.29）=4.86，p=0.0049；图3A]和在新侧花费的总时间[F（42.9）=4.25，p=0.009，图3B]后，组间存在显著差异。在试验前给药时，与休斯试验箱中的对照组相比，扎普利司特（10mg/kg）和罗利普兰（0.1mg/kg）均显著减少了新侧的进入（分别为p<0.01和p<0.05；图3A）。Zaprinast（3和10 mg/kg）和rolipram（0.1 mg/kg）也显著缩短了休斯盒中新侧的时间（p<0.05；图3B）。[5]
这项研究表明，PDE5抑制剂Zaprinast（10mg/kg）和PDE4抑制剂rolipram（0.1mg/kg）显著降低了EPM测试中的第二天潜伏期，但与对照组小鼠相比，只有rolipram在PA测试中显著增加了第二天的潜伏期。在休斯盒试验中，Zaprinast/扎普利司特（10mg/kg）和罗利普兰（0.1mg/kg）均显著减少了进入新区域的次数和在新区域停留的时间。

混合神经胶质细胞或纯星形胶质细胞的融合培养物在无血清培养基中用试剂处理，与星形胶质细胞层分离的小胶质细胞以1.0×105个细胞/cm2的速度接种，静置24小时，然后用含有10%FBS的DMEM中的试剂处理。这些混合和纯的神经胶质细胞培养物用Zaprinast预处理24小时，然后用LPS或IFN-γ刺激。为了抑制LPS诱导的NO产生和NO依赖性cGMP产生，添加了L-NMMA（NG-单甲基-L-精氨酸）和ODQ（1H-[1,2,4]恶二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮）。KT5823用于检测蛋白激酶G活性对扎普利司特作用的影响。对照培养物含有0.1%（v/v）的载体。[1]

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发现Zaprinast作为hGPR35的激动剂。（A）通过蛋白质印迹证实FLAG-hGPR35在HEK293细胞中的表达。（B）将瞬时共表达受体（FLAG-hGPR35或野生型hGPR35）和/或Gα蛋白（Gqs5、Gqi5、Gqo5和Gα16）的HEK293细胞装载Fura-2，然后暴露于扎普司特（虚线；添加扎普司特）。剂量-反应曲线平行显示。FLAG-hGPR35和野生型hGPR35的EC50值分别为5.2和1.9μM。（C）GPR35在HEK293细胞中充当扎普利司特的Gαi/o-和Gα16偶联受体。将暂时共表达FLAG-hGPR35和Gα蛋白（G qs5、G qi5、G qo5或Gα16）的Fura-2负载的HEK293细胞暴露于扎普利司特（虚线；添加扎普利司特）。[2]
Zaprinast对大鼠GPR35的影响。将瞬时共表达大鼠或人GPR35和Gqi5的Fura-2-load HEK293细胞暴露于扎普利司特，并测量细胞内钙动员。浓度-响应曲线来自三个独立的实验，每个点确定四份。[2]

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细胞在裂解前用Zaprinast（Zap）或双羟萘酸（Pam）处理5分钟。在加入Zap之前，将CID-2745687处理的细胞（Zap+CID）与CID-2744587预孵育15分钟。定量（下图）显示了[32P]掺入在载体处理细胞上的平均倍数变化，与载体相比，通过对n=3个独立实验±SD的放射自显影照片进行密度分析测量，∗p<0.05，∗p<0.01，∗∗p<0.001；在Tukey多重比较后测的单因素方差分析中，与扎普利司特相比，#p<0.05，##p<0.01，##p<0.001。（dox=多西环素；Zap=100μM扎普利司特；CID=10μM CID-2745687；Pam=100 nM双羟萘酸）。G蛋白偶联受体35。[4]

Zaprinast可以促进人GPR35a C末端尾部五种不同氨基酸的磷酸化。LC-MS/MS鉴定了扎普利司特刺激后hGPR35a C末端尾部的五个磷酸化位点。 [4]

