Guanylyl cyclase (sGC); Monoamine oxidase A (MAO-A); NO synthase (NOS)[1]
Methylene blue has multiple molecular targets. It inhibits nitric oxide synthase (NOS; IC50 = 0.07 μM) and soluble guanylate cyclase (sGC), reducing NO-cGMP signaling. It inhibits monoamine oxidase A (MAO-A; IC50 = 1.9 μM). It inhibits tau filament formation (IC50 = 1.9 μM), suggesting potential benefit in tauopathies such as Alzheimer’s disease. It also irreversibly inhibits heat-shock inducible Hsp72 by oxidizing Cys306, inhibiting Hsp70 ATPase turnover (EC50 = 80 μM). It is a redox cycling compound capable of generating reactive oxygen species and modulating cellular redox balance.

LPS激活的BV2小胶质细胞的免疫学特征会发生改变，亚甲蓝（碱性蓝9）（4.5 μM；BV2小胶质细胞）可降低其CD14、IL-1β、TNF-α和CCL2 mRNA的表达水平[3]。亚甲蓝（MB）是吩噻嗪类及其他衍生物的首个先导化合物，常用于诊断和治疗高铁血红蛋白血症。我们此前已证实，MB可作为一种替代的线粒体电子传递载体，增强细胞耗氧量，并在体外以及帕金森病和中风的啮齿动物模型中发挥保护作用。在本研究中，我们使用MB及其六种结构相关的化合物，在体外研究了MB的构效关系。MB通过绕过线粒体复合物I-III的替代电子传递途径，降低线粒体超氧化物的产生。 MB能减轻活性自由基的产生，并对HT-22细胞中谷氨酸、IAA和鱼藤酮的毒性提供神经保护作用。然而，MB对葡萄糖氧化酶诱导的直接氧化应激没有保护作用。在MB的10位氮原子上引入侧链后，其对谷氨酸神经毒性的保护效力降低了1000倍。在3位和7位没有侧链的化合物，如氯吩噻嗪和吩噻嗪，与MB相比具有不同的氧化还原电位，它们不能增强线粒体电子传递，但却能直接抗氧化，对抗谷氨酸、IAA和鱼藤酮的损伤。与需要NADH和线粒体还原的MB相比，氯吩噻嗪在线粒体裂解液测定中表现出直接的抗氧化作用。MB能增加复合物IV的表达和活性，而2-氯吩噻嗪则没有这种作用。我们的研究表明，亚甲蓝（MB）可通过作为线粒体电子传递的替代载体和线粒体中可再生抗氧化剂来减弱超氧化物的产生[4]。体外实验表明，亚甲蓝对MAO-A、tau蛋白丝形成和NOS的抑制作用IC50值分别为0.07 μM、1.9 μM和5.3 μM。它通过NO合酶/鸟苷酸环化酶信号通路抑制可溶性鸟苷酸环化酶并降低预脉冲抑制。它对Hsp70 ATPase的周转抑制作用EC50值为80 μM。此外，它还能通过氧化tau蛋白上的半胱氨酸巯基来抑制tau蛋白聚集，从而维持tau蛋白的单体状态。其氧化还原循环特性使其具有抗菌和抗寄生虫活性。亚甲蓝是研究氧化还原生物学和酶抑制的多功能工具。

对雄性NMRI小鼠腹腔注射亚甲蓝（碱性蓝9），每25分钟一次，剂量为50和100 mg/kg，可降低其前脉冲抑制能力[1]。在表达全长促聚集人Tau蛋白的小鼠中，碱性蓝9（20和40 mg/kg；口服；每日一次，持续6个月；CaMKIIα-tTA转录激活小鼠）可维持认知功能[2]。在接受TBI治疗的雄性BALB/c小鼠中，碱性蓝9（2 mg/kg；静脉注射；每日一次，持续1天）可减轻初始抑郁样行为以及TBI引起的脑水肿和神经炎症[3]。在接受创伤性脑损伤（TBI）治疗的雄性BALB/c小鼠中，每日一次静脉注射亚甲蓝（碱性蓝9），剂量为2 mg/kg，可降低炎症因子的百分比[3]。
体内，亚甲蓝是一种血管加压药，用于治疗血管麻痹综合征和高铁血红蛋白血症。它能减轻脑水肿，减弱小胶质细胞活化，并减少神经炎症。它能穿过血脑屏障，并已被研究用于阿尔茨海默病中的神经保护作用，其机制是通过抑制tau蛋白聚集。它通过一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶信号通路降低前脉冲抑制。其体内作用呈剂量依赖性，并与其多种酶靶点和氧化还原活性相关。它还可用作诊断染料和染色内镜检查。

