5-BDBD

P2X4 Receptor
P2X4 receptor (P2X4R) [1]
P2X4 receptor (P2X4R) [2]

5-BDBD 的 IC50 为 0.75 μM，它以浓度依赖的方式抑制表达 rP2X4R 的 HEK293 细胞中 10 μM ATP 产生的电流 [1]。5-BDBD 使 EC50 从 4.7 μM 增加到 15.9 μM，从而使 ATP 浓度-反应曲线右移 [1]。P2X1R、P2X2aR、P2X2bR、P2X3R、P2X4R 和 P2X7R 均可使用 5-BDBD 进行区分 [1]。P2X 受体 (P2XR) 是一类 ATP 门控离子通道，表达于多种可兴奋和非可兴奋细胞中。尽管过去几十年对这些受体的结构和功能的研究取得了巨大进展，但目前仍然缺乏针对 P2XR 亚型（尤其是 P2X4R）的特异性强效拮抗剂。本研究详细探讨了P2X4R拮抗剂5-(3-溴苯基)-1,3-二氢-2H-苯并呋喃并[3,2-e]-1,4-二氮杂卓-2-酮（5-BDBD）对大鼠P2X4R介导的ATP诱导电流的影响，并比较了其对其他大鼠P2XR的特异性。研究发现，5-BDBD是一种强效的P2X4R拮抗剂，在ATP刺激前2分钟及刺激期间应用时，其IC50值为0.75 μM。此外，在10 μM浓度下，5-BDBD不影响ATP诱导的P2X2aR、P2X2bR和P2X7R电流幅度或受体脱敏模式。然而，浓度为 10 μM 的 5-BDBD 可分别抑制 P2X1R 和 P2X3R 门控电流 13% 和 35%，而浓度为 0.75 μM 的 5-BDBD 则无此作用。此外，研究人员在对大鼠海马切片进行的长时程增强 (LTP) 实验中研究了 5-BDBD 的作用，发现该拮抗剂可部分降低 LTP，而这种反应被认为部分由内源性 P2X4R 介导。这些结果表明，5-BDBD 可用于研究中枢神经系统中 P2X4R 的内源性效应，并且当 P2X4R 和其他 P2XR 在同一组织中共表达时，该拮抗剂可以区分它们[1]。

---

在 HEK293 细胞中表达的大鼠 P2X4R (rP2X4R) 上，5-BDBD 以浓度依赖性方式抑制 ATP (10 µM) 诱导的电流，当预先施加 2 分钟并与 ATP 一起施加时，IC50 为 0.75 ± 0.27 µM。用 10 µM 5-BDBD 洗脱 5 分钟后，电流几乎完全恢复 [1]。
预先施加 1 µM 5-BDBD 2 分钟后，rP2X4R 的 ATP 浓度-反应曲线右移，ATP 的 EC50 值从 4.7 ± 1.8 µM 增加到 15.9 ± 3.9 µM，但最大反应没有显著改变（对照组：2.5 ± 0.6 nA，5-BDBD 处理组：2.0 ± 0.6 nA）[1]。
在 10 µM 浓度下，5-BDBD 不影响表达大鼠 P2X2aR、P2X2bR 或 1 mM ATP 诱导的 HEK293 细胞中电流的峰值幅度或脱敏模式（P2X2a/bR 为 10 µM，P2X7R 为 1 mM）。 P2X7R。在相同浓度下，该化合物对P2X3R门控电流产生适度但显著的抑制作用（抑制率为35.9 ± 10.1%），对P2X1R门控电流产生较小但不显著的抑制作用（抑制率为12.7 ± 5.6%），而相同条件下对P2X4R的抑制率为83.2 ± 3.1% [1]。
蛋白质印迹分析证实了大鼠海马突触和突触外区域存在P2X4R的表达，但未检测到P2X1R或P2X3R的表达[1]。
在慢性偏头痛小鼠模型中，重复注射硝酸甘油（NTG）（10 mg/kg，腹腔注射，每隔一天一次，持续9天）导致三叉神经尾核（TNC）中P2X4R蛋白表达随时间增加，最早在第3天即可检测到，并在第9天检测到P2X4R mRNA表达增加。 [2].
对这些小鼠的三叉神经脊束核（TNC）进行双重免疫荧光标记显示，几乎所有P2X4R阳性细胞均与Iba1（一种小胶质细胞标记物）共标记，表明小胶质细胞表达P2X4R[2].
在反复注射硝酸甘油（NTG）的小鼠的TNC中，5-BDBD治疗（28 mg/kg，腹腔注射，每次NTG注射前）显著降低了NTG诱导的c-Fos阳性细胞的增加（从84.9 ± 11.8个细胞/切片降至34.1 ± 8.7个细胞/切片），并减弱了NTG诱导的降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应性纤维光密度的降低[2].

