Plasmodium
Methylene blue trihydrate (CI Basic Blue 9 trihydrate) inhibits monoamine oxidase A (MAO-A) with Ki = 0.027 μM and IC50 = 0.07-0.164 μM; MAO-B with IC50 = 4.37-5.5 μM; nitric oxide synthase (NOS) with Ki = 2.7 μM for rat cerebral NOS and 5.3 μM for endothelial NOS; guanylate cyclase (GC); and acetylcholinesterase (AChE). [1]
Inhibits soluble guanylyl cyclase (sGC). [2]
Inhibits inducible NOS (iNOS) and sGC. [3]
Increases mitochondrial complex I-III activity (electron transfer from NADH to cytochrome c) and complex IV expression/activity. [4]

亚甲蓝作为一种替代电子受体/供体，有助于修复线粒体，增强神经能量生成，并防止超氧化物的形成[1]。细胞色素P450 (CYP) 同工酶可被亚甲蓝抑制。亚甲蓝是一种无味、水溶性的深蓝绿色结晶粉末，遇水后会变成蓝色。亚甲蓝是一种血管加压药，它能抑制诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)，进而抑制可溶性鸟苷酸环化酶 (sGC) 的活化，从而影响一氧化氮 (NO) 的合成途径。亚甲蓝还能通过与可溶性鸟苷酸环化酶 (sGC) 的铁血红素部分结合，直接与一氧化氮 (NO) 竞争激活可溶性鸟苷酸环化酶的能力，从而抑制环磷酸鸟苷 (cGMP) 的积累[3]。

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脂多糖 (LPS) 激活的 BV2 小胶质细胞的免疫学特征会因亚甲蓝（碱性蓝 9）（4.5 μM；BV2 小胶质细胞）的作用而改变，其 CD14、IL-1β、TNF-α 和 CCL2 mRNA 的水平也会降低[3]。

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亚甲蓝 (MB) 是吩噻嗪类化合物及其衍生物的首个先导化合物，常用于诊断程序和治疗高铁血红蛋白血症。我们之前已证明，MB 可以作为一种替代的线粒体电子传递载体，增强细胞耗氧量，并在体外和啮齿动物帕金森病和中风模型中提供保护作用。本研究利用MB及其六种结构相关化合物，在体外研究了MB的构效关系。MB通过绕过线粒体复合物I-III的替代电子传递途径降低线粒体超氧化物的产生。MB可减轻活性自由基的产生，并对HT-22细胞中谷氨酸、IAA和鱼藤酮的毒性具有神经保护作用。值得注意的是，MB对葡萄糖氧化酶诱导的直接氧化应激没有保护作用。在MB的10位氮原子上引入侧链后，其对谷氨酸神经毒性的保护效力降低了1000倍。在3位和7位没有侧链的化合物，如氯吩噻嗪和吩噻嗪，与MB相比具有不同的氧化还原电位，它们无法增强线粒体电子传递，但却能直接抗氧化，对抗谷氨酸、IAA和鱼藤酮的损伤。与需要NADH和线粒体还原的亚甲蓝（MB）相比，氯吩噻嗪在细胞线粒体裂解液测定中表现出直接的抗氧化作用。MB可增加复合物IV的表达和活性，而2-氯吩噻嗪则无此作用。我们的研究表明，MB可通过作为线粒体电子传递的替代载体和线粒体中的可再生抗氧化剂来减弱超氧化物的产生[4]。

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亚甲蓝三水合物（CI碱性蓝9三水合物） (MB) 在HT-22细胞中可保护细胞免受谷氨酸（20 mM）诱导的神经毒性，EC50 = 17.81 nM（通过Calcein AM和MTT测定），降低活性氧（ROS）的产生，EC50 = 20.37 nM，并防止线粒体膜电位去极化，EC50 = 17.72 nM。 [4]
MB 在 10 nM、100 nM、1 μM 和 10 μM 浓度下均能保护细胞免受鱼藤酮 (5 μM) 诱导的神经毒性。[4]
MB 在 100 nM 和 1 μM 浓度下能保护细胞免受碘乙酸 (IAA, 20 μM) 诱导的神经毒性。[4]
MB 不能保护细胞免受葡萄糖氧化酶 (2 U) 诱导的细胞外 H₂O₂ 毒性。[4]
MB (10 μM) 可提高 HT-22 细胞的耗氧率 (OCR) 并降低细胞外酸化率 (ECAR)。[4]
MB 在 10 nM 和 100 nM 浓度下可增加复合物 IV 亚基 I (Cox1) 的表达，并提高复合物 IV 的活性。 [4]
在无细胞线粒体裂解液测定中，MB仅在NADH和线粒体存在的情况下降低DCF荧光（抗氧化剂），但在NADH和线粒体不存在的情况下，浓度为100 nM至10 μM时则增加DCF荧光。[4]
MB（10 μM）显著提高分离的大鼠心脏线粒体中复合物I-III的活性（细胞色素c还原率）。[4]