线粒体膜电位分析[4]
线粒体膜电位采用FRET法，使用TMRE/NAO进行分析，方法如前所述。在正常线粒体膜电位下，TMRE可猝灭NAO荧光。随着膜电位下降，TMRE荧光减弱，导致NAO荧光增强。NAO荧光增强被解释为线粒体膜电位降低。将细胞与谷氨酸和亚甲蓝(MB)或相关化合物孵育12小时。然后移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，再将细胞置于含有1 µM NAO和1 µM TMRE的PBS溶液中，于37°C孵育30分钟。移除NAO/TMRE，将细胞在KRH培养基中于37°C继续孵育15分钟。细胞用PBS洗涤两次，并使用Tecan Infinite F200酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）测量NAO荧光强度。原始数据以RFU表示。然后根据对照组和Calcein AM处理组的细胞活力对NAO荧光强度进行标准化。

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活性氧分析[4]
使用荧光酶标仪、流式细胞仪和荧光显微镜，通过活性氧反应性荧光指示剂H2DCFDA（Anaspec）测量细胞内ROS的变化。在微孔板实验中，将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板中过夜。将细胞与药物和20 mM谷氨酸在37°C、5% CO2条件下孵育12小时。然后移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，再在含有10 µM H2DCFDA的PBS中于37°C孵育30分钟。移除PBS后，将细胞在KRH培养基中于37°C继续孵育15分钟。用PBS洗涤细胞两次，并使用Tecan Infinite F200酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）测量DCF荧光强度。原始数据以RFU表示。然后根据对照组和Calcein AM处理组的细胞活力对DCF荧光强度进行标准化。对于荧光显微镜观察，将HT-22细胞以10,000个细胞/孔的密度接种于6孔板中。将细胞在谷氨酸和指定药物中孵育8小时。8小时后，将培养基更换为含有10 µM H2DCFDA的KRH培养基。将细胞在37°C孵育15分钟，用KRH洗涤一次，然后在新鲜的KRH培养基中于37°C继续孵育10分钟。最后，更换新鲜的KRH缓冲液，并对细胞进行成像。用于流式细胞术的HT-22细胞以50,000个细胞/孔的密度接种于6孔板中，并过夜培养使其贴壁。移除培养基，更换为新鲜的DMEM培养基（高糖，1 mM丙酮酸钠，10% FBS），其中分别含有溶剂、10 µM亚甲蓝(MB)、20 mM谷氨酸或10 µM亚甲蓝(MB)和20 mM谷氨酸。细胞在37°C、5% CO2条件下孵育8小时。孵育结束后，移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后在含有10 µM H2DCFDA的PBS中于37°C孵育15分钟。移除PBS，细胞在PBS中于37°C继续孵育10分钟。将 PBS 替换为新鲜的 PBS，并使用 Beckman Coulter FC-500 测定 DCF 荧光。

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线粒体裂解液氧化测定[4]
在 10 mM 磷酸盐缓冲液 (pH = 7.4) 中，用 500 µM H2O2、10 µM DCF 测定四种化合物（亚甲蓝 (MB)、NR、2-氯吩噻嗪和氯丙嗪），并分别在有或无 165 µM NADH 和线粒体裂解液 (19.4 µg/ml) 的情况下进行测定。检测在 Greiner 96 孔黑色板中进行，于 37°C 下孵育 30 分钟，随后使用 Tecan Infinite F200 酶标仪（激发波长 485 nm，发射波长 530 nm）测量 DCF 荧光强度。亚甲蓝的体外酶/受体结合研究包括多种酶的抑制试验。MAO-A 活性评估方法为：将重组 MAO-A 与底物（如犬尿胺或血清素）在递增浓度的亚甲蓝存在下孵育，并通过荧光法或分光光度法测量产物生成量。NOS 活性评估方法为：使用放射性标记或比色法监测 L-精氨酸转化为 L-瓜氨酸的转化。鸟苷酸环化酶活性评估方法为：测量 cGMP 生成量。Tau 蛋白聚集抑制作用评估方法为：使用硫黄素 T 荧光法。IC50 值由剂量反应曲线计算得出。