消除人和小鼠GPR35 C末端尾部的羟基氨基酸可以防止Zaprinast诱导的磷酸化。人（上）和小鼠（下）GPR35的C末端序列以一个字母的氨基酸代码表示。用灰色突出显示和框起来的氨基酸突变为丙氨酸。A，标有星号的残基是在hGPR35a-HA上进行的LC-MS/MS中发现的磷酸化残基。显示了显示[32P]掺入（B）人或（C）小鼠WT或潜在磷酸化缺陷的GPR35突变体（PDM）的代表性放射自显影图。在裂解之前，用100μM扎普利司特（Zap）刺激细胞5分钟。 [4]

hGPR35a和mGPR35 C末端尾部的磷酸化位点是Zaprinast诱导的arrestin-3募集所必需的。A、 在hGPR35a-eYFP和mGPR35-eYFP中，突出显示的氨基酸残基（颜色）单独或以指定的组合突变为丙氨酸。B，扎普利司特浓度-hGPR35a-YFP-WT的反应曲线（灰色圆圈）；Ser287Ala（红色圆圈）；Ser294Ala（紫色圆圈）；Ser300Ala（蓝色圆圈）；Ser303Ala（绿色圆圈）；Thr307Ala（橙色圆圈）；Ser300Ala/Ser303Ala（蓝色/绿色圆圈）；Ser303Ala/Thr307Ala（绿色/橙色圆圈）；以及arrestin-3相互作用测定中的磷酸化缺陷突变体（黑圈）。C，扎普利司特治疗刺激的最大BRET。 [4]

大鼠GPR35 C末端尾部的磷酸化位点是Zaprinast诱导的arresten-3募集所必需的。A、 显示了大鼠GPR35的C末端序列。在所示组合（A）中，rGPR35-eYFP中突出显示的氨基酸残基（颜色）突变为丙氨酸。B，扎普利司特浓度-rGPR35-eYFP的响应曲线（黑圈）；完全磷缺乏型（PDM）（黑色方块）和与图（a）中a-D相对应的丙氨酸突变组合（红色、紫色、蓝色、橙色，如arrestin-3相互作用测定所示。C，（B）中形式的氮磷司特治疗刺激的最大BRET。 [4]

激动剂诱导的hGPR35a内化需要磷酸化和抑制蛋白。A、 在稳定表达每种构建体的亲本HEK293细胞（亲本）中用不同浓度的Zaprinast处理45分钟后，测量hGPR35a-eYFP和hGPR35a-PDM-eYFP内化，或在编辑为缺乏arrestin-2和arrestin-3表达的HEK293细胞基因组中检测hGPR35a eYFP（Arr-null）内化。 [4]

GPR35磷酸位点特异性抗血清的制备和鉴定。文中描述的肽和实验程序用于在兔子体内产生免疫反应。然后将这些抗血清用于未转染或转染的HEK293T细胞裂解物的免疫印迹，以表达（A）hGPR35a-eYFP或（B）mGPR35-eYFP。在产生裂解物之前，用与图1中相同范围的配体和组合处理细胞。使用的抗血清是hGPR35a-pSer300/pSer303（A）或mGPR35-Ser298/pSer301（B）。对表达hGPR35a-eYFP（C-E）、hGPR35a-PDM-eYFP、mGPR35-eYFP（C和E）或mGPR35-PDM-eYFP的细胞裂解物进行了进一步的研究，其中细胞用载体、Zaprinast（Zap）、化合物101（101）或Zaprinast和化合物101的组合进行了预处理。 [4]

GPR35磷酸位点特异性抗血清作为激动剂激活的完全成熟的GPR35的生物传感器。如图1A所示，能够表达hGPR35a-HA（A）或mGPR35-HA（B）的细胞要么未被诱导（−dox），要么被多西环素（+dox）诱导，然后用载体（veh）或Zaprinast（zap）处理。然后将这些细胞用于免疫细胞化学研究，采用hGPR35a-pSer300/pSer303或mGPR35-pSer298/pSer301（左图）（Alexa Fluor 488）。样品用核染料DAPI复染（中心图）。还显示了亮场图像（右面板）。比例尺=10μm。显示了代表性图像。mGPR35、小鼠GPR35[4]。

动物/疾病模型： 7岁雄性BALB/c ByJ近交系小鼠[5]
剂量： 3和10 mg/kg
给药途径： 腹腔注射；首次给药前60分钟
实验结果： 在EPM测试中，10 mg/kg剂量组第二天的潜伏期较对照组显著缩短。10 mg/kg剂量组在休斯箱新侧停留的时间也显著缩短。