在雄性Sprague-Dawley大鼠（7周龄，200-250克）中，亚甲蓝（1、5和25微克/只）以剂量依赖的方式显著降低脑内环磷酸鸟苷（cGMP）含量和七氟烷最小肺泡麻醉浓度（MAC）[2]。在染色内镜检查中，亚甲蓝被喷入胃肠道黏膜作为染料，用于检测发育不良或癌前病变[2]。亚甲蓝可以使平均动脉压（MAP）正常化，恢复血管张力，并减少对血管加压药的需求[3]。在临床研究中，口服亚甲蓝三水合物（CI碱性蓝9三水合物）（100毫克，每日两次或三次）改善了22名躁郁症患者中的14名；在一项为期两年的双盲交叉试验中，每日300毫克剂量可减轻抑郁症状；每日15毫克剂量对重度抑郁症患者有效；每日195毫克剂量作为辅助治疗可改善双相情感障碍的残留症状。[1]
在临床前研究中，静脉注射亚甲蓝（15-30毫克/公斤）在大鼠强迫游泳试验（FST）中表现出抗抑郁样作用；亚甲蓝（15-60毫克/公斤）和亚甲绿（7.5-40毫克/公斤）在大鼠FST中均有活性；天青B和氯化乙硫铵（4-30毫克/公斤，腹腔注射）显示出优于丙咪嗪的抗抑郁样作用。 [1]脑室内注射亚甲蓝（1、5、25 μg/只大鼠）可剂量依赖性地降低大鼠七氟醚的最小肺泡麻醉浓度（MAC）（5 μg 和 25 μg 时显著降低），并剂量依赖性地降低脑内 cGMP 含量。七氟醚本身也能降低体内 cGMP 含量。[2]在患有血管麻痹综合征的心脏手术患者中，亚甲蓝（1-2 mg/kg 推注）可升高平均动脉压并降低血管加压药的需求量。在肝移植中，移植肝再灌注前给予亚甲蓝可升高平均动脉压并降低肾上腺素用量。在脓毒性休克中，亚甲蓝可升高平均动脉压和体循环阻力。[3]

线粒体膜电位分析[4]
线粒体膜电位采用FRET法，使用TMRE/NAO进行分析，方法如前所述。在正常线粒体膜电位下，TMRE可猝灭NAO荧光。随着膜电位下降，TMRE荧光减弱，导致NAO荧光增强。NAO荧光增强被解释为线粒体膜电位降低。将细胞与谷氨酸和亚甲蓝(MB)或相关化合物孵育12小时。然后移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，再将细胞置于含有1 µM NAO和1 µM TMRE的PBS溶液中，于37°C孵育30分钟。移除NAO/TMRE，将细胞在KRH培养基中于37°C继续孵育15分钟。细胞用PBS洗涤两次，并使用Tecan Infinite F200酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）测量NAO荧光强度。原始数据以RFU表示。然后根据对照组和Calcein AM处理组的细胞活力对NAO荧光强度进行标准化。

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活性氧分析[4]
使用荧光酶标仪、流式细胞仪和荧光显微镜，通过活性氧反应性荧光指示剂H2DCFDA（Anaspec）测量细胞内ROS的变化。在微孔板实验中，将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板中过夜。将细胞与药物和20 mM谷氨酸在37°C、5% CO2条件下孵育12小时。然后移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，再在含有10 µM H2DCFDA的PBS中于37°C孵育30分钟。移除PBS后，将细胞在KRH培养基中于37°C继续孵育15分钟。用PBS洗涤细胞两次，并使用Tecan Infinite F200酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）测量DCF荧光强度。原始数据以RFU表示。然后根据对照组和Calcein AM处理组的细胞活力对DCF荧光强度进行标准化。对于荧光显微镜观察，将HT-22细胞以10,000个细胞/孔的密度接种于6孔板中。将细胞在谷氨酸和指定药物中孵育8小时。8小时后，将培养基更换为含有10 µM H2DCFDA的KRH培养基。将细胞在37°C孵育15分钟，用KRH洗涤一次，然后在新鲜的KRH培养基中于37°C继续孵育10分钟。最后，更换新鲜的KRH缓冲液，并对细胞进行成像。用于流式细胞术的HT-22细胞以50,000个细胞/孔的密度接种于6孔板中，并过夜培养使其贴壁。移除培养基，更换为新鲜的DMEM培养基（高糖，1 mM丙酮酸钠，10% FBS），其中分别含有溶剂、10 µM亚甲蓝(MB)、20 mM谷氨酸或10 µM亚甲蓝(MB)和20 mM谷氨酸。细胞在37°C、5% CO2条件下孵育8小时。孵育结束后，移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后在含有10 µM H2DCFDA的PBS中于37°C孵育15分钟。移除PBS，细胞在PBS中于37°C继续孵育10分钟。将 PBS 替换为新鲜的 PBS，并使用 Beckman Coulter FC-500 测定 DCF 荧光。

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线粒体裂解液氧化测定[4]
在 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH = 7.4) 中，用 500 µM H2O2、10 µM DCF 测定四种化合物（亚甲蓝 (MB)、NR、2-氯吩噻嗪和氯丙嗪），并分别在有或无 165 µM NADH 和线粒体裂解液 (19.4 µg/ml) 的情况下进行测定。检测在 Greiner 96 孔黑色板中进行，于 37°C 下孵育 30 分钟，此时使用 Tecan Infinite F200 酶标仪测量 DCF 荧光强度（激发波长 485 nm，发射波长 530 nm）。

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对于 MAO 抑制（参考文献，[1] 中未提供详细方案）：MB 抑制人 MAO-A 和 MAO-B，IC50 值通过放射化学或荧光法测定。[1]（目标文献中未提供详细方法）。
对于 sGC 活性测定（引自 [2]）：将大鼠脑可溶性组分与 50 mM Tris、5 mM MgCl2、1 mM DL-二硫苏糖醇、1 mM 异丁基甲基黄嘌呤、0.1 mM GTP、七氟烷（0-1.165 mM）和 NO（2×10^-8 M）于 37°C 下孵育 5 分钟。加入10%三氯乙酸终止反应，并在冰上冷却。2500g离心10分钟后，采用酶联免疫吸附试验测定cGMP的生成量。注：本试验检测的是七氟烷，而非亚甲蓝。[2]
线粒体复合物I-III和II-III活性测定（引自[4]）：分离大鼠心脏线粒体，超声破碎后加入含有2 mM MgCl₂、2 mM KCN、80 μM氧化型细胞色素c和4 μM NADH（复合物I-III）或20 mM琥珀酸、500 μM EDTA、2 mM KCN、30 μM细胞色素c和2 μg/ml鱼藤酮（复合物II-III）的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。监测550 nm处的吸光度变化。鱼藤酮 (2 μg/ml) 用于抑制复合物 I，抗霉素 A (2 μg/ml) 用于抑制复合物 III。亚甲基蓝 (MB) 和甲苯胺蓝 O (10 μM) 显著提高了复合物 I-III 测定中细胞色素 c 的还原速率。[4]
对于无细胞线粒体裂解液氧化测定（引自 [4]）：该测定在含有 500 μM H₂O₂、10 μM H₂DCFDA 的 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4) 中进行，并添加或不添加 165 μM NADH 和线粒体裂解液 (19.4 μg/ml)。反应在 37°C 下孵育 30 分钟，并测量 DCF 荧光强度（激发波长 485 nm，发射波长 530 nm）。MB (100 nM-10 μM) 仅在 NADH 和线粒体存在的情况下才能降低 DCF 荧光强度。[4]