细胞活力检测[4]
采用Calcein AM和MTT法测定细胞活力。Calcein AM检测中，将HT-22细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板中，并在100 µl DMEM培养基（高糖，含1 mM丙酮酸钠和10% FBS）中培养过夜。向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝(MB)或其衍生物以及20 mM谷氨酸，并在37°C、5% CO2条件下孵育12小时。12小时后，移除培养基，并加入1 µM的Calcein AM PBS溶液。细胞在37°C孵育5分钟后，使用Tecan Infinite F200酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）测量荧光强度。在 MTT 实验中，将 HT-22 细胞以 3000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔平底板中，每孔加入 100 µl DMEM 培养基（高糖、1 mM 丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后，向每个孔中加入不同浓度的药物和 20 mM 谷氨酸（对照孔加入培养基）。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 12 小时。取出培养板，向每个孔中加入 20 µl MTT 溶液（5 mg/ml，溶于 PBS）。轻轻摇晃培养板，使 MTT 与培养基充分混合，然后放回培养箱继续孵育 2 小时。2 小时后，移除培养基，向每个孔中加入 100 µl DMSO。将反应板轻轻摇匀，并使用 Tecan Infinite F200 酶标仪测量吸光度（560 nm，参考波长 670 nm）。

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鱼藤酮神经毒性试验[4]
将 HT-22 细胞以 3000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔平底板中，每孔加入 100 µl DMEM 培养基（高糖、1 mM 丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后，向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝 (MB) 或其衍生物以及 5 µM 鱼藤酮（对照孔加入培养基）。将反应板置于 37°C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时。采用 Calcein AM 法测定细胞活力。

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葡萄糖氧化酶神经毒性检测[4]
将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔平底板中，每孔加入100 µl DMEM培养基（高糖、1 mM丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝(MB)或其衍生物以及2 U葡萄糖氧化酶（对照孔加入培养基）。将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育3小时。采用Calcein AM法测定细胞活力。

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碘乙酸 (IAA) 神经毒性测定[4]
将 HT-22 细胞以 3000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔平底板中，每孔加入 100 µl DMEM 培养基（高糖、1 mM 丙酮酸钠、10% FBS），并使其过夜贴壁。然后，向每个孔中加入不同浓度的亚甲蓝 (MB) 或其衍生物以及 20 µM IAA（对照孔则加入培养基）。将培养板置于 37°C、5% CO2 的培养箱中孵育 2 小时。2 小时后，移除所有培养基，并更换为含有药物但不含 IAA 的新鲜培养基。继续在 37°C、5% CO2 的培养箱中孵育 22 小时。采用 Calcein AM 法测定细胞活力。

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蛋白质印迹[4]
将HT-22细胞以150000个/孔的密度接种于6孔板中。细胞过夜贴壁后，于次日加入亚甲蓝(MB)或2-氯吩噻嗪，浓度如所示。细胞培养3天后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。将细胞裂解液上样至10%聚丙烯酰胺凝胶，然后转移至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜与一抗在4℃下孵育过夜，一抗浓度如所示（Cox1，1:500；Actin，1:3000）。将辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育2小时（1:2000稀释）。使用 UVP Biospectrum 500 检测化学发光。
亚甲蓝的体外细胞实验包括在含有该化合物系列稀释液的培养基中培养各种细胞类型（神经元细胞、内皮细胞、癌细胞）。使用 MTT 或刃天青法评估细胞活力。使用荧光探针（例如 DCFH-DA）测量活性氧 (ROS) 的产生。通过测量下游产物（例如，鸟苷酸环化酶的 cGMP 水平，MAO-A 的单胺水平）来评估酶抑制作用。可以使用免疫荧光或生化分析方法研究过表达 tau 蛋白的细胞中的 tau 蛋白聚集。在氧化应激或兴奋性毒性模型中评估神经保护作用。

动物/疾病模型：雄性NMRI小鼠[1]
剂量：50和100 mg/kg
给药途径：腹腔注射（ip）；一次，持续25分钟
实验结果：预脉冲抑制减弱，苯环利定（PCP）诱导的运动活性增加减弱。

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动物/疾病模型：CaMKIIα-tTA转激活小鼠[2]
剂量：20和40 mg/kg
给药途径：口服；每日一次，持续6个月
实验结果：抑制CaMKIIα-tTA转激活小鼠的Tau蛋白聚集。

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动物/疾病模型：经TBI处理的雄性balb/c（Bagg白化）小鼠[3]
剂量：2 mg/kg
给药途径：静脉注射（iv）；每日一次
实验结果：CD14、IL-1β、TNF-α和CCL2 mRNA水平降低。

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动物/疾病模型：经TBI处理的雄性balb/c（Bagg白化）小鼠[3]
剂量：2 mg/kg
给药途径：静脉注射（iv）；每日一次，持续1天。
实验结果：小胶质细胞中骨髓（CD11b+/GR1+）细胞的百分比降低，IL-1β水平降低，IL-10表达增强。
亚甲蓝的体内动物研究包括阿尔茨海默病模型（例如，tau转基因小鼠）、脑水肿或神经炎症模型以及血管麻痹性休克模型。动物通过静脉注射、腹腔注射或口服途径接受亚甲蓝治疗。终点指标包括行为学测试（例如，记忆和学习能力）、tau蛋白聚集和氧化应激标志物的生化分析、脑组织组织学检查以及生理参数（血压、心率）。标准方案包括剂量反应评估以及与载体或对照治疗的比较。

