4-IPP

4-IPP (4-iodo-6-phenylpyrimidine) is a specific, irreversible suicide substrate inhibitor of macrophage migration inhibitory factor (MIF). [1]

4-IPP 是 MIF 的一种漂移自杀底物，它通过与 MIF 共价且不可逆地结合来抑制 MIF 的生物学活性 [1]。4-IPP 阻断 MIF 与硫氧还蛋白反应蛋白-p65 复合物的相互作用，从而抑制 RANKL 诱导的 p65 磷酸化和核转位 [1]。4-IPP 促进骨细胞介导的破骨细胞生成，并抑制 NF-κB 受体激活配体 (RANKL) 诱导的破骨细胞生成。4-IPP (0.5 - 200 μM；24-72 小时) 以剂量依赖的方式抑制破骨细胞生成 [1]。4-IPP (5 - 20 μM)； 5[1] 矿化并形成骨骼。

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4-IPP 以剂量依赖的方式抑制骨髓巨噬细胞 (BMM) 中 RANKL 诱导的破骨细胞生成。在 5、10 和 20 μM 的浓度下，它显著减少了 TRAP 阳性多核破骨细胞的数量和平均面积，并减少了足突肌动蛋白带的数量。具有 5-10 个或 >10 个细胞核的破骨细胞的分布也减少了。[1]
4-IPP 抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性。将 BMM 来源的破骨细胞重新接种到骨盘上，并用 5、10 或 20 μM 的 4-IPP 处理 72 小时，结果显示骨吸收陷窝面积呈剂量依赖性减少。 [1] 4-异丙基磷酸酯 (4-IPP) 促进成骨细胞分化和矿化。用 2.5、5 或 10 μM 的 4-IPP 处理原代颅骨成骨细胞 7 天后，ALP 阳性细胞数量呈剂量依赖性增加。成骨分化 21 天后，观察到矿化骨结节形成（茜素红 S 染色）和钙沉积呈剂量依赖性增加。[1] 从机制上讲，4-IPP 抑制 RANKL 诱导的早期 NF-κB 信号通路。在骨髓单核细胞 (BMM) 中，20 μM 的 4-IPP 降低了 IκBα 和 p65 的磷酸化水平，并阻止了 NF-κB p65 的核转位。这导致晚期破骨细胞标志基因（如 NFATc1、CTSK、TRAP、c-Fos、TCIRG1 和 DC-STAMP）在 mRNA 和蛋白水平上的表达受到抑制。 [1]在成骨细胞中，4-IPP（2.5、5、10 μM）增强了成骨培养基诱导的p65去磷酸化，从而减轻了NF-κB对骨形成的抑制作用。21天后，Runx2蛋白表达呈剂量依赖性增加，成骨细胞标志基因Runx2、ALP、OCN和OPN的mRNA表达也增加。[1]利用RAW264.7细胞和BMMs中的免疫共沉淀实验发现，RANKL刺激后，MIF与TXNIP和p65形成复合物。用4-IPP（20 μM）处理可抑制这种相互作用。 [1]
4-IPP在浓度高达20 μM时，对骨髓单核细胞(BMM)未显示出明显的细胞毒性，作用时间分别为24小时和72小时。计算得到的72小时IC50值为104.3 μM。在原代颅骨成骨细胞中，浓度高达10 μM时，作用时间分别为24小时和72小时，未观察到不良反应。计算得到的72小时IC50值为85.0 μM。[1]

4-异丙基丙烯醛（4-IPP）（1 mg/kg、5 mg/kg；每2天一次；持续8周）可促进成骨细胞骨形成并降低破骨细胞活性，从而改善雌性动物因食物匮乏引起的骨丢失。[1]