细胞活力检测[4]
采用Calcein AM和MTT法测定细胞活力。Calcein AM检测中，将HT-22细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板中，并在100 µl DMEM培养基（高糖，含1 mM丙酮酸钠和10% FBS）中培养过夜。向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝(MB)或其衍生物以及20 mM谷氨酸，并在37°C、5% CO2条件下孵育12小时。12小时后，移除培养基，并加入1 µM的Calcein AM PBS溶液。细胞在37°C孵育5分钟后，使用Tecan Infinite F200酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）测量荧光强度。在 MTT 实验中，将 HT-22 细胞以 3000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔平底板中，每孔加入 100 µl DMEM 培养基（高糖、1 mM 丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后，向每个孔中加入不同浓度的药物和 20 mM 谷氨酸（对照孔加入培养基）。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 12 小时。取出培养板，向每个孔中加入 20 µl MTT 溶液（5 mg/ml，溶于 PBS）。轻轻摇晃培养板，使 MTT 与培养基充分混合，然后放回培养箱继续孵育 2 小时。2 小时后，移除培养基，向每个孔中加入 100 µl DMSO。将反应板轻轻摇匀，并使用 Tecan Infinite F200 酶标仪测量吸光度（560 nm，参考波长 670 nm）。

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鱼藤酮神经毒性试验[4]
将 HT-22 细胞以 3000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔平底板中，每孔加入 100 µl DMEM 培养基（高糖、1 mM 丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后，向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝 (MB) 或其衍生物以及 5 µM 鱼藤酮（对照孔加入培养基）。将反应板置于 37°C、5% CO2 的培养箱中孵育 24 小时。采用钙黄绿素AM法测定细胞活力。

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葡萄糖氧化酶神经毒性试验[4]
将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔平底板中，每孔加入100 µl DMEM培养基（高糖、1 mM丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝(MB)或其衍生物以及2 U葡萄糖氧化酶（对照孔加入培养基）。将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育3小时。细胞活力通过钙黄绿素AM法测定。

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碘乙酸（IAA）神经毒性试验[4]
将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔平底板中，每孔加入100 µl DMEM培养基（高糖、1 mM丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后，向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝（MB）或其衍生物以及20 µM IAA（对照孔加入培养基）。将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育2小时。2小时后，移除所有培养基，并更换为含有药物但不含IAA的新鲜培养基。将培养板继续置于37°C、5% CO2条件下孵育22小时。采用钙黄绿素AM法测定细胞活力。

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蛋白质印迹法[4]
将HT-22细胞以150000个/孔的密度接种于6孔板中。细胞过夜贴壁后，于次日加入亚甲蓝(MB)或2-氯吩噻嗪，浓度如所示。细胞培养3天后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。将细胞裂解液上样至10%聚丙烯酰胺凝胶，然后转移至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜与一抗在4℃下孵育过夜，一抗浓度如所示（Cox1，1∶500；Actin，1∶3000）。将辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育2小时（1∶2000稀释）。使用 UVP Biospectrum 500 检测化学发光。HT-22 小鼠海马细胞培养于含 1 mM 丙酮酸、4 mM 谷氨酰胺和 10% FBS 的高糖 DMEM 培养基中。采用 Calcein AM（1 μM，5 分钟，激发波长 485 nm/发射波长 530 nm）或 MTT（5 mg/ml，2 小时，560 nm 吸光度）法检测细胞活力。谷氨酸神经毒性：将细胞暴露于 20 mM 谷氨酸和待测化合物中 12 小时。鱼藤酮毒性：将细胞暴露于 5 μM 鱼藤酮和待测化合物中 24 小时。碘乙酸 (IAA) 毒性：将细胞暴露于 20 μM IAA 和待测化合物中 2 小时，然后更换新鲜培养基继续培养 22 小时。葡萄糖氧化酶毒性：将细胞暴露于 2 U 葡萄糖氧化酶和待测化合物中 3 小时。活性氧（ROS）测定：细胞与 10 μM H2DCFDA 孵育 30 分钟，然后测量 DCF 荧光强度（激发波长 485 nm/发射波长 530 nm）。线粒体膜电位：采用基于 FRET 的方法，使用 NAO (1 μM) 和 TMRE (1 μM) 孵育 30 分钟，或使用 JC-1 染料 (5 μg/ml) 孵育 15 分钟，并进行荧光显微镜观察。谷胱甘肽测定：使用总 GSH 试剂盒，裂解细胞，加入 NADPH、谷胱甘肽还原酶和二苯基二硒化物，在 415 nm 处测定吸光度。流式细胞术：用 H2DCFDA 染色细胞，在 Beckman Coulter FC-500 流式细胞仪上进行分析。 Western blot：细胞用RIPA缓冲液裂解，蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移至硝酸纤维素膜，用抗Cox1抗体（1:500）和抗肌动蛋白抗体（1:3000）进行孵育，HRP标记的二抗（1:2000）进行显色，化学发光检测。复合物IV活性蓝色天然PAGE：凝胶分离后，将条带置于含20 mg DAB和50 mg细胞色素c的50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中孵育。生物能量学：Seahorse XF24细胞，每孔5000个细胞，依次注射测试化合物（10 μM）、寡霉素（1 μg/ml）、FCCP（300 nM）、鱼藤酮（100 nM），测定OCR和ECAR。[4]

