Guanylyl cyclase (sGC); Monoamine oxidase A (MAO-A); NO synthase (NOS)[1]

LPS 激活的 BV2 小胶质细胞可以改变其免疫学特征，并通过亚甲蓝 (Basic Blue 9)（4.5 μM；BV2 小胶质细胞）降低其 CD14、IL-1β、TNF-α 和 CCL2 mRNA 水平 [3]。

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Methylene blue (MB)/亚甲基蓝是吩噻嗪和其他衍生物的第一个先导化学结构，通常用于诊断程序和治疗高铁血红蛋白血症。我们之前已经证明，MB可以作为一种替代的线粒体电子转移载体，增强细胞耗氧量，并在体外和帕金森病和中风的啮齿动物模型中提供保护。在本研究中，我们使用MB和六种结构相关化合物研究了MB的体外构效关系。MB通过绕过线粒体复合物I-III的替代电子转移减少线粒体超氧化物的产生。MB减轻了反应性自由基的产生，并在HT-22细胞中提供了针对谷氨酸、IAA和鱼藤酮毒性的神经保护。显然，MB对葡萄糖氧化酶诱导的直接氧化应激没有保护作用。在MB的10个氮原子上替换侧链，使其对谷氨酸神经毒性的保护效力降低了1000倍。在3和7位没有侧链的化合物，氯苯噻嗪和吩噻嗪，与MB相比具有不同的氧化还原电位，不能增强线粒体电子转移，同时对谷氨酸、IAA和鱼藤酮损伤具有直接的抗氧化作用。与MB相比，氯苯噻嗪在线粒体裂解物分析中表现出直接的抗氧化作用，MB需要NADH和线粒体的还原。MB增加了复合物IV的表达和活性，而2-氯苯噻嗪没有影响。我们的研究表明，MB可以通过作为线粒体电子转移载体和线粒体中可再生的抗氧化剂来减弱超氧化物的产生[4]。

每 25 分钟一次以 50 和 100 mg/kg 的剂量腹膜内给予雄性 NMRI 小鼠一次亚甲蓝（Basic Blue 9）可减少前脉冲抑制的不足[1]。 ?在表达全长促聚集人类 Tau 能力的小鼠中，Basic Blue 9（20 和 40 mg/kg；口服；每天一次，持续 6 个月；CaMKIIα-tTA 反式激活小鼠）保留了认知能力[2]。 ?在经 TBI 治疗的雄性 BALB/c 小鼠中，Basic Blue 9（2 mg/kg；静脉注射；1 天一次）可减少最初的抑郁样行为以及 TBI 引起的水肿和神经炎症 [3]。 ?通过每天一次以 2 mg/kg 的剂量静脉注射亚甲蓝（Basic Blue 9），TBI 治疗的雄性 BALB/c 小鼠中炎症因子的百分比降低[3]。

线粒体膜电位分析[4]
如前所述，使用TMRE/NAO通过FRET分析线粒体膜电位。TMRE在正常线粒体膜电位下淬灭NAO荧光。随着膜电位的降低，TMRE荧光降低，导致NAO荧光增加。NAO荧光的增加被解释为线粒体膜电位的降低。细胞与谷氨酸和亚甲基蓝（MB）或相关化合物一起孵育12小时。然后移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后在37°C下在含有1µM NAO和1µM TMRE的PBS中孵育30分钟。移除NAO/TMRE，在KRH中于37°C下再孵育细胞15分钟。在PBS中洗涤细胞两次，使用Tecan Infinite F200平板读数器测量NAO荧光（激发485，发射530）。原始数据表示为RFU。然后根据对照和钙黄绿素AM细胞活力对NAO荧光进行标准化。