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在钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型中，皮下注射4-IPP（1 mg/kg或5 mg/kg，每2天一次，持续2周）可剂量依赖性地保护骨骼免受破坏。μCT分析显示，与载体对照组相比，4-IPP治疗组的骨体积（BV/TV）更高，骨孔隙率更低。组织学评估证实，溶骨性骨破坏减少，TRAP阳性破骨细胞数量减少，且破骨细胞表面积/骨表面积（OcS/BS）降低。免疫荧光染色显示，4-IPP治疗组小鼠骨表面成骨细胞标志物Runx2的表达更高。 [1] 在卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型中，每2天腹腔注射1 mg/kg或5 mg/kg的4-异丙基丙烯醛（4-IPP），持续8周，可部分阻止骨量下降和骨小梁微结构的恶化。μCT分析显示，与OVX对照组相比，4-IPP治疗组维持了骨体积/组织体积比（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th），并降低了骨小梁间距（Tb.Sp）。组织形态计量学分析显示，TRAP阳性破骨细胞数量减少，破骨细胞/骨小梁比（OcS/BS）降低。4-IPP治疗组小鼠血清中骨吸收标志物CTX-1水平降低，而骨形成标志物P1NP水平升高。免疫荧光染色显示骨表面Runx2和OCN表达增强。 qPCR分析显示，4-IPP处理后，骨组织中破骨细胞基因（NFATc1、CTSK、TRAP）表达降低，成骨细胞基因（Runx2、ALP、OCN、OPN）表达升高。[1]

细胞毒性试验[1]
细胞类型： BMMs
测试浓度： 0.5 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、100 μM、200 μM（24 小时）、100 μM、200 μM（24 小时、72 小时）抑制 RANKL 诱导的破骨细胞吸收和骨吸收[1]。
孵育时间： 24 小时、72 小时
实验结果： 以剂量依赖的方式抑制破骨细胞生成。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型：骨髓巨噬细胞
测试浓度：5 μM、10 μM、20 μM
孵育时间：1天、3天、5天
实验结果：抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收。

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从6周龄小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓巨噬细胞（BMM）。将细胞以 5×10⁴ 个/孔的密度接种于 24 孔板中，培养基为含 40 ng/ml M-CSF 和 50 ng/ml RANKL 的 α-MEM，并分别添加或不添加不同浓度的 4-IPP（5、10、20 μM），培养 5-7 天。每隔一天更换一次培养基。培养结束后，固定细胞并进行 TRAP 活性染色。对 TRAP 阳性的多核破骨细胞（≥5 个细胞核）进行计数和定量。[1] 在骨吸收实验中，用 RANKL 刺激 BMM 细胞 3 天，然后将其解离并重新接种到已灭菌的骨片上。6 小时后，用不同浓度的 4-IPP（5、10、20 μM）处理细胞，继续培养 72 小时。随后通过超声处理去除细胞，并使用扫描电子显微镜对吸收陷窝进行成像。使用 ImageJ 软件测量吸收面积。[1]
对于足突肌动蛋白带染色，将 BMM 来源的破骨细胞固定、透化，并与罗丹明标记的鬼笔环肽孵育。细胞核用 DAPI 复染。使用共聚焦显微镜采集荧光图像，并定量肌动蛋白带的数量。[1]
从 2 日龄小鼠中分离出原代颅骨成骨细胞。对于成骨诱导，将汇合的细胞培养在成骨诱导培养基（含地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸）中，培养基中添加或不添加 4-异丙基磷酸酯（2.5、5、10 μM）。对于 ALP 染色，细胞培养 7 天。对于矿化（茜素红S）染色，细胞培养21天。钙沉积物通过十六烷基氯化吡啶提取并在550 nm处测量吸光度值进行定量。[1]
对于细胞毒性试验，将骨髓单核细胞（BMM）或颅骨成骨细胞接种于96孔板中，并用递增浓度的4-异丙基焦磷酸（0.5至200 μM）处理24或72小时。使用CCK-8试剂评估细胞活力，并在450 nm处读取吸光度值。[1]
对于蛋白质印迹分析，使用RIPA裂解缓冲液提取总细胞蛋白。蛋白质经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜上，用特异性一抗（针对NF-κB p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、c-Fos、NFATc1、TRAP、Runx2等）进行孵育，随后用HRP标记的二抗进行孵育。反应通过化学发光法检测。[1]
为了进行NF-κB p65核转位的免疫荧光染色，将野生型或MIF-KO BMMs细胞预先用20 μM 4-IPP处理2小时（有或无4-IPP），然后用RANKL刺激20分钟。细胞固定、透化后，用抗p65抗体染色，随后用Alexa Fluor 546标记的二抗染色。细胞核用DAPI复染。计数核内p65阳性细胞的百分比。 [1]
对于共免疫沉淀 (Co-IP)，使用不含 SDS 的 RIPA 裂解缓冲液提取 RAW264.7 细胞或 BMM 的总细胞蛋白。将裂解液与特异性抗体（针对 TXNIP 或 p65）和蛋白 G-琼脂糖珠孵育过夜。洗涤结合的蛋白复合物，煮沸，然后用相应的抗体（针对 MIF、TXNIP 和 p65）进行 Western blot 分析。[1]
对于实时定量 PCR (qPCR)，使用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。以 1 μg 总 RNA 为模板合成第一链 cDNA。使用 SYBR Green Master Mix 和针对 NFATc1、CTSK、TRAP、c-Fos、TCIRG1、DC-STAMP、Runx2、ALP、OCN、OPN 和 GAPDH（作为内参）的基因特异性引物进行 qPCR。采用 2⁻ΔΔCt 法分析数据。[1]