一氧化氮 (NO)-环磷酸鸟苷 (cGMP) 信号通路在麻醉和镇痛作用中发挥重要作用。我们旨在探究可溶性鸟苷酸环化酶 (sGC) 抑制剂在挥发性麻醉剂的麻醉机制和作用部位中的作用。我们研究了脑室内 (ICV) 注射 sGC 抑制剂亚甲蓝 (MB) 对大鼠体内七氟醚最小肺泡麻醉浓度 (MAC) 和脑组织 cGMP 含量的影响。此外，我们还研究了七氟醚对体外 NO 刺激的 sGC 活性的影响。将大鼠分为三组。脑室内注射 MB 后，分别测定第一组和第二组的七氟醚 MAC 和脑组织 cGMP 含量。第三组实验中，在未进行脑室内注射亚甲蓝（MB）的情况下，测定了七氟醚麻醉后脑组织中cGMP的含量，以考察七氟醚对脑组织cGMP含量的直接影响。结果显示，MB以剂量依赖的方式显著降低了七氟醚的最小肺泡浓度（MAC）和脑组织cGMP含量。七氟醚本身在体内也以剂量依赖的方式降低了脑组织中的cGMP含量，并在体外抑制了NO刺激的sGC活性。这些结果表明，sGC水平上NO-cGMP信号通路的抑制可能参与了麻醉或镇痛作用，而七氟醚对sGC的抑制作用可能是该麻醉剂的作用位点之一。意义：由于一氧化氮-环磷酸鸟苷（NO-cGMP）信号通路介导伤害感受，且卤代挥发性麻醉剂的作用位点尚不明确，因此我们研究了可溶性鸟苷酸环化酶抑制在麻醉机制中的潜在作用。七氟烷对可溶性鸟苷酸环化酶的抑制作用可能是该麻醉剂的作用位点之一。[3]

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大鼠强迫游泳试验 (FST) 数据来自[1]：成年雄性Wistar大鼠经尾静脉注射亚甲蓝 (MB)（1.87-60 mg/kg）；在15-30 mg/kg剂量下观察到抗抑郁样作用。在另一项研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠腹腔注射亚甲蓝 (15-60 mg/kg) 并进行FST。也进行了亚慢性研究。[1]
大鼠脑室内给药数据来自[2]：雄性Sprague-Dawley大鼠（7周龄，200-250 g）用硫喷妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉。将一根不锈钢L形管植入右侧脑室并固定在颅骨上。将一根硅胶管（内径 0.3 mm）连接并经皮下隧道置入。为测定最小肺泡浓度 (MAC)，将大鼠置于独立的塑料腔室（长 30 cm，直径 5 cm）中，并给予七氟烷和氧气（4 L/min）。用红外分析仪监测呼出气体。尾夹夹住大鼠尾部 1 分钟；浓度以 0.2% 至 0.3% 的步长进行调整，并平衡 20 分钟。测定基线 MAC 后，脑室内注射亚甲蓝 (MB)（1、5、25 μg，溶于 25 μL 溶液中），30 分钟后再次测定 MAC。用聚焦于头部的微波照射处死大鼠后，取出脑组织并冷冻保存。为测定 cGMP，将脑组织在 6% 三氯乙酸中匀浆，离心，用饱和水的乙醚洗涤上清液，并用酶免疫测定法测定 cGMP。蛋白质含量采用 Lowry 法测定。腹主动脉血气分析证实 PaO2、PaCO2 和 pH 值均无变化。[2]

吸收、分布和排泄
主要经尿液和胆汁排泄。口服剂量约75%经尿液排泄，主要以稳定的无色亚甲蓝形式排出。10 mg/kg（大鼠）。3.0 ± 0.7 L/min。……采用高效液相色谱法（HPLC）测定了7名志愿者静脉注射和口服100 mg亚甲蓝（含或不含美司钠）后全血中亚甲蓝的浓度。在大鼠十二指肠内和静脉注射给药后，测定了亚甲蓝在不同组织中的分布。静脉注射后，全血中亚甲蓝的浓度-时间曲线呈多相变化，估计末端半衰期为5.25小时。口服给药后，浓度-时间曲线下面积显著降低（9 nmol/min/mL vs 137 nmol/min/mL）。与美司钠（一种可能通过离子对相互作用影响药物分布的药物）合用并未改变亚甲蓝的药代动力学。静脉给药后，尿液中亚甲蓝及其白三烯形式的排泄量仅略高于静脉给药（18% vs 28% 剂量）。在大鼠中，十二指肠给药导致肠壁和肝脏中的药物浓度高于静脉给药，但全血和脑组织中的药物浓度较低。亚甲蓝器官分布的差异是口服和静脉给药后药代动力学特征不同的主要原因。……亚甲蓝在胃肠道中吸收良好，口服后约 1-2 小时达到血浆峰浓度。……分布到组织后，亚甲蓝迅速还原为白三烯亚甲蓝（白三烯甲基锍氯化物）。新生儿代谢白三烯亚甲蓝的效率可能低于成人。亚甲蓝主要经尿液和胆汁排泄。口服亚甲蓝约有75%经尿液排出，主要以稳定的无色形式（白色亚甲蓝）排出。暴露于空气中的尿液会因氧化产物亚甲蓝砜的存在而变成绿色或蓝色。部分未代谢的药物也会经尿液排出。背景：尽管亚甲蓝染料常规用于淋巴示踪，但由于担心对胎儿的风险，它不用于妊娠相关乳腺癌的淋巴示踪。方法：为了研究亚甲蓝染料在妊娠期乳腺癌淋巴示踪中的安全性，我们对10名非妊娠女性进行了亚甲蓝染料的药代动力学研究，并将结果外推以估算胎儿对该染料的最大暴露量。结果：血浆和尿液检测显示，染料从乳房注射部位迅速分布到血液中，48小时内尿液中排出总剂量的32%。根据现有亚甲蓝器官分布数据，估计胎儿最大剂量为0.25 mg（给药剂量的5%），其他妊娠相关生理因素可能进一步降低该剂量。结论：分析表明，亚甲蓝染料可用于妊娠相关乳腺癌的淋巴示踪，且胎儿风险极低。在成年雌性绵羊静脉注射15 mg/kg亚甲蓝后，测定了亚甲蓝在体内的药代动力学分布和尿液排泄情况。比较了单独使用亚甲蓝与先注射50 mg/kg亚硝酸钠再注射亚甲蓝的效果。亚甲蓝的总消除速率常数（β）为0.0076 ± 0.0016 min⁻¹，不受先前注射亚硝酸钠的影响。然而，亚硝酸钠显著改变了亚甲蓝的分布速率。尽管亚甲蓝的半衰期相对较短，但以原形或无色形式从尿液中排出的亚甲蓝却很少。……