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活性氧物种分析[4]
使用荧光酶标仪、流式细胞术和荧光显微镜，通过ROS反应性荧光指示剂H2DCFDA（Anaspec）测量细胞ROS的变化。对于微孔板实验，HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度在96孔板中放置过夜。细胞与药物和20 mM谷氨酸在37°C和5%CO2下孵育12小时。然后移除培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后在37°C下在含有10µM H2DCFDA的PBS中孵育30分钟。移除PBS，在KRH中于37°C下再孵育细胞15分钟。在PBS中洗涤细胞两次，使用帝肯Infinite F200平板读数器测量DCF荧光（激发485，发射530）。原始数据表示为RFU。然后根据对照和钙黄绿素AM细胞存活率对DCF荧光进行标准化。对于荧光显微镜，HT-22细胞以10000个细胞/孔的密度铺在6孔板上。细胞在谷氨酸和指定药物中孵育8小时。8小时后，用含有10µM H2DCFDA的KRH培养基替换培养基。细胞在37°C下孵育15分钟，用KRH洗涤一次，然后在37°C下在新鲜KRH中再孵育10分钟。用新鲜的KRH缓冲液替换培养基，并对细胞进行成像。对于流式细胞术，HT-22细胞以50000个细胞/孔的密度接种在6孔培养皿中，并附着过夜。移除培养基，用含有新鲜DMEM（高糖、1 mM丙酮酸盐、10%FBS）的载体、10µM亚甲基蓝（MB）、20 mM谷氨酸盐或10µM亚甲基蓝（MB）。细胞在37°C和5%CO2下孵育8小时。孵育后，取出培养基，用PBS洗涤细胞一次，并在37°C下在含有10µM H2DCFDA的PBS中孵育15分钟。移除PBS，在37°C的PBS中再孵育细胞10分钟。用新鲜PBS替换PBS，用Beckman Coulter FC-500测定DCF荧光。

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线粒体裂解物氧化试验[4]
在含有500µM H2O2、10µM DCF的10 mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，在存在或不存在165µM NADH和线粒体裂解物（19.4µg/ml）的情况下，对四种化合物（亚甲基蓝（MB）、NR、2-氯吩噻嗪和氯丙嗪）进行了测定。在37°C下，在Greiner 96孔黑板上进行30分钟的测定，此时用Tecan Infinite F200板读数器测量DCF荧光（激发485，发射530）。

细胞活力测定[4]
通过钙黄绿素AM和MTT法测定细胞存活率。对于钙黄绿素AM测定，HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种，并在100µl DMEM（含1 mM丙酮酸和10%FBS的高糖）的96孔板中孵育过夜。向每个孔中加入不同浓度的亚甲基蓝（MB）或其衍生物和20 mM谷氨酸盐，并在37°C和5%CO2下孵育12小时。12小时后，取出培养基，用1µM的钙黄绿素AM PBS溶液替换。细胞在37°C下孵育5分钟，使用帝肯Infinite F200平板读数器测量荧光（激发485发射530）。对于MTT测定，将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种到100µl DMEM（高糖、1 mM丙酮酸、10%FBS）中的96孔平底板中，并允许其附着过夜。然后向每个孔中加入不同浓度的药物和20mM谷氨酸盐（或对照孔的培养基）。在37°C和5%CO2的条件下孵育板12小时。从培养箱中取出培养板，每孔加入20µl MTT（PBS中5mg/ml）。轻轻搅拌平板以将MTT混合到培养基中，然后将其放回培养箱中2小时。2小时后，取出培养基，向每个孔中加入100µl DMSO。通过温和搅拌将板混合，并用Tecan Infinite F200板读数器测量吸光度（560nm，参考670nm）。

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鱼藤酮神经毒性试验[4]
将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种到100µl DMEM（高糖、1 mM丙酮酸、10%FBS）中的96孔平底板中，并允许其附着过夜。然后向每个孔中加入不同浓度的亚甲基蓝（MB）或其衍生物和5µM鱼藤酮（或对照孔的培养基）。在37°C和5%CO2的条件下孵育板24小时。通过钙黄绿素AM测定存活率。

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葡萄糖氧化酶神经毒性试验[4]
将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种到100µl DMEM（高糖、1 mM丙酮酸、10%FBS）中的96孔平底板中，并允许其附着过夜。然后向每个孔中加入不同浓度的亚甲基蓝（MB）或其衍生物和2U葡萄糖氧化酶（或对照孔的培养基）。在37°C和5%CO2的条件下孵育板3小时。通过钙黄绿素AM测定存活率。