使用 5-BDBD（28 mg/kg；腹腔注射；每日一次，连续 9 天）可以完全模拟反复注射硝酸甘油 (NTG) 诱发的基础痛觉过敏 [2]。研究人员使用了一种反复间歇性注射硝酸甘油 (NTG) 的动物模型，该模型与慢性偏头痛 (CM) 非常相似。他们使用 von Frey 纤维丝试验评估了 NTG 诱发的基础和急性机械性痛觉过敏。然后，研究人员检测了三叉神经尾核 (TNC) 中的 Iba1 免疫反应性 (Iba1-IR) 和 P2X4R 表达。为了解小胶质细胞和 P2X4R 对 CM 中枢敏化的影响，研究人员检测了小胶质细胞活化抑制剂米诺环素和 P2X4R 拮抗剂 5-BDBD 是否会改变 NTG 诱发的机械性痛觉过敏。此外，研究人员还评估了5-BDBD对三叉神经核（TNC）内c-Fos和降钙素基因相关肽（CGRP）表达的影响。结果：慢性间歇性给予硝酸甘油（NTG）导致急性及慢性基础机械性痛觉过敏，并伴有小胶质细胞活化和P2X4受体表达上调。米诺环素显著降低了基础痛觉过敏，但并未改变NTG诱导的急性痛觉过敏。米诺环素还降低了小胶质细胞活化。5-BDBD完全阻断了NTG诱导的基础及急性痛觉过敏。这种作用与显著抑制NTG诱导的TNC内c-Fos蛋白和CGRP释放的增加有关。结论：我们的结果表明，抑制小胶质细胞活化可能有助于预防偏头痛慢性化。此外，研究人员推测 P2X4R 可能与 TNC 中的小胶质细胞-神经元信号有关，这有助于 CM 的中枢敏化 [2]。

---

在大鼠海马切片中，用 10 µM 5-BDBD 预孵育 60 分钟可显著降低长期增强 (LTP) 的晚期，这反映在 LTP 诱导后 40-60 分钟测量的场兴奋性突触后电位 (fEPSP) 斜率值的显著降低。相反，在相同条件下，非特异性拮抗剂PPADS (3 µM) 和P2X3R拮抗剂AF-353 (100 nM) 对LTP没有显著影响[1]。
在慢性偏头痛小鼠模型中（重复注射NTG，10 mg/kg，腹腔注射，每隔一天一次，持续9天），预先注射5-BDBD（28 mg/kg，腹腔注射，在每次NTG/生理盐水注射前立即注射）可完全阻断慢性基础机械性痛觉过敏和急性NTG诱导的机械性痛觉过敏（通过von Frey纤维测试测量）[2]。
在同一小鼠模型中，预先注射5-BDBD（28 mg/kg，腹腔注射，在每次NTG注射前注射）可显著抑制NTG诱导的三叉神经尾核（TNC）中c-Fos蛋白表达和CGRP释放的增加[2]。