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代谢/代谢物
亚甲蓝分布到组织后，会迅速被还原为亚甲蓝（氯化亚甲蓝）。新生儿代谢亚甲蓝的效率可能低于老年人。
亚甲蓝可以被还原为无色的亚甲蓝；这些化合物共同构成一个可逆的氧化还原系统。低浓度的亚甲蓝可以加速高铁血红蛋白转化为血红蛋白。在高铁血红蛋白血症患者中，亚甲蓝在红细胞中的高铁血红蛋白还原酶的作用下被还原为亚甲蓝；然后亚甲蓝将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。高浓度的亚甲蓝可以将还原型血红蛋白中的亚铁氧化为三价铁，从而将血红蛋白转化为高铁血红蛋白。亚甲蓝分布至组织后，会迅速还原为白菌亚甲蓝（氯化白菌亚甲蓝）。新生儿代谢白菌亚甲蓝的效率可能低于成人。生物半衰期：5-6.5小时（静脉注射后）。静脉注射后亚甲蓝的估计半衰期为5-6.5小时。……采用高效液相色谱法测定了7名志愿者静脉和口服100毫克亚甲蓝（含或不含美司钠）后全血中亚甲蓝的浓度。在十二指肠内和静脉注射后，测定了亚甲蓝在大鼠不同组织中的分布。静脉注射后，全血中亚甲蓝的浓度变化呈现多相过程，估计终末半衰期为 5.25 小时。亚甲蓝三水合物（CI 碱性蓝 9 三水合物）具有亲水性（logP = -0.96），pKa 为 0 至 -1，但能穿过血脑屏障；大鼠口服给药（10 mg/kg）后，脑内浓度是血浆浓度的十倍（Cmax = 86 ng/ml = 0.27 μM）；腹腔注射 1 mg/kg 后，脑内浓度为 0.5 μM。[1]亚甲蓝代谢为天青 B 和天青 A。还原型亚甲蓝（LeucoMB）的 logP = 3.84，pKa 分别为 4.5 和 5.9。[1]在人体中，静脉注射亚甲蓝的终末血浆半衰期为 5-6 小时。可连续输注 48-72 小时。亚甲蓝经肝脏代谢，经肾脏排泄。[3]

蛋白质结合
据报道，亚甲蓝与兔血浆的结合力很强（71-77%的药物被结合）。鉴别和用途：亚甲蓝为固体，其水溶液呈深蓝色。它可用作细菌染色剂、混合指示剂、染料、氧化还原比色剂和黑色素瘤靶向剂。它还用于治疗药物引起的高铁血红蛋白血症。人体研究：高铁血红蛋白血症通常用亚甲蓝治疗。然而，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者中，亚甲蓝可诱发高铁血红蛋白血症。临床前研究表明，低剂量亚甲蓝可增加大脑中线粒体细胞色素氧化酶的活性，并改善学习任务（包括恐惧消退）后的记忆保持。眼内注射1%亚甲蓝对角膜内皮和虹膜上皮具有细胞毒性作用。据报道，接受亚甲蓝联合血清素活性药物治疗的患者中，曾出现数例疑似血清素综合征病例。另有报告指出，输注亚甲蓝处理过的血浆后可能出现过敏性超敏反应。一名早产儿在经肠道给予亚甲蓝后出现高铁血红蛋白血症和溶血性贫血。流行病学证据表明，亚甲蓝具有致畸性，孕期使用可能对胎儿造成损害。羊膜穿刺术中使用亚甲蓝与新生儿回肠和空肠闭锁、回肠梗阻及其他不良反应有关。孕期使用亚甲蓝可导致新生儿出现溶血性贫血、高胆红素血症、高铁血红蛋白血症、呼吸窘迫、皮肤染色和光毒性。动物研究表明，亚甲蓝治疗会导致高铁血红蛋白形成和红细胞氧化损伤，从而导致再生性贫血以及一系列继发于红细胞损伤的组织和生化改变。早期变化之一是高铁血红蛋白水平呈剂量依赖性升高，大鼠和小鼠的反应相似。小鼠似乎比大鼠更容易形成海因茨小体和贫血，其特征是血红蛋白、血细胞比容和红细胞计数降低。在100 mg/kg（仅限雄性）和200 mg/kg剂量组的所有受试小鼠和大鼠的尸检中均观察到脾肿大。亚甲蓝对大鼠具有胚胎毒性。亚甲蓝导致小鼠在妊娠18天（足月）前分娩。分别在45%、50%和83%接受50、60和85 mg/kg亚甲蓝处理的动物中观察到这种反应。在无细胞条件下，亚甲蓝可诱导DNA损伤。其特征是产生大量对修复内切酶FPG蛋白（甲酰胺嘧啶-DNA糖苷酶）敏感的碱基修饰。亚甲蓝对培养的哺乳动物细胞具有致突变性。相反，小鼠微核试验结果表明，其在体内的遗传毒性并不显著。兽医学中使用亚甲蓝的最大担忧是可能导致海因茨小体贫血或其他红细胞形态改变、高铁血红蛋白血症以及红细胞寿命缩短。猫通常对这些影响非常敏感，一些人认为亚甲蓝禁用于猫科动物。然而，犬和马在相对较低的剂量下也可能出现不良血液学反应。生态毒性研究：亚甲蓝对神仙鱼具有致畸作用。非人类毒性值：小鼠静脉注射LD50：77 mg/kg；小鼠腹腔注射LD50：150 mg/kg；小鼠口服LD50：3500 mg/kg。大鼠静脉注射LD50：1250 mg/kg