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碘乙酸（IAA）神经毒性试验[4]
将HT-22细胞以3000个细胞/孔的密度接种到100µl DMEM（高糖、1 mM丙酮酸、10%FBS）中的96孔平底板中，并允许其附着过夜。然后向每个孔中加入不同浓度的亚甲基蓝（MB）或其衍生物和20µM IAA（或对照孔的培养基）。将培养板在37°C和5%CO2的条件下孵育2小时。2小时后，取出所有培养基，用含有药物但不含IAA的新鲜培养基替换。在37°C和5%CO2的条件下，将平板再孵育22小时。通过钙黄绿素AM测定存活率。

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蛋白质印迹[4]
HT-22电池以150000/孔的密度镀在6孔板中。细胞附着过夜，第二天以指定浓度向细胞中加入亚甲基蓝（MB）或2-氯吩噻嗪。细胞生长3天，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液中裂解。将细胞裂解物装载到10%聚丙烯酰胺凝胶上，并转移到硝化纤维上。硝化纤维与第一抗体在4°C下以指定浓度（Cox1，1∶500；肌动蛋白，1∶3000）孵育过夜。与辣根过氧化物酶连接的二抗在室温下孵育2小时（1∶2000稀释）。用UVP Biospectrum 500检测化学发光。

动物/疾病模型：雄性NMRI小鼠[1]
剂量：50和100 mg/kg
给药途径：腹腔注射（ip）；一次，持续25分钟
实验结果：预脉冲抑制减弱，苯环利定（PCP）诱导的运动活性增加减弱。

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动物/疾病模型：CaMKIIα-tTA转激活小鼠[2]
剂量：20和40 mg/kg
给药途径：口服；每日一次，持续6个月
实验结果：抑制CaMKIIα-tTA转激活小鼠的Tau蛋白聚集。

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动物/疾病模型：经TBI处理的雄性balb/c（Bagg白化）小鼠[3]
剂量：2 mg/kg
给药途径：静脉注射（iv）；每日一次
实验结果：CD14、IL-1β、TNF-α和CCL2 mRNA水平降低。

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动物/疾病模型：经TBI处理的雄性balb/c（Bagg白化）小鼠[3]
剂量：2 mg/kg
给药途径：静脉注射（iv）；一次，持续 1 天
实验结果： 小胶质细胞中骨髓（CD11b+/GR1+）细胞的百分比降低，IL-1β 减少，IL-10 表达增强。

吸收、分布和排泄
主要经尿液和胆汁排泄。口服剂量约75%经尿液排泄，主要以稳定的无色亚甲蓝形式排出。
10 mg/kg（大鼠）。
3.0 ± 0.7 L/min。
……采用高效液相色谱法测定了7名志愿者静脉和口服100 mg亚甲蓝（含或不含美司钠）后全血中亚甲蓝的浓度。在大鼠十二指肠内和静脉给药后，测定了亚甲蓝在不同组织中的分布。静脉给药后，全血中亚甲蓝的浓度-时间曲线呈多相变化，估计末端半衰期为5.25小时。口服给药后，浓度-时间曲线下面积显著降低（9 nmol/min/mL vs 137 nmol/min/mL）。美司钠（一种可能通过离子对作用影响药物分布的药物）的联合给药并未改变亚甲蓝的药代动力学。静脉给药后，亚甲蓝及其白三烯形式的尿排泄量仅略高于静脉给药（18% vs 28% 剂量）。大鼠十二指肠内给药导致肠壁和肝脏中的药物浓度高于静脉给药，但全血和脑组织中的药物浓度低于静脉给药。亚甲蓝在器官中的分布差异是口服和静脉给药后药代动力学不同的主要原因。……亚甲蓝在胃肠道吸收良好，口服给药后约 1-2 小时达到血浆峰浓度。……亚甲蓝分布到组织后，迅速被还原为白三烯亚甲蓝（白三烯甲基硫铵氯化物）。新生儿代谢为白三烯亚甲蓝的效率可能低于成年人。亚甲蓝经尿液和胆汁排泄。口服亚甲蓝约75%经尿液排出，主要以稳定的无色亚甲蓝（白亚甲蓝）形式存在。尿液暴露于空气中会因氧化产物亚甲蓝砜（亚甲蓝砜）的存在而变为绿色或蓝色。部分未代谢的药物也会经尿液排出。
背景：尽管蓝色染料常规用于淋巴示踪，但由于担心胎儿风险，它不用于妊娠相关乳腺癌的淋巴示踪。方法：为了研究蓝色染料用于妊娠期乳腺癌淋巴示踪的安全性，我们对10名非妊娠女性进行了亚甲蓝染料的药代动力学研究，并将结果外推以估算胎儿对该染料的最大暴露量。结果：血浆和尿液检测结果表明，染料从乳腺注射部位迅速分布到血液循环中，48小时内有32%的总剂量经尿液排出。结合现有关于亚甲蓝器官分布的数据，估计胎儿最大剂量为0.25 mg（给药剂量的5%），其他与妊娠相关的生理因素可能进一步降低该剂量。结论：分析表明，亚甲蓝染料可用于妊娠相关乳腺癌的淋巴示踪，且对胎儿风险极低。
对成年雌性绵羊静脉注射15 mg/kg亚甲蓝后，测定了其体内分布和尿液排泄的药代动力学。比较了单独注射亚甲蓝和先注射50 mg/kg亚硝酸钠后注射亚甲蓝的情况。亚甲蓝的总消除速率常数（β）为0.0076 ± 0.0016 min⁻¹，不受预先注射亚硝酸钠的影响。然而，亚硝酸钠显著改变了亚甲蓝的分布速率。尽管亚甲蓝的半衰期相对较短，但尿液中以原形或无色亚甲蓝形式排出的亚甲蓝量极少。 ...