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给药方案[3]
气球损伤后立即局部给药。将200 μl含有1 mg扎普司特、YC-1或特异性sGC抑制剂1H-[1,2,4]恶二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮 (ODQ)或其组合的25%共聚物凝胶溶液（Pluronic F-127；巴斯夫）溶于50 μl DMSO中，注射到暴露的LCA外膜。对照组动物注射200 μl含有50 μl DMSO的凝胶。动物缝合后恢复，直至安乐死。药物给药[5]：扎普司特和罗利普兰溶于添加少量DMSO的生理盐水中。所有药物均新鲜配制，给药剂量为每10 g体重0.1 ml。对照组注射等体积的溶剂。在mEPM（n=6）和PA测试（n=7）的首次训练（习得阶段，第1天）前60分钟和30分钟，分别腹腔注射扎普利司特（3和10 mg/kg）、罗利普兰（0.05和0.1 mg/kg）或赋形剂。在探索行为测试（n=6）前60分钟和30分钟，分别腹腔注射扎普利司特（3和10 mg/kg）、罗利普兰（0.05和0.1 mg/kg）或赋形剂。所有动物均在行为测试开始前单次注射。每组动物数量为6至7只。每次测试均使用不同的动物。每种药物的有效剂量均根据之前的行为学和神经化学研究结果选择。

[1]. Zaprinast, an inhibitor of cGMP-selective phosphodiesterases, enhances the secretion of TNF-alpha and IL-1beta and the expression of iNOS and MHC class II molecules in rat microglial cells. J Neurosci Res. 2002 Feb 1;67(3):411-21.

[2]. Zaprinast, a well-known cyclic guanosine monophosphate-specific phosphodiesterase inhibitor, is an agonist for GPR35. FEBS Lett. 2006 Sep 18;580(21):5003-8. Epub 2006 Aug 17.

[3]. Keswani AN , et al The cyclic GMP modulators YC-1 and zaprinast reduce vessel remodeling through antiproliferative and proapoptotic effects. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2009 Jun;14(2):116-24.

[4]. Agonist-induced phosphorylation of orthologues of the orphan receptor GPR35 functions as an activation sensor. J Biol Chem. 2022 Mar;298(3):101655.

[5]. Zaprinast and rolipram enhances spatial and emotional memory in the elevated plus maze and passive avoidance tests and diminishes exploratory activity in naive mice. Med Sci Monit Basic Res. 2014 Jul 24:20:105-11.

5-(2-丙氧基苯基)-2,3-二氢三唑并[4,5-d]嘧啶-7-酮是三唑并嘧啶类化合物的成员。

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此外，本研究表明，扎普利司特可诱导胶质细胞活性增强，表达iNOS和MHC II类分子，这可能与促炎细胞因子的产生有关。正如我们通过三重免疫组化所证实的，iNOS的表达仅限于小胶质细胞。这一发现与受刺激的纯星形胶质细胞无法检测到NO的产生相一致。与我们的结果相反，其他研究报道iNOS可能在星形胶质细胞中表达（Galea等人，1992；Vincent等人，1998；Akama和Van Eldik，2000）。Possel等人。 (2000)年的研究也表明iNOS仅在小胶质细胞中表达，并提出实验设计和方案、培养条件以及小胶质细胞污染可能导致培养或体内星形胶质细胞表达iNOS和产生NO。在本研究中，扎普司特仅在小胶质细胞中增强LPS/IFN-γ诱导的iNOS表达，这种上调可能由扎普司特诱导的TNF-α和IL-1β增加介导。尽管混合培养中的星形胶质细胞已被LPS/IFN-γ和微胶质细胞因子刺激，但迄今为止尚未观察到星形胶质细胞表达iNOS。
星形胶质细胞和微胶质细胞均可被诱导发挥抗原呈递细胞功能（Shrikant和Benveniste，1996），且IFN-γ已被证明是诱导大多数细胞类型中MHC II类分子表达的最有效因子（Rohn等，1996）。在本研究中，混合培养中的星形胶质细胞可能受到微胶质细胞分泌的旁分泌因子的影响。IFN-γ在混合培养和纯培养中均能诱导星形胶质细胞和微胶质细胞表达MHC II类分子，而扎普利司特则增强了IFN-γ诱导的混合培养和纯微胶质细胞培养中星形胶质细胞和微胶质细胞的MHC II类分子表达。然而，在缺乏小胶质细胞旁分泌通讯的纯星形胶质细胞中，扎普司特并未增强MHC II类分子的表达。单独的TNF-α对MHC II类分子的表达没有影响，但能增强IFN-γ最初诱导的表达（Benveniste等，1989；Vidovic等，1990）。因此，扎普司特增加的小胶质细胞TNF-α分泌似乎通过自分泌和旁分泌机制促进了IFN-γ启动的MHC II类分子表达的增强。[1]