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亚甲蓝三水合物（CI碱性蓝9三水合物）与血清素能药物（例如SSRIs）合用时，由于MAO-A抑制作用，可引起血清素毒性（ST）；病例通常发生在静脉给药后。口服给药后未见ST报道。[1]
“奶酪反应”（由膳食酪胺引起的高血压）与不可逆的MAO-A抑制剂相关；亚甲蓝作为一种可逆抑制剂，不太可能引起这种反应。[1]
大剂量亚甲蓝推注（约10%的患者）可能导致意识混乱和脑病，尤其是在同时使用SSRIs时。[1]
亚甲蓝表现出兴奋效应剂量反应：低剂量有益，高剂量有害。高浓度可导致高铁血红蛋白血症（通过氧化血红蛋白）。 [1]
亚甲蓝与血清素能药物（如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂[SSRIs]、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂[SNRIs]、三环类抗抑郁药[TCAs]、单胺氧化酶抑制剂[MAOIs]等）合用时可能发生血清素综合征；美国食品药品监督管理局（FDA）于2011年发布了相关警告。[3]
由于存在溶血性贫血的风险，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症患者禁用亚甲蓝。[3]
剂量≥7 mg/kg时的毒性表现包括溶血、高铁血红蛋白血症、恶心、呕吐、胸痛、高血压；剂量≥20 mg/kg时：严重血管内溶血、高胆红素血症、死亡。[3]
亚甲蓝长时间外周输注可能导致局部皮肤坏死、脉搏血氧饱和度人为降低，以及脓毒性休克时动脉氧合恶化（抑制缺氧性肺血管收缩）。 [3]
MB抑制CYP450同工酶，可能影响地高辛、华法林、苯妥英、芬太尼、环孢素等药物的代谢。[3]
在无细胞体系中，高浓度（10 μM）的MB在缺乏NADH和线粒体的情况下会增加DCF荧光强度（促氧化作用）。[4]

[1]. Methylene blue and its analogues as antidepressant compounds. Metab Brain Dis. 2017 Oct;32(5):1357-1382.

[2]. Methylene blue, a soluble guanylyl cyclase inhibitor, reduces the sevoflurane minimum alveolar anesthetic concentration and decreases the brain cyclic guanosine monophosphate content in rats. Anesth Analg. 1999 Aug;89(2):484-9.

[3]. Intraoperative vasoplegia: methylene blue to the rescue! Curr Opin Anaesthesiol. 2018 Feb;31(1):43-49.

[4]. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One. 2012;7(10):e48279.