受体转染和电流测量。[1]
实验采用大鼠P2X受体。HEK293细胞常规培养于含10% (v/v)胎牛血清和100 µg/ml庆大霉素的DMEM培养基中。细胞以每35 mm培养皿50万个细胞的密度接种。接种24小时后进行瞬时转染，使用2 µg DNA和5 µl LipofectAMINE 2000试剂，溶于2 ml无血清Opti-MEM培养基中。孵育4.5小时后，将转染混合物更换为正常培养基。转染后24-48小时进行实验。记录前，将转染细胞机械分散，并在35 mm培养皿中重新培养2-10小时。在室温下，使用全细胞膜片钳记录技术对细胞进行电生理实验。使用 Axopatch 200B 膜片钳放大器记录电流，并使用 2 kHz 低通贝塞尔滤波器进行滤波。膜片钳电极由硼硅酸盐玻璃制成，采用 Flaming Brown 水平拉丝机拉制，并经热抛光处理，最终尖端电阻为 2–4 MΩ。所有电流记录均使用 pClamp 9 软件和 Digidata 1322A 模数转换器进行采集和存储。膜片钳电极内填充溶液成分如下（单位：mM）：142 NaCl、1 MgCl₂、10 EGTA 和 10 HEPES，用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.35。内液渗透压为 306 mOsm。浴液成分如下（单位：mM）：142 NaCl、3 KCl、1 MgCl₂、2 CaCl₂、10 葡萄糖和 10 HEPES，用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.35。该溶液的渗透压为 295–305 mOsm。ATP 每日用浴液缓冲液配制，并使用快速换液系统进行施加。5-BDBD 储备液用二甲基亚砜配制，并分装后储存于 –20 °C。电流反应记录于钳制在 –60 mV 的单细胞。浓度-反应数据通过记录施加于单细胞的不同 ATP 浓度下的电流获得，每次施加之间间隔 1–5 分钟的洗脱期，并将结果归一化至最高电流幅度。电生理记录使用表达大鼠 P2X 受体的 HEK293 细胞。将细胞以每35 mm培养皿50万个的密度接种，24小时后，使用2 µg DNA和5 µl脂质体转染试剂在无血清培养基中进行瞬时转染。4.5小时后，将转染混合物更换为正常培养基。转染后24-48小时进行实验。记录前，将转染细胞机械分散并重新培养2-10小时。在室温下进行全细胞膜片钳记录。细胞钳制在-60 mV。使用快速换液系统施加ATP。5-BDBD的储备液用DMSO配制[1]。
P2X4R表达分析使用HEK293细胞（转染和未转染）和大鼠脑组织。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的缓冲液中获得蛋白质提取物。将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维素膜。膜用5%脱脂奶粉封闭，然后在4℃下与P2X4R一抗孵育过夜，随后与二抗孵育。使用化学发光底物检测免疫反应[1]。

动物/疾病模型：雄性C57BL/6小鼠[2]
剂量：28 mg/kg
给药途径：腹腔注射；每日一次，连续9天
实验结果：预防硝酸甘油诱导的机械性过敏。

---

海马切片制备。[1]
断头后，将脑组织迅速浸入冰冷的解剖缓冲液中，该缓冲液含有（单位：mM）：212.7蔗糖；5 KCl；1.25 NaH2PO4；3 MgSO4；1 CaCl2；26 NaHCO3；以及10葡萄糖；pH 7.4。解剖海马，并使用振动切片机从中间三分之一处获得横切片（厚度为400 µm）。将脑片转移至含有饱和95% O₂/5% CO₂的人工脑脊液（aCSF）的界面储存室，并在37℃下至少放置1小时。之后，将脑片置于aCSF中，或在记录前分别用5-BDBD、PPADS或AF-353孵育1小时。aCSF的成分（单位：mM）为：124 NaCl；5 K₁；1.25 NaH₂PO₄；1.0 MgCl₂；2.0 CaCl₂；26 NaHCO₃；10葡萄糖；pH 7.4。随后将单个脑片转移至记录室，使其完全浸没在aCSF中，并持续灌注（2 ml/min）。