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在本研究中，我们证明了扎普司特（一种cGMP-PDE抑制剂）能诱导共表达GPR35和G qi5、G qo5或Gα16的细胞内钙动员。在表达GPR35的转染细胞中，扎普司特诱导细胞内钙动员是由于其选择性激活了GPR35-Gα（G_qi5、G_qo5或Gα16）信号通路，而非抑制磷酸二酯酶（PDE5、PDE6、PDE9、PDE10和PDE11）、直接激活Gα蛋白或非选择性刺激内源性GPCR-Gα信号通路。这是因为GPR35和Gα蛋白（G_qi5、G_qo5或Gα16）的表达是扎普司特发挥此作用的必要前提条件（1, 3）。因此，这些观察结果强烈提示扎普司特是GPR35的激动剂。在共表达rGPR35和Gqi5的转染细胞中，扎普司特能有效诱导细胞内钙动员，EC50值为16 nM（图3），而扎普司特对PDE的作用较弱或中等（见第1节）。此外，选择性PDE5/PDE6抑制剂T-0156和T-1032对共表达GPR35和Gqi5的转染细胞没有影响（图4B）。而且，8Bromo-cGMP在我们的实验中也没有诱导细胞内钙动员（图4B）。这些结果也支持我们的结论。
最近的一些报道表明，扎普司特可能具有除PDE抑制以外的其他药理活性。例如，Wibberley等人。研究表明，扎普司特在调节尿道括约肌张力方面发挥着不依赖于一氧化氮（NO）的作用。Yoon等人报道，鞘内注射扎普司特在大鼠福尔马林试验中具有镇痛作用，且该作用与NO-cGMP-钾通道通路无关。由于cGMP磷酸二酯酶（PDE）深度参与NO-cGMP信号通路（NO激活可溶性鸟苷酸环化酶以提高细胞内cGMP水平，而cGMP PDE通过降解cGMP终止NO/cGMP依赖性信号），扎普司特的这些不依赖于NO/cGMP的作用可能由GPR35激活介导。已有大量关于扎普司特抑制PDE的药理学研究报道发表。然而，由于本研究揭示了扎普司特的GPR35激动剂活性，因此可能需要使用不同结构的选择性PDE抑制剂重复这些实验。
值得注意的是，扎普司特是西地那非（伟哥™）的先导化合物，这表明扎普司特具有良好的药物设计化学性质。从与扎普司特相关的化合物中，或许可以筛选出高效且选择性的hGPR35激动剂和/或拮抗剂，且这些化合物不具有磷酸二酯酶抑制活性。事实上，我们已经在扎普司特衍生物中鉴定出一些具有不同效力和物种选择性的GPR35激动剂（Taniguchi等人，专利申请WO2005085867(A2)），这表明扎普司特可能作为先导化合物，用于开发调节GPR35活性的药物。
在本文审稿过程中，Wang等人……有报道称犬尿酸是GPR35的天然配体。他们独立地证明，使用犬尿酸，GPR35可作为Gαi/o和Gα16偶联受体发挥作用，这与我们使用扎普司特（Zaprinast）获得的结果一致。然而，犬尿酸对GPR35的亲和力相对较低（EC50值为7.4–39.2 μM）。因此，可以预期存在其他具有更高亲和力的天然配体。由于GPR35与P2Y家族的GPCR具有同源性，而扎普司特是一种黄嘌呤衍生物，我们的发现可能为发现GPR35的天然配体提供线索。[2]