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代谢/代谢产物
亚甲蓝分布于组织后，迅速被还原为亚甲蓝（氯化亚甲蓝）。新生儿代谢为亚甲蓝的效率可能低于年长者。
亚甲蓝可被还原为无色的亚甲蓝；这些化合物共同构成一个可逆的氧化还原系统。低浓度亚甲蓝可加速高铁血红蛋白转化为血红蛋白。在高铁血红蛋白血症患者中，亚甲蓝被红细胞中的高铁血红蛋白还原酶还原为亚甲蓝；亚甲蓝随后将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。高浓度亚甲蓝可将还原型血红蛋白中的亚铁氧化为三价铁，从而使血红蛋白转化为高铁血红蛋白。
亚甲蓝分布到组织后，会迅速被还原为白亚甲蓝（白亚甲蓝氯化物）。新生儿代谢为白亚甲蓝的效率可能低于成年人。

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生物半衰期
5-6.5 小时（静脉注射后）。
静脉注射后，亚甲蓝的估计半衰期为 5-6.5 小时。
……采用高效液相色谱法测定了 7 名志愿者在静脉注射和口服 100 mg 亚甲蓝（含或不含美司钠）后全血中亚甲蓝的浓度。在十二指肠内和静脉注射亚甲蓝后，测定了大鼠体内亚甲蓝在不同组织中的分布。静脉注射亚甲蓝后，全血中亚甲蓝的浓度变化呈现多相过程，估计终末半衰期为5.25小时。