---

长时程增强（LTP）实验。 [1]
使用连接至刺激隔离器的双极电极，在Schaffer侧支通路处，每隔15秒对对照组和5-BDBD孵育的海马进行电刺激（双相恒流刺激，200 μs），并在放射层记录电刺激信号，以观察CA1区场突触后电位（fEPSP）。记录电极为充满人工脑脊液（ACSF）的玻璃微电极（1–2 MΩ）。在每次实验开始时，通过逐渐增加刺激强度，直至达到最大反应的50%，绘制刺激-反应曲线。在20分钟的稳定基线期后，通过θ节律刺激（TBS）诱发长时程增强（LTP）。TBS包含5组刺激，组间间隔为10秒。每个刺激序列包含10个5 Hz的脉冲串，每个脉冲串包含4个100 Hz的脉冲。TBS刺激后，数据采集持续1小时。数据采集使用细胞外放大器和数据采集板（美国国家仪器公司，德克萨斯州奥斯汀），并通过Igor Pro软件进行控制。LTP值通过将fEPSP归一化，并将基线值设为100%来构建。LTP的幅度在TBS刺激后40至60分钟之间观察到。为了解小胶质细胞和P2X4R对NTG诱导的痛觉过敏的影响，我们用小胶质细胞抑制剂米诺环素或P2X4R选择性拮抗剂5-BDBD处理动物。米诺环素和5-BDBD均溶解于DMSO溶液中，DMSO溶液用作溶剂对照。在注射硝酸甘油/生理盐水之前，立即给予米诺环素/载体或5-BDBD/载体[14, 15]。测试日小鼠的处理方法如下：小鼠适应测试室后，15-20分钟后测量机械阈值基线值，然后腹腔注射米诺环素（30 mg/kg）、5-BDBD（28 mg/kg）或载体；之后注射硝酸甘油/生理盐水，2小时后测试急性机械反应。此过程每隔一天重复一次，持续9天。[2]

---

在海马长时程增强（LTP）实验中，用氟烷麻醉一个月大的雄性Sprague-Dawley大鼠并断头处死。迅速取出脑组织并浸入冰冷的解剖缓冲液中。解剖海马体，并使用振动切片机获得400 µm厚的横切片。将切片转移至含有饱和95% O₂/5% CO₂的人工脑脊液（aCSF）的界面储存室中，并在37°C下至少放置1小时。之后，将切片继续置于aCSF中，或在记录前分别用10 µM 5-BDBD、3 µM PPADS或100 nM AF-353孵育1小时。为了诱导长时程增强（LTP），每隔15秒对Schaffer侧支通路进行电刺激以诱发场电位。在20分钟的稳定基线期后，通过θ节律刺激（TBS）诱发LTP，该刺激由5组间隔10秒的刺激组成。每个刺激序列包含10个5 Hz的脉冲串，每个脉冲串包含4个100 Hz的脉冲。数据采集在TBS刺激后持续1小时[1]。
慢性偏头痛模型采用雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄，18-20 g）。小鼠每隔一天腹腔注射10 mg/kg硝酸甘油（NTG）或溶剂，持续9天（第1、3、5、7、9天）。为了研究P2X4R阻断的作用，在注射NTG/生理盐水前，立即用P2X4R拮抗剂5-BDBD或其溶剂（DMSO溶液）处理小鼠。 5-BDBD 的给药方案为 28 mg/kg，腹腔注射。测试当日的流程如下：首先测量机械阈值基线值，然后给予 5-BDBD/载体，接着注射 NTG/生理盐水，2 小时后测试急性机械反应。对于慢性基础痛觉过敏，每次注射 NTG 前均测试机械阈值。采用 von Frey 纤维丝，根据上下法 [2] 测试后爪足底的机械敏感性。

[1]. Characterization of the antagonist actions of 5-BDBD at the rat P2X4 receptor. Neurosci Lett. 2019;690:219-224.