吸收、分布和排泄
主要经尿液和胆汁排泄。口服剂量约75%经尿液排泄，主要以稳定的无色亚甲蓝形式排出。10 mg/kg（大鼠）。3.0 ± 0.7 L/min。……采用高效液相色谱法（HPLC）测定了7名志愿者静脉注射和口服100 mg亚甲蓝（含或不含美司钠）后全血中亚甲蓝的浓度。在大鼠十二指肠内和静脉注射给药后，测定了亚甲蓝在不同组织中的分布。静脉注射后，全血中亚甲蓝的浓度-时间曲线呈多相变化，估计末端半衰期为5.25小时。口服给药后，浓度-时间曲线下面积显著降低（9 nmol/min/mL vs 137 nmol/min/mL）。与美司钠（一种可能通过离子对相互作用影响药物分布的药物）合用并未改变亚甲蓝的药代动力学。静脉给药后，尿液中亚甲蓝及其白三烯形式的排泄量仅略高于静脉给药（18% vs 28% 剂量）。在大鼠中，十二指肠给药导致肠壁和肝脏中的药物浓度高于静脉给药，但全血和脑组织中的药物浓度较低。亚甲蓝器官分布的差异是口服和静脉给药后药代动力学特征不同的主要原因。……亚甲蓝在胃肠道中吸收良好，口服后约 1-2 小时达到血浆峰浓度。……分布到组织后，亚甲蓝迅速还原为白三烯亚甲蓝（白三烯甲基锍氯化物）。新生儿代谢白三烯亚甲蓝的效率可能低于成人。亚甲蓝主要经尿液和胆汁排泄。口服亚甲蓝约有75%经尿液排出，主要以稳定的无色形式（白色亚甲蓝）排出。暴露于空气中的尿液会因氧化产物亚甲蓝砜的存在而变成绿色或蓝色。部分未代谢的药物也会经尿液排出。背景：尽管亚甲蓝染料常规用于淋巴示踪，但由于担心对胎儿的风险，它不用于妊娠相关乳腺癌的淋巴示踪。方法：为了研究亚甲蓝染料在妊娠期乳腺癌淋巴示踪中的安全性，我们对10名非妊娠女性进行了亚甲蓝染料的药代动力学研究，并将结果外推以估算胎儿对该染料的最大暴露量。结果：血浆和尿液检测显示，染料从乳房注射部位迅速分布到血液中，48小时内尿液中排出总剂量的32%。根据现有亚甲蓝器官分布数据，估计胎儿最大剂量为0.25 mg（给药剂量的5%），其他妊娠相关生理因素可能进一步降低该剂量。结论：分析表明，亚甲蓝染料可用于妊娠相关乳腺癌的淋巴示踪，且胎儿风险极低。在成年雌性绵羊静脉注射15 mg/kg亚甲蓝后，测定了亚甲蓝在体内的药代动力学分布和尿液排泄情况。比较了单独使用亚甲蓝与先注射50 mg/kg亚硝酸钠再注射亚甲蓝的效果。亚甲蓝的总消除速率常数（β）为0.0076 ± 0.0016 min⁻¹，不受先前注射亚硝酸钠的影响。然而，亚硝酸钠显著改变了亚甲蓝的分布速率。尽管亚甲蓝的半衰期相对较短，但以原形或无色形式从尿液中排出的亚甲蓝却很少。……