蛋白质结合
据报道，亚甲蓝与兔血浆的结合力很强（结合药物的71-77%）。

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鉴别与用途：亚甲蓝为固体。其水溶液呈深蓝色。它可用作细菌学染色剂、混合指示剂、染料、氧化还原比色剂以及黑色素瘤靶向剂。它还可用作治疗药物性高铁血红蛋白血症的药物。人体研究：高铁血红蛋白血症通常用亚甲蓝治疗。然而，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者中，亚甲蓝可诱发高铁血红蛋白血症。临床前研究表明，低剂量亚甲蓝可增加大脑中线粒体细胞色素氧化酶的活性，并改善学习任务（包括恐惧消退）后的记忆保持。1%亚甲蓝的眼内注射对角膜内皮和虹膜上皮具有细胞毒性作用。据报道，接受亚甲蓝联合血清素活性药物治疗的患者中，有多例疑似血清素综合征病例。另有报道称，输注亚甲蓝处理的血浆后出现过敏性超敏反应。一名早产儿在经肠道给予亚甲蓝后出现高铁血红蛋白血症和溶血性贫血。流行病学证据表明，亚甲蓝具有致畸性，孕期用药可能对胎儿造成伤害。羊膜穿刺术中使用亚甲蓝与新生儿回肠和空肠闭锁、回肠梗阻及其他不良反应有关。孕期使用亚甲蓝可导致新生儿出现溶血性贫血、高胆红素血症、高铁血红蛋白血症、呼吸窘迫、皮肤染色和光毒性。动物实验：亚甲蓝处理导致高铁血红蛋白形成和红细胞氧化损伤，进而引起再生性贫血以及一系列继发于红细胞损伤的组织和生化改变。早期变化之一是高铁血红蛋白水平呈剂量依赖性升高，大鼠和小鼠的反应程度相似。小鼠似乎比大鼠更容易出现海因茨小体形成和贫血，贫血的特征是血红蛋白、血细胞比容和红细胞计数下降。所有受试小鼠以及100 mg/kg（仅限雄性）和200 mg/kg剂量组的大鼠在尸检时均出现脾肿大。亚甲蓝对大鼠具有胚胎毒性。亚甲蓝导致小鼠在妊娠18天（足月妊娠）前分娩。分别接受 50、60 和 85 mg/kg 亚甲蓝治疗的动物中，有 45%、50% 和 83% 观察到这种反应。在无细胞条件下，亚甲蓝可诱导 DNA 损伤。其特征是产生大量对修复内切酶 FPG 蛋白（甲酰胺嘧啶-DNA 糖苷酶）敏感的碱基修饰。亚甲蓝在培养的哺乳动物细胞中具有致突变性。相比之下，小鼠微核试验的结果表明，其遗传毒性在体内并不明显。兽医使用亚甲蓝治疗的最大担忧是可能导致海因茨小体贫血或其他红细胞形态改变、高铁血红蛋白血症以及红细胞寿命缩短。猫往往对这些影响非常敏感，一些人认为亚甲蓝禁用于猫科动物，但犬和马在相对较低的剂量下也可能出现血液系统不良反应。生态毒性研究：亚甲蓝对神仙鱼具有致畸作用。

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非人类毒性值：小鼠静脉注射LD50为77 mg/kg
小鼠腹腔注射LD50为150 mg/kg
小鼠口服LD50为3500 mg/kg
大鼠静脉注射LD50为1250 mg/kg

[1]. Phencyclidine-induced behaviour in mice prevented by methylene blue. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2004 Feb;94(2):65-72.

[2]. Preventive methylene blue treatment preserves cognition in mice expressing full-length pro-aggregant human Tau. Acta Neuropathol Commun. 2015 May 10;3:25.

[3]. Methylene blue attenuates traumatic brain injury-associated neuroinflammation and acute depressive-like behavior in mice. J Neurotrauma. 2015 Jan 15;32(2):127-38.

[4]. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One . 2012;7(10):e48279.

亚甲蓝是一种有机氯化物盐，其抗衡离子为3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓。它是一种常用染料，同时具有抗氧化、抗疟疾、抗抑郁和心脏保护作用。亚甲蓝可用作EC 1.4.3.4（单胺氧化酶）抑制剂、酸碱指示剂、荧光染料、抗抑郁药、心脏保护剂、EC 3.1.1.8（胆碱酯酶）抑制剂、组织学染料、EC 4.6.1.2（鸟苷酸环化酶）抑制剂、抗氧化剂、抗菌剂、神经保护剂、物理示踪剂和抗疟疾药。它含有3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-鎓。亚甲蓝是一种氧化还原剂。静脉注射用亚甲蓝已获美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准，用于治疗儿童和成人获得性高铁血红蛋白血症。历史上，亚甲蓝曾在非洲广泛用于治疗疟疾，但随着氯喹 (CQ) 和其他药物的上市，其应用已逐渐减少。亚甲蓝作为泌尿道消毒剂的用途也曾被研究。甲基硫铵氯化物（INN，或称亚甲蓝，拟定商品名为 Rember）是由阿伯丁大学和 TauRx Therapeutics 公司联合研发的一种在研药物，早期临床试验表明其可抑制 Tau 蛋白聚集。该药物有望用于治疗阿尔茨海默病患者。亚甲蓝是一种合成碱性染料。它能与带负电荷的细胞成分（如核酸）发生染色；在肿瘤手术中，当将亚甲蓝注入肿瘤淋巴床时，它可对引流淋巴结进行染色，从而有助于肿瘤前哨淋巴结的定位。低剂量静脉注射时，该药物可将高铁血红蛋白转化为血红蛋白。
该化合物为深绿色晶体或结晶性粉末，具有青铜光泽。溶于水或酒精后呈深蓝色。亚甲蓝可用作细菌染色剂和指示剂。它能抑制鸟苷酸环化酶，曾用于治疗氰化物中毒和降低高铁血红蛋白水平。