[2]. Microglia P2X4 receptor contributes to central sensitization following recurrent nitroglycerin stimulation. J Neuroinflammation. 2018;15(1):245. Published 2018 Aug 30.

总之，我们已鉴定出5-BDBD是一种特异性的P2X4R拮抗剂。此类分子的开发将有助于阐明P2XR在生理过程中的作用，并有助于设计针对涉及这些受体的疾病的特异性药物。[1] 在我们的研究中，CGRP免疫反应性纤维主要分布于三叉神经核（TNC）浅层，该区域主要与伤害性信息的处理相关。5-BDBD预处理可减轻NTG诱导的TNC中CGRP免疫反应性的变化，从而调节三叉神经系统的激活。P2X4R诱导CGRP释放的细胞机制可能与脑源性神经营养因子（BDNF）有关。既往研究表明，ATP刺激的小胶质细胞可通过P2X4R信号通路在体外和体内释放BDNF。此外，BDNF可通过TrkB受体调节感觉神经元中CGRP的表达和释放。慢性偏头痛的发生与三叉神经感觉通路的中枢敏化有关，这一过程涉及小胶质细胞活化和P2X4R表达增加。抑制小胶质细胞可能有效预防偏头痛的慢性化，但对终止急性偏头痛发作无效。此外，我们假设P2X4R可能参与三叉神经核（TNC）中的小胶质细胞-神经元信号传导。抑制P2X4R功能可能是治疗慢性偏头痛的一种潜在方法。 [2] 5-BDBD（5-(3-溴苯基)-1,3-二氢-2H-苯并呋喃并[3,2-e]-1,4-二氮杂卓-2-酮）是一种苯二氮卓类衍生物，最初被描述为竞争性正位拮抗剂，但最近的放射性配体研究表明其作用机制为变构作用。它是一种强效的P2X4R拮抗剂，可用于研究中枢神经系统中内源性P2X4R介导的功能，因为它能够区分在同一组织中共表达的P2X4R和其他P2XR亚型（P2X1、P2X2a、P2X2b、P2X3、P2X7）。 P2X4R 的优势之一是它对苏拉明和 PPADS 等广谱嘌呤能拮抗剂具有抵抗性 [1]。
在慢性偏头痛小鼠模型中，研究表明 P2X4R 拮抗剂 5-BDBD 可能参与三叉神经尾核 (TNC) 的小胶质细胞-神经元信号传导，抑制 P2X4R 功能可能是治疗慢性偏头痛的潜在方法 [2]。

C17H11BRN2O2

355.1854

354

C, 57.49; H, 3.12; Br, 22.50; N, 7.89; O, 9.01

768404-03-1

9841560

White to light yellow solid powder

3.505

58.09

1

3

1

22

481

0

BrC1=C([H])C([H])=C([H])C(=C1[H])C1C2=C(C3=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C3O2)N([H])C(C([H])([H])N=1)=O

NKYMVQPXXTZHSF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H11BrN2O2/c18-11-5-3-4-10(8-11)15-17-16(20-14(21)9-19-15)12-6-1-2-7-13(12)22-17/h1-8H,9H2,(H,20,21)

5-(3-bromophenyl)-1,3-dihydro-[1]benzofuro[3,2-e][1,4]diazepin-2-one

5-BDBD; 768404-03-1; 5-(3-Bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofuro[3,2-e]-1,4-diazepin-2-one; 5 BDBD;5BDBD; 5-(3-bromophenyl)-1,3-dihydro-[1]benzofuro[3,2-e][1,4]diazepin-2-one; CHEMBL2180179; DTXSID30431707; 5-(3-bromophenyl)-1,3-dihydro-(1)benzofuro(3,2-e)(1,4)diazepin-2-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~62.5 mg/mL (~175.96 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 9.8 mg/mL (27.59 mM) in 15% Solutol HS 15 10% Cremophor EL 35% PEG 400 40% water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。