亚甲蓝三水合物是一种无味或近乎无味的深绿色晶体，带有青铜光泽，或为深绿色结晶粉末。其pH值（1%水溶液）为3至4.5。（NTP，1992）
亚甲蓝是一种合成碱性染料。亚甲蓝可以对带负电荷的细胞成分（例如核酸）进行染色；在肿瘤手术中，当注射到肿瘤淋巴床时，亚甲蓝可以对引流肿瘤的淋巴结进行染色，从而有助于肿瘤前哨淋巴结的影像定位。低剂量静脉注射该药物可将高铁血红蛋白转化为血红蛋白。
该化合物由深绿色晶体或带有青铜光泽的结晶粉末组成。其水溶液或醇溶液呈深蓝色。亚甲蓝用作细菌染色剂和指示剂。它能抑制鸟苷酸环化酶，曾被用于治疗氰化物中毒和降低高铁血红蛋白水平。亚甲蓝是一种有机氯化物盐，其抗衡离子为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓。它是一种常用染料，具有抗氧化、抗疟疾、抗抑郁和心脏保护作用。它可用作EC 1.4.3.4（单胺氧化酶）抑制剂、酸碱指示剂、荧光染料、抗抑郁药、心脏保护剂、EC 3.1.1.8（胆碱酯酶）抑制剂、组织学染料、EC 4.6.1.2（鸟苷酸环化酶）抑制剂、抗氧化剂、抗菌剂、神经保护剂、物理示踪剂和抗疟疾药物。它含有3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓。亚甲蓝是一种氧化还原剂。静脉注射亚甲蓝已获得FDA批准，用于治疗儿童和成人获得性高铁血红蛋白血症。历史上，亚甲蓝曾在非洲广泛用于治疗疟疾，但随着氯喹（CQ）和其他药物的出现，它已被逐步淘汰。人们也曾研究过它作为泌尿道消毒剂的用途。氯化亚甲蓝（国际非专利名称，或称亚甲蓝，拟定商品名为Rember）是由阿伯丁大学和TauRx Therapeutics公司联合研发的一种在研药物。早期临床试验表明，它可以抑制Tau蛋白的聚集。该药物在治疗阿尔茨海默病方面具有潜在价值。亚甲蓝是一种合成碱性染料。亚甲蓝可以对带负电荷的细胞成分（例如核酸）进行染色；在肿瘤手术中，将亚甲蓝注射到肿瘤淋巴床可以对引流肿瘤的淋巴结进行染色，从而有助于肿瘤前哨淋巴结的成像和定位。低剂量静脉注射该药物可以将高铁血红蛋白转化为血红蛋白。亚甲蓝是一种化合物，由深绿色晶体或具有青铜光泽的结晶性粉末组成。其水溶液或醇溶液呈深蓝色。亚甲蓝可用作细菌染色剂和指示剂。它能抑制鸟苷酸环化酶，曾用于治疗氰化物中毒和降低高铁血红蛋白水平。药物适应症：用于治疗儿童和成人获得性高铁血红蛋白血症。亚甲蓝的其他临床应用包括改善各种临床疾病相关的低血压、作为尿路感染的消毒剂、治疗肝硬化和严重肝肺综合征引起的缺氧和高动力循环，以及治疗异环磷酰胺引起的神经毒性。Lumeblue 适用于作为诊断剂，增强接受筛查或监测性结肠镜检查的成年患者的结直肠病变成像。用于药物和化学物质引起的急性高铁血红蛋白血症的急性症状治疗。甲基硫氰酸盐氯化物 Proveblue 适用于成人、儿童和青少年（0 至 17 岁）。作用机制：亚甲蓝的主要作用机制是抑制一氧化氮合酶和鸟苷酸环化酶。在阿尔茨海默病中：一项机制研究发现，亚甲蓝可氧化tau蛋白上的半胱氨酸巯基，从而维持其单体状态。一项针对tau蛋白疾病小鼠的临床前治疗研究表明，亚甲蓝可通过Nrf2/抗氧化反应元件（AREs）发挥抗炎或神经保护作用；另一项研究报告称，早期给药可减少不溶性tau蛋白，并改善学习和记忆能力。在高铁血红蛋白血症中：亚甲蓝通过与红细胞反应生成白细胞亚甲蓝发挥作用，白细胞亚甲蓝是一种还原剂，可将氧化血红蛋白中的三价铁离子（Fe+++）还原为携带氧气的二价铁离子（Fe++）。作为一种抗疟药物：亚甲蓝是恶性疟原虫谷胱甘肽还原酶的特异性抑制剂，具有逆转氯喹耐药性的潜力。其作用机制与4-氨基喹啉类抗疟药类似，可阻止血红素聚合形成血红素晶体。关于异环磷酰胺诱导的神经毒性：亚甲蓝可作为替代电子受体。它能逆转肝糖异生引起的NADH抑制，并阻断氯乙胺转化为氯乙醛。此外，它还能抑制多种胺氧化酶的活性，从而阻止氯乙醛的生成。
本研究探讨了亚甲蓝（一种潜在的可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂）调节培养的兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）积累的机制。在短期共培养中，用硝普钠、亚硝基硫醇或牛肺动脉内皮细胞基础释放的内皮舒张因子刺激对照组或亚甲蓝预处理的兔肺动脉平滑肌细胞。假设的内皮舒张剂S-亚硝基-L-半胱氨酸、S-亚硝基-L-半胱氨酸的稳定脱氨类似物、S-亚硝基-3-巯基丙酸和硝普钠均以浓度依赖性方式（1–100 μM）增加兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）的水平（增加1.5–12倍）。亚甲蓝预处理可抑制S-亚硝基-L-半胱氨酸和硝普钠诱导的cGMP积累51%–100%，但对S-亚硝基-3-巯基丙酸介导的反应无影响。亚甲蓝对硝基血管扩张剂诱导的cGMP积累的抑制作用可通过黄嘌呤（100 μM）和黄嘌呤氧化酶（5 mU）产生的细胞外超氧阴离子进行定量重现。与亚甲蓝预处理类似，超氧阴离子的产生对基础cGMP水平或S-亚硝基-3-巯基丙酸诱导的cGMP反应均无影响。此外，亚甲蓝呈剂量和时间依赖性地诱导兔肺动脉平滑肌细胞产生超氧阴离子，这已通过分光光度法测定细胞色素c还原得到证实。亚甲蓝对S-亚硝基-L-半胱氨酸和硝普钠诱导的cGMP积累的抑制作用可被超氧化物歧化酶完全阻断，但不能被过氧化氢酶阻断。在与未经处理的兔肺动脉平滑肌细胞共培养前，用亚甲蓝选择性预处理内皮细胞，可降低兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）的水平，其程度与用亚甲蓝预处理的兔肺动脉平滑肌细胞与未经处理的内皮细胞共培养时观察到的水平相当，并且这种降低可被超氧化物歧化酶部分抑制。精神分裂症是一个主要的公共卫生问题，影响着全球约1%的人口。苯氯吡啶（PCP）是一种具有显著精神致幻特性的药物，可诱发人类出现类似精神分裂症的症状。在啮齿动物中，PCP可破坏声惊反射的预脉冲抑制，这种抑制作用也在精神分裂症患者中得到证实。一氧化氮合酶（NOS）抑制剂可阻断此效应，提示一氧化氮在PCP的这种效应中起着关键作用。亚甲蓝是一种鸟苷酸环化酶和一氧化氮合酶抑制剂，已被证明可作为传统抗精神病药物的辅助疗法用于治疗精神分裂症。本研究旨在探讨亚甲蓝（50或100 mg/kg）是否会影响PCP（4 mg/kg）诱导的小鼠预脉冲抑制的破坏。此外，本研究还探讨了亚甲蓝（50 mg/kg）对PCP（4 mg/kg）诱导的运动亢进的影响。结果表明，PCP可轻易破坏小鼠的预脉冲抑制，但不影响单纯脉冲刺激试验。该研究还发现，亚甲蓝以剂量依赖的方式抑制了PCP诱导的预脉冲抑制的降低。此外，亚甲蓝预处理可以减轻苯环利定诱导的亢进作用。本研究结果进一步支持了苯环利定的药理学和行为学效应与一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶通路相关的观点。由于苯环利定也具有精神病样特征，因此干扰一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶通路的药物可能对精神分裂症的治疗具有治疗价值。[1]