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适应症
适用于治疗儿童和成人获得性高铁血红蛋白血症。亚甲蓝的其他临床应用包括改善各种临床状态相关的低血压、作为泌尿道感染的消毒剂、治疗肝硬化和严重肝肺综合征引起的缺氧和高动力循环，以及治疗异环磷酰胺引起的神经毒性。
Lumeblue 适用于作为诊断剂，增强接受筛查或监测性结肠镜检查的成年患者结直肠病变的显像。
用于药物和化学品引起的急性高铁血红蛋白血症的急性症状治疗。甲基硫铵氯化物 Proveblue 适用于成人、儿童和青少年（0 至 17 岁）。

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作用机制
主要作用机制涉及抑制一氧化氮合酶和鸟苷酸环化酶。 在阿尔茨海默病中：一项机制研究发现，亚甲蓝氧化 tau 蛋白上的半胱氨酸巯基，以保持 tau 蛋白的单体状态。一项针对tau蛋白病小鼠的临床前治疗研究报告称，亚甲蓝可通过Nrf2/抗氧化反应元件（ARE）介导抗炎或神经保护作用；另一项研究报告称，早期给药可减少不溶性tau蛋白，并改善学习和记忆能力。 在高铁血红蛋白血症中：亚甲蓝通过与红细胞内的反应生成白细胞亚甲蓝发挥作用，白细胞亚甲蓝是一种还原剂，可将氧化血红蛋白中的三价铁离子（Fe+++）还原为携带氧气的二价铁离子（Fe++）。 作为抗疟药：亚甲蓝是恶性疟原虫谷胱甘肽还原酶的特异性抑制剂，具有逆转氯喹耐药性的潜力，并且其作用机制与4-氨基喹啉类抗疟药类似，可阻止血红素聚合为血红素晶体。 对于异环磷酰胺引起的神经毒性：亚甲蓝可作为替代电子受体发挥作用。它能逆转肝脏糖异生引起的NADH抑制，同时阻断氯乙胺转化为氯乙醛。此外，它还能抑制多种胺氧化酶的活性，从而阻止氯乙醛的生成。
本研究在培养的兔肺动脉平滑肌细胞中探讨了亚甲蓝（一种可溶性鸟苷酸环化酶的潜在抑制剂）调节环磷酸鸟苷（cGMP）积累的机制。在短期共培养中，用硝普钠、亚硝基硫醇或牛肺动脉内皮细胞基础释放的内皮舒张因子刺激对照组或亚甲蓝预处理的兔肺动脉平滑肌细胞。推测的内皮舒张因子S-亚硝基-L-半胱氨酸、S-亚硝基-L-半胱氨酸的稳定脱氨类似物、S-亚硝基-3-巯基丙酸和硝普钠均能浓度依赖性地（1-100 μM）增加兔肺动脉平滑肌细胞中环磷酸鸟苷（cGMP）的水平（增加1.5至12倍）。亚甲蓝预处理可抑制S-亚硝基-L-半胱氨酸和硝普钠诱导的cGMP积累51%至100%，但亚甲蓝对S-亚硝基-3-巯基丙酸介导的反应无影响。亚甲蓝对硝基血管扩张剂诱导的环磷酸鸟苷（cGMP）积累的抑制作用，可通过黄嘌呤（100 μM）和黄嘌呤氧化酶（5 mU）在细胞外生成超氧阴离子进行定量重现。与亚甲蓝预处理类似，超氧阴离子的生成对基础cGMP水平或S-亚硝基-3-巯基丙酸诱导的cGMP反应均无影响。此外，亚甲蓝可剂量和时间依赖性地诱导兔肺动脉平滑肌细胞生成超氧阴离子，这可通过分光光度法测定细胞色素c的还原来证实。亚甲蓝对S-亚硝基-L-半胱氨酸和硝普钠诱导的cGMP积累的抑制作用可被超氧化物歧化酶完全阻断，但不能被过氧化氢酶阻断。在与未经处理的兔肺动脉平滑肌共培养之前，用亚甲蓝选择性地预处理内皮细胞，可降低兔肺动