动物/疾病模型： 8周龄C57BL/6J雄性小鼠[1]
剂量： 1 mg/kg，5 mg/kg
给药途径： 腹腔注射（ip）；每2天一次；持续8周
实验结果： 缓解卵巢切除术（OVX）诱导的骨质疏松症。

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钛颗粒诱导的颅骨骨溶解模型：使用8周龄雄性C57BL/6小鼠。将钛颗粒（30 mg，溶于PBS）植入颅骨中缝骨膜下。每2天皮下注射4-异丙基丙烯酰胺（4-IPP）（1 mg/kg或5 mg/kg，溶于PBS）或PBS（载体），持续2周。实验结束时，取出颅骨进行μCT和组织学分析。[1]
卵巢切除术（OVX）诱导的骨质疏松模型：8周龄雌性C57BL/6小鼠接受双侧卵巢切除术（OVX）或假手术。OVX术后1周，每2天腹腔注射4-异丙基苯基丙酮（溶于PBS，剂量为1 mg/kg或5 mg/kg）或PBS（溶剂对照），持续8周。实验结束时，取出胫骨和股骨进行μCT、组织学和qPCR分析。收集血清用于ELISA检测CTX-1和P1NP。[1]

在体内研究中，小鼠接受 1 mg/kg 或 5 mg/kg 剂量的 4-IPP 治疗（每 2 天皮下注射一次，持续 2 周；或每 2 天腹腔注射一次，持续 8 周）后，未观察到不良反应或死亡。[1]

[1]. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) inhibitor 4-IPP suppresses osteoclast formation and promotes osteoblast differentiation through the inhibition of the NF-κB signaling pathway. FASEB J. 2019 Jun;33(6):7667-7683.

4-碘-6-苯基嘧啶是一种嘧啶化合物，其碘原子位于4位，苯基取代基位于6位。它可作为巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂、抗肿瘤剂和细胞凋亡诱导剂。它属于嘧啶类化合物、联芳基化合物和有机碘化合物。

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4-IPP（4-碘-6-苯基嘧啶）是一种特异性、不可逆的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）自杀性底物抑制剂。它与MIF共价且不可逆地结合，从而抑制其生物活性。[1]
本研究表明，使用4-IPP进行MIF的药理学抑制可用于调节骨代谢，其机制是通过平衡破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成。它显示出治疗病理性溶骨性疾病（例如，磨损颗粒引起的骨溶解）和绝经后骨质疏松症的治疗潜力。[1]
其机制涉及抑制MIF-TXNIP-p65轴，该轴在破骨细胞形成过程中调节RANKL诱导的NF-κB信号通路。在破骨细胞中，4-IPP阻止MIF与TXNIP-p65复合物的相互作用，阻断p65的磷酸化和核转位，从而抑制NFATc1及其下游破骨细胞生成基因的表达。在成骨细胞中，4-IPP抑制NF-κB信号通路（NF-κB是已知的骨形成抑制因子），从而增强成骨细胞的分化和矿化作用。[1]

C10H7IN2

282.08

281.965

41270-96-6

817368

White to yellow solid powder

1.728±0.06 g/cm3

380.2±30.0 °C

2.748

25.78

0

2

1

13

157

0

ZTCJXHNJVLUUMR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C10H7IN2/c11-10-6-9(12-7-13-10)8-4-2-1-3-5-8/h1-7H

4-Iodo-6-phenyl-pyrimidine

4 IPP 4IPP 4-IPP

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~354.51 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。