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引言：由Tau蛋白组成的神经原纤维缠结（NFTs）是阿尔茨海默病神经退行性改变的标志性特征。表达全长促聚集人Tau蛋白（2N4R Tau-ΔK280，或简称Tau(ΔK)）或其重复结构域（TauRD-ΔK280，或简称TauRD(ΔK)）的转基因小鼠会逐渐出现Tau蛋白病理改变，包括Tau蛋白的错误分选、磷酸化、聚集、突触丢失和功能缺陷。TauRD(ΔK)可组装成神经原纤维缠结（NFTs），并与神经元死亡相关；而Tau(ΔK)则聚集形成Tau蛋白缠结，但不会导致明显的神经元丢失。两种形式的Tau蛋白均会导致类似的认知功能下降（分别在10个月和12个月时发病），并且在两种情况下，停止转基因表达后，认知功能下降均可逆转。由于亚甲蓝（MB）可在体外抑制Tau蛋白聚集，我们研究了MB是否能够预防或改善我们小鼠模型中Tau蛋白诱导的认知障碍。我们采用不同的预防和治疗方案，分别在疾病发作前或发作后，对两种小鼠进行口服亚甲蓝（MB）给药。通过行为学测试（旷场实验、莫里斯水迷宫实验）评估小鼠的认知状态，以确定最佳治疗方案。结果：预防性或治疗性MB给药均未能预防或改善TauRD(ΔK)小鼠的学习和记忆缺陷。同样，在认知障碍出现后开始的治疗性MB治疗对Tau(ΔK)小鼠也无效。相反，在功能障碍出现前预防性使用亚甲蓝（MB）可保护Tau(ΔK)小鼠的认知功能。除了学习和记忆能力的改善外，MB治疗的Tau(ΔK)小鼠还表现出不溶性Tau蛋白、构象改变的Tau蛋白（MC1）和磷酸化Tau蛋白（AT180、PHF1）的显著减少，以及蛋白质降解系统（自噬和蛋白酶体）的上调。这表明，除了作为Tau蛋白聚集抑制剂的特性外，MB还具有其他多效性作用。结论：我们的数据支持将Tau蛋白聚集抑制剂作为治疗阿尔茨海默病和其他Tau蛋白疾病的潜在药物，并强调了在认知障碍发生前进行预防性治疗的必要性。[2]

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创伤性脑损伤（TBI）与脑水肿、血脑屏障破坏和神经炎症相关，所有这些都会影响损伤的严重程度和功能恢复。遗憾的是，目前尚无有效的预防性治疗方法来限制TBI的短期或长期后果。因此，本研究旨在确定抗氧化剂亚甲蓝（MB）在减轻弥漫性脑损伤相关炎症和行为并发症方面的疗效。我们发现，在小鼠中线液体冲击损伤后立即静脉注射MB（创伤性脑损伤后15-30分钟）可减轻脑水肿、抑制小胶质细胞活化、减轻神经炎症并改善行为恢复。具体而言，MB显著降低了脑损伤后1天海马中与脑水肿和炎症相关的基因表达。此外，MB干预还减弱了脑损伤后1天富集的微胶质细胞/巨噬细胞中脑损伤诱导的炎症基因（白细胞介素[IL]-1β、肿瘤坏死因子α）的表达。脂多糖激活的BV2微胶质细胞培养实验证实，MB治疗可直接降低微胶质细胞中IL-1β的水平并提高IL-10的水平。最后，研究人员评估了脑损伤后1周内的功能恢复和抑郁样行为。MB干预并未阻止脑损伤后1-7天内体重或运动协调性的下降。然而，MB减轻了脑损伤后7天急性抑郁样行为的发生。总之，立即使用MB进行干预可以有效减轻弥漫性脑损伤后的神经炎症并改善行为恢复。因此，亚甲蓝干预可能减少创伤性脑损伤的危及生命的并发症，包括脑水肿和神经炎症，并预防神经精神并发症的发生。[3]

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亚甲蓝三水合物（CI碱性蓝9三水合物）是一种带正电荷的杂环芳香化合物，具有离域亲脂性阳离子（DLC）结构，可促进其在线粒体中的积累。它作为电子循环剂，在NADH和细胞色素c之间穿梭电子，绕过电子传递链中的阻塞点。它还能诱导细胞色素氧化酶的表达。[1]
亚甲蓝已被用于治疗阿尔茨海默病（抑制tau蛋白聚集和Aβ寡聚化）、帕金森病（通过抑制MAO-B提高多巴胺水平）、疟疾（氧化还原循环）和休克（抑制NO-cGMP血管舒张）。 [1]
在临床上用于治疗血管麻痹综合征时，与术后晚期给药相比，早期（术中）给药可带来更好的预后（降低肾衰竭和死亡率）。常用的治疗方法是先以1-2 mg/kg的剂量在10-20分钟内快速静脉推注，然后以2 mg/kg/h的速度持续输注。[3]
由于存在胎儿缺氧的风险，亚甲蓝在妊娠期间禁用。[3]
亚甲蓝的氧化还原电位为E1/2 = 0.500 V，相对于标准氢电极（NHE）为-0.108 V。[4]

C16H24CLN3O3S

373.90

373.122

C, 51.40; H, 6.47; Cl, 9.48; N, 11.24; O, 12.84; S, 8.57

7220-79-3

Methylene blue trihydrate;7220-79-3;Methylene blue hydrate;122965-43-9; 61-73-4 (Cl)

104827

Light brown to black solid powder

0.98 g/mL at 25 °C

190 °C (dec.)(lit.)

14 °C

75.07

3

7

1

24

483

0

CN(C)C1=CC2=C(C=C1)N=C3C=CC(=[N+](C)C)C=C3S2.O.[Cl-]

XQAXGZLFSSPBMK-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C16H18N3S.ClH.3H2O/c1-18(2)11-5-7-13-15(9-11)20-16-10-12(19(3)4)6-8-14(16)17-13;;;;/h5-10H,1-4H3;1H;3*1H2/q+1;;;;/p-1

[7-(dimethylamino)phenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;chloride;trihydrate

Methylene Blue trihydrate; 7220-79-3; Phenothiazin-5-ium, 3,7-bis(dimethylamino)-, chloride, trihydrate; C.I. Basic Blue 9 trihydrate; Methylthionine chloride; Basic Blue 9 trihydrate; 3,7-Bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride trihydrate; C.I. Basic Blue 9, trihydrate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 100 mg/mL (267.45 mM)