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本文中，我们证明环磷酸鸟苷（cGMP）依赖性PDE-V抑制剂扎普司特（Zaprinast）通过抑制血管细胞增殖和诱导细胞凋亡，在损伤后保护血管免受过度生长。与 sGC 刺激剂 YC-1 类似的结果表明，YC-1 和扎普司特在创伤后血管生长反应中通过平行通路发挥作用。此外，同时使用 YC-1 和扎普司特未观察到明显效应，表明在这些实验条件下，这些药物以不依赖于 sGC 的方式发挥作用。这些新证据为环磷酸鸟苷 (cGMP) 调节剂 YC-1 和扎普司特治疗血管增生性疾病的机制和潜在治疗应用提供了新的见解。[3] G 蛋白偶联受体 35 (GPR35) 的特性尚不明确，但已发现其在包括下肠道炎症和疼痛在内的多个领域发挥着多种作用。新型试剂和工具的开发将极大地促进对 GPR35 在健康和疾病状态下功能的分析。在此，我们利用质谱、诱变和[32P]正磷酸盐标记技术，鉴定出人GPR35a C端尾部的五个羟基氨基酸在受体激动剂结合后均发生磷酸化，并且除Ser294外，每个羟基氨基酸均参与与arrestin-3的相互作用，从而抑制G蛋白偶联受体的进一步信号传导。我们发现Ser303是此类相互作用的关键；与人GPR35a残基303对应的丝氨酸在小鼠和大鼠GPR35与arrestin-3的相互作用中也起主导作用。我们还证实，人GPR35a和小鼠GPR35的完全磷酸化位点缺失突变体无法与arrestin-3有效相互作用，并且人GPR35a的磷酸化位点缺失突变体在激动剂处理后无法从细胞表面内化。即使在稳定表达GPR35物种同源蛋白的细胞中，也发现相当一部分表达的蛋白是未成熟的。最终，针对人GPR35a中Ser303（小鼠为Ser301）区域的磷酸化位点特异性抗血清仅能识别GPR35的成熟形式，并且在免疫印迹和免疫细胞化学研究中均能有效检测受体的激活状态。此类抗血清可作为药物发现和靶点验证项目中评估靶点结合情况的有用工具。[4] 扎普司特（Zaprinast）已被用于抑制PDE5，当在训练后立即以10 mg/kg（腹腔注射）的剂量给予扎普司特时，可改善大鼠在物体识别任务中的长期记忆表现。先前的研究还表明，扎普司特可逆转NOS抑制剂7-硝基吲唑在大鼠物体识别任务中引起的物体记忆缺陷[16]。然而，扎普司特未能逆转老年大鼠在该任务中的记忆缺陷。动物研究表明，PDE5抑制剂具有改善长期记忆早期巩固过程的潜力，尽管PDE5抑制剂可能不影响空间信息。这种记忆改善可能由中枢cGMP水平升高介导。
我们的文献检索发现，一些研究探讨了扎普司特和罗利普兰对被动回避测试（PA）中记忆的影响，但没有研究探讨扎普司特和罗利普兰对高架十字迷宫测试（EPM）中记忆或休斯箱测试中探索行为的影响。本研究旨在探讨磷酸二酯酶-5抑制剂扎普司特和磷酸二酯酶-4抑制剂罗利普兰对未经训练的小鼠在EPM中的空间记忆、在PA中的情绪记忆以及在休斯箱测试中的探索行为的影响。 [5]本研究表明，PDE 5抑制剂扎普司特和PDE 4抑制剂罗利普兰均能增强高架十字迷宫（EPM）测试中的空间记忆，而罗利普兰在感知觉测试（PA）中对情绪记忆的增强作用优于扎普司特。扎普司特和罗利普兰均能降低休斯箱测试中的探索行为，这可能与其焦虑效应有关。我们的结果证实，扎普司特和罗利普兰对学习和记忆的影响似乎取决于测试方法，未来应使用不同的PDE抑制剂和不同的认知测试方法进行研究，以验证我们的发现。[5]

C13H13N5O2

271.27462

271.106

C, 57.56; H, 4.83; N, 25.82; O, 11.80

37762-06-4

135399235

Off-white to pink solid powder

1.484g/cm3

406.3±47.0 °C at 760 mmHg

237-238ºC dec.

199.5±29.3 °C

0.0±0.9 mmHg at 25°C

1.719

0.17

96.55

2

5

4

20

400

0

CCCOC1=CC=CC=C1C1=NC(=O)C2=NNNC2=N1

REZGGXNDEMKIQB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H13N5O2/c1-2-7-20-9-6-4-3-5-8(9)11-14-12-10(13(19)15-11)16-18-17-12/h3-6H,2,7H2,1H3,(H2,14,15,16,17,18,19)

5-(2-propoxyphenyl)-2,6-dihydrotriazolo[4,5-d]pyrimidin-7-one

zaprinast; 37762-06-4; Zaprinastum; M&B 22948; Zaprinastum [INN-Latin]; M and B 22948; M&B 22,948; Zaprinast [INN:BAN];

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~62.5 mg/mL (~230.40 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。