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代谢/代谢物
亚甲蓝分布到组织后，会迅速被还原为亚甲蓝（氯化亚甲蓝）。新生儿代谢亚甲蓝的效率可能低于老年人。
亚甲蓝可以被还原为无色的亚甲蓝；这些化合物共同构成一个可逆的氧化还原系统。低浓度的亚甲蓝可以加速高铁血红蛋白转化为血红蛋白。在高铁血红蛋白血症患者中，亚甲蓝在红细胞中的高铁血红蛋白还原酶的作用下被还原为亚甲蓝；然后亚甲蓝将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。高浓度的亚甲蓝可以将还原型血红蛋白中的亚铁氧化为三价铁，从而将血红蛋白转化为高铁血红蛋白。亚甲蓝分布至组织后，迅速被还原为白菌亚甲蓝（氯化白菌亚甲蓝）。新生儿代谢白菌亚甲蓝的效率可能低于成人。生物半衰期：5-6.5小时（静脉注射后）。静脉注射后亚甲蓝的估计半衰期为5-6.5小时。……采用高效液相色谱法测定了7名志愿者静脉和口服100 mg亚甲蓝（含或不含美司钠）后全血中亚甲蓝的浓度。在十二指肠内和静脉注射后，测定了大鼠体内亚甲蓝在不同组织中的分布。静脉注射后全血中亚甲蓝的浓度变化呈多相过程，估计终末半衰期为5.25小时。亚甲蓝的药代动力学特性包括良好的口服生物利用度和分布，以及能够穿过血脑屏障。它能迅速被吸收并分布于全身。它在肝脏中经多种酶代谢，包括N-去甲基化生成亚甲蓝，主要经尿液排泄。其半衰期约为5-6小时。其氧化还原循环特性影响其药代动力学和药效学。它有口服和静脉注射两种剂型，可用于临床。

蛋白质结合
据报道，亚甲蓝与兔血浆的结合力很强（71-77%的药物被结合）。鉴别和用途：亚甲蓝为固体，其水溶液呈深蓝色。它可用作细菌染色剂、混合指示剂、染料、氧化还原比色剂和黑色素瘤靶向剂。它还用于治疗药物引起的高铁血红蛋白血症。人体研究：高铁血红蛋白血症通常用亚甲蓝治疗。然而，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者中，亚甲蓝可诱发高铁血红蛋白血症。临床前研究表明，低剂量亚甲蓝可增加大脑中线粒体细胞色素氧化酶的活性，并改善学习任务（包括恐惧消退）后的记忆保持。眼内注射1%亚甲蓝对角膜内皮和虹膜上皮具有细胞毒性作用。据报道，接受亚甲蓝联合血清素活性药物治疗的患者中，曾出现数例疑似血清素综合征病例。另有报告指出，输注亚甲蓝处理过的血浆后可能出现过敏性超敏反应。一名早产儿在经肠道给予亚甲蓝后出现高铁血红蛋白血症和溶血性贫血。流行病学证据表明，亚甲蓝具有致畸性，孕期使用可能对胎儿造成损害。羊膜穿刺术中使用亚甲蓝与新生儿回肠和空肠闭锁、回肠梗阻及其他不良反应有关。孕期使用亚甲蓝可导致新生儿出现溶血性贫血、高胆红素血症、高铁血红蛋白血症、呼吸窘迫、皮肤染色和光毒性。动物研究表明，亚甲蓝治疗会导致高铁血红蛋白形成和红细胞氧化损伤，从而导致再生性贫血以及一系列继发于红细胞损伤的组织和生化改变。早期变化之一是高铁血红蛋白水平呈剂量依赖性升高，大鼠和小鼠的反应相似。小鼠似乎比大鼠更容易形成海因茨小体和贫血，其特征是血红蛋白、血细胞比容和红细胞计数降低。在100 mg/kg（仅限雄性）和200 mg/kg剂量组的所有受试小鼠和大鼠的尸检中均观察到脾肿大。亚甲蓝对大鼠具有胚胎毒性。亚甲蓝导致小鼠在妊娠18天（足月）前分娩。分别在45%、50%和83%接受50、60和85 mg/kg亚甲蓝处理的动物中观察到这种反应。在无细胞条件下，亚甲蓝可诱导DNA损伤。其特征是产生大量对修复内切酶FPG蛋白（甲酰胺嘧啶-DNA糖苷酶）敏感的碱基修饰。亚甲蓝对培养的哺乳动物细胞具有致突变性。相反，小鼠微核试验结果表明，其在体内的遗传毒性并不显著。兽医学中使用亚甲蓝的最大担忧是可能导致海因茨小体贫血或其他红细胞形态改变、高铁血红蛋白血症以及红细胞寿命缩短。猫通常对这些影响非常敏感，一些人认为亚甲蓝禁用于猫科动物。然而，犬和马在相对较低的剂量下也可能出现不良血液学反应。生态毒性研究：亚甲蓝对神仙鱼具有致畸作用。非人类毒性值：小鼠静脉注射LD50：77 mg/kg；小鼠腹腔注射LD50：150 mg/kg；小鼠口服LD50：3500 mg/kg。大鼠静脉注射LD50：1250 mg/kg
亚甲蓝的毒理学数据表明，在治疗剂量下通常是安全的。常见副作用包括尿液和皮肤呈蓝绿色、恶心、呕吐和头痛。高剂量时，亚甲蓝可引起5-羟色胺综合征（由于MAO-A抑制）、G6PD缺乏症患者的溶血性贫血以及神经毒性。G6PD缺乏症患者禁用亚甲蓝。过量使用可导致严重的高铁血红蛋白血症、呼吸窘迫和心律失常。使用亚甲蓝需要谨慎用药和密切监测。其广泛的临床应用已积累了长期安全性数据。

[1]. Phencyclidine-induced behaviour in mice prevented by methylene blue. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2004 Feb;94(2):65-72.

[2]. Preventive methylene blue treatment preserves cognition in mice expressing full-length pro-aggregant human Tau. Acta Neuropathol Commun. 2015 May 10;3:25.

[3]. Methylene blue attenuates traumatic brain injury-associated neuroinflammation and acute depressive-like behavior in mice. J Neurotrauma. 2015 Jan 15;32(2):127-38.

[4]. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One . 2012;7(10):e48279.

亚甲蓝是一种有机氯化物盐，其抗衡离子为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓。它是一种常用染料，具有抗氧化、抗疟疾、抗抑郁和心脏保护作用。亚甲蓝可用作EC 1.4.3.4（单胺氧化酶）抑制剂、酸碱指示剂、荧光染料、抗抑郁药、心脏保护剂、EC 3.1.1.8（胆碱酯酶）抑制剂、组织学染料、EC 4.6.1.2（鸟苷酸环化酶）抑制剂、抗氧化剂、抗菌剂、神经保护剂、物理示踪剂和抗疟疾药物。它含有3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓。亚甲蓝是一种氧化还原剂。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准静脉注射亚甲蓝用于治疗儿童和成人获得性高铁血红蛋白血症。历史上，亚甲蓝在非洲曾广泛用于治疗疟疾，但随着氯喹（CQ）和其他药物的普及，其使用逐渐减少。人们也曾研究过它作为泌尿道消毒剂的用途。甲基硫氰酸氯化物（国际非专利名称，或称亚甲蓝，拟定商品名为Rember）是一种由阿伯丁大学和TauRx Therapeutics公司联合研发的在研药物。早期临床试验表明，它可以抑制Tau蛋白聚集。该药物有望用于治疗阿尔茨海默病。亚甲蓝是一种合成碱性染料。它可以对带负电荷的细胞成分（例如核酸）进行染色；在肿瘤手术中，当将亚甲蓝注射到肿瘤淋巴床时，它可以对引流淋巴结进行染色，从而有助于定位肿瘤前哨淋巴结。低剂量静脉注射时，该药物可以将高铁血红蛋白转化为血红蛋白。该化合物为深绿色晶体或具有青铜光泽的结晶性粉末。亚甲蓝溶于水或酒精后会变成深蓝色。它是一种细菌染色剂和指示剂，可抑制鸟苷酸环化酶，曾用于治疗氰化物中毒和降低高铁血红蛋白水平。适应症：用于治疗儿童和成人获得性高铁血红蛋白血症。亚甲蓝的其他临床应用包括改善各种临床疾病引起的低血压、作为尿路感染的消毒剂、治疗肝硬化和严重肝肺综合征引起的缺氧和高动力循环，以及治疗异环磷酰胺引起的神经毒性。Lumeblue 是一种诊断剂，用于增强接受筛查或监测性结肠镜检查的成年患者结直肠病变的成像效果。它也适用于药物和化学物质引起的急性高铁血红蛋白血症的急性症状治疗。甲基硫氰酸盐氯化物（Proveblue）适用于成人、儿童和青少年（0 至 17 岁）。作用机制：亚甲蓝的主要作用机制是抑制一氧化氮合酶和鸟苷酸环化酶。在阿尔茨海默病中：一项机制研究发现，亚甲蓝可氧化tau蛋白上的半胱氨酸巯基，从而维持其单体状态。一项针对tau蛋白疾病小鼠的临床前治疗研究表明，亚甲蓝可通过Nrf2/抗氧化反应元件（AREs）发挥抗炎或神经保护作用；另一项研究报告称，早期给药可减少不溶性tau蛋白，并改善学习和记忆能力。在高铁血红蛋白血症中：亚甲蓝通过与红细胞反应生成白细胞亚甲蓝发挥作用，白细胞亚甲蓝是一种还原剂，可将氧化血红蛋白中的三价铁离子（Fe+++）还原为携带氧气的二价铁离子（Fe++）。作为一种抗疟药物：亚甲蓝是恶性疟原虫谷胱甘肽还原酶的特异性抑制剂，具有逆转氯喹耐药性的潜力。其作用机制与4-氨基喹啉类抗疟药类似，可阻止血红素聚合形成血红素晶体。关于异环磷酰胺诱导的神经毒性：亚甲蓝可作为替代电子受体。它能逆转肝糖异生引起的NADH抑制，并阻断氯乙胺转化为氯乙醛。此外，它还能抑制多种胺氧化酶的活性，从而阻止氯乙醛的生成。
本研究探讨了亚甲蓝（一种潜在的可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂）调节培养的兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）积累的机制。在短期共培养中，用硝普钠、亚硝基硫醇或牛肺动脉内皮细胞基础释放的内皮舒张因子刺激对照组或亚甲蓝预处理的兔肺动脉平滑肌细胞。假设的内皮舒张剂S-亚硝基-L-半胱氨酸、S-亚硝基-L-半胱氨酸的稳定脱氨类似物、S-亚硝基-3-巯基丙酸和硝普钠均以浓度依赖性方式（1–100 μM）增加兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）的水平（增加1.5–12倍）。亚甲蓝预处理可抑制S-亚硝基-L-半胱氨酸和硝普钠诱导的cGMP积累51%–100%，但对S-亚硝基-3-巯基丙酸介导的反应无影响。亚甲蓝对硝基血管扩张剂诱导的cGMP积累的抑制作用可通过黄嘌呤（100 μM）和黄嘌呤氧化酶（5 mU）产生的细胞外超氧阴离子进行定量重现。与亚甲蓝预处理类似，超氧阴离子的产生对基础cGMP水平或S-亚硝基-3-巯基丙酸诱导的cGMP反应均无影响。此外，亚甲蓝呈剂量和时间依赖性地诱导兔肺动脉平滑肌细胞产生超氧阴离子，这已通过分光光度法测定细胞色素c还原得到证实。亚甲蓝对S-亚硝基-L-半胱氨酸和硝普钠诱导的cGMP积累的抑制作用可被超氧化物歧化酶完全阻断，但不能被过氧化氢酶阻断。在与未经处理的兔肺动脉平滑肌细胞共培养前，用亚甲蓝选择性预处理内皮细胞，可降低兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）的水平，其程度与用亚甲蓝预处理的兔肺动脉平滑肌细胞与未经处理的内皮细胞共培养时观察到的水平相当，并且这种降低可被超氧化物歧化酶部分抑制。精神分裂症是一个主要的公共卫生问题，影响着全球约1%的人口。苯氯吡啶（PCP）是一种具有显著精神致幻特性的药物，可诱发人类出现类似精神分裂症的症状。在啮齿动物中，PCP可破坏声惊反射的预脉冲抑制，这种抑制作用也在精神分裂症患者中得到证实。一氧化氮合酶（NOS）抑制剂可阻断此效应，提示一氧化氮在PCP的这种效应中起着关键作用。亚甲蓝是一种鸟苷酸环化酶和一氧化氮合酶抑制剂，已被证明可作为传统抗精神病药物的辅助疗法用于治疗精神分裂症。本研究旨在探讨亚甲蓝（50或100 mg/kg）是否会影响PCP（4 mg/kg）诱导的小鼠预脉冲抑制的破坏。此外，本研究还探讨了亚甲蓝（50 mg/kg）对PCP（4 mg/kg）诱导的运动亢进的影响。结果表明，PCP可轻易破坏小鼠的预脉冲抑制，但不影响单纯脉冲刺激试验。该研究还发现，亚甲蓝以剂量依赖的方式抑制了PCP诱导的预脉冲抑制的降低。此外，亚甲蓝预处理可以减轻苯环利定诱导的过度运动效应。本研究结果进一步支持了苯环利定的药理学和行为学效应与一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶通路相关的观点。由于苯环利定也具有精神病样特征，因此干扰一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶通路的药物可能对精神分裂症的治疗具有治疗价值。[1]

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引言：由Tau蛋白组成的神经原纤维缠结（NFTs）是阿尔茨海默病神经退行性改变的标志。表达全长促聚集人Tau蛋白（2N4R Tau-ΔK280，或简称Tau(ΔK)）或其重复结构域（TauRD-ΔK280，或简称TauRD(ΔK)）的转基因小鼠会逐渐出现Tau蛋白病理改变，包括Tau蛋白的错误分选、磷酸化、聚集、突触丢失和功能缺陷。TauRD(ΔK)可组装成神经原纤维缠结（NFTs），并与神经元死亡相关；而Tau(ΔK)则聚集形成Tau蛋白缠结，但不会导致明显的神经元丢失。两种形式的Tau蛋白均会导致类似的认知功能下降（分别在10个月和12个月时发病），并且在两种情况下，停止转基因表达后，认知功能下降均可逆转。由于亚甲蓝（MB）可在体外抑制Tau蛋白聚集，我们研究了MB是否能够预防或改善我们小鼠模型中Tau蛋白诱导的认知障碍。我们采用不同的预防和治疗方案，分别在疾病发作前或发作后，对两种小鼠进行口服亚甲蓝（MB）给药。通过行为学测试（旷场实验、莫里斯水迷宫实验）评估小鼠的认知状态，以确定最佳治疗方案。结果：预防性或治疗性MB给药均未能预防或改善TauRD(ΔK)小鼠的学习和记忆缺陷。同样，在认知障碍出现后开始的治疗性MB治疗对Tau(ΔK)小鼠也无效。相反，在功能障碍出现前预防性使用亚甲蓝（MB）可保护Tau(ΔK)小鼠的认知功能。除了学习和记忆能力的改善外，MB治疗的Tau(ΔK)小鼠还表现出不溶性Tau蛋白、构象改变的Tau蛋白（MC1）和磷酸化Tau蛋白（AT180、PHF1）的显著减少，以及蛋白质降解系统（自噬和蛋白酶体）的上调。这表明，除了作为Tau蛋白聚集抑制剂的特性外，MB还具有其他多效性作用。结论：我们的数据支持将Tau蛋白聚集抑制剂作为治疗阿尔茨海默病和其他Tau蛋白疾病的潜在药物，并强调了在认知障碍发生前进行预防性治疗的必要性。[2]

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创伤性脑损伤（TBI）与脑水肿、血脑屏障破坏和神经炎症相关，所有这些都会影响损伤的严重程度和功能恢复。遗憾的是，目前尚无有效的预防性治疗方法来限制TBI的短期或长期后果。因此，本研究旨在确定抗氧化剂亚甲蓝（MB）在减轻弥漫性脑损伤相关炎症和行为并发症方面的疗效。我们发现，在小鼠中线液体冲击损伤后立即静脉注射MB（创伤性脑损伤后15-30分钟）可减轻脑水肿、抑制小胶质细胞活化、减轻神经炎症并改善行为恢复。具体而言，MB显著降低了脑损伤后1天海马中与脑水肿和炎症相关的基因表达。此外，MB干预还减弱了脑损伤后1天富集的微胶质细胞/巨噬细胞中脑损伤诱导的炎症基因（白细胞介素[IL]-1β、肿瘤坏死因子α）的表达。脂多糖激活的BV2微胶质细胞培养实验证实，MB治疗可直接降低微胶质细胞中IL-1β的水平并提高IL-10的水平。最后，研究人员评估了脑损伤后1周内的功能恢复和抑郁样行为。MB干预并未阻止脑损伤后1-7天内体重或运动协调性的下降。然而，MB减轻了脑损伤后7天急性抑郁样行为的发生。总之，立即使用MB进行干预可以有效减轻弥漫性脑损伤后的神经炎症并改善行为恢复。因此，亚甲蓝干预可能减少创伤性脑损伤的危及生命的并发症，包括脑水肿和神经炎症，并预防神经精神并发症的发生。[3]亚甲蓝是一种用途广泛的化合物，作为染料、解毒剂（用于治疗高铁血红蛋白血症）和血管加压药，在医学上有着悠久的应用历史。它也被用作生物染色剂和氧化还原指示剂。由于其具有多种酶靶点，且能够穿过血脑屏障，因此成为神经退行性疾病研究的热点。在某些国家，亚甲蓝可用于治疗特定疾病，无需处方。其抑制tau蛋白聚集的作用引起了人们对其治疗阿尔茨海默病潜力的关注。此外，它还用于染色内镜检查以检测胃肠道病变。其广泛的药理学特性使其成为临床医学和研究中的重要工具。

C16H18CLN3S

319.85222

319.091

C, 60.08; H, 5.67; Cl, 11.08; N, 13.14; S, 10.02

61-73-4

Methylene blue trihydrate;7220-79-3;Methylene blue hydrate;122965-43-9; 61-73-4 (Cl)

6099

Reddish brown to brown solid powder

1.0 g/mL at 20 °C

190 °C (dec.)(lit.)

45 °C

47.38

0

4

1

21

483

0

CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C16H18N3S.ClH/c1-18(2)11-5-7-13-15(9-11)20-16-10-12(19(3)4)6-8-14(16)17-13;/h5-10H,1-4H3;1H/q+1;/p-1

[7-(dimethylamino)phenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;chloride

CI52015; 61-73-4; Basic blue 9; Methylthioninium chloride; Solvent blue 8; Swiss Blue; Methylene Blue anhydrous; Chromosmon; Methylene blue

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~50 mg/mL (~156.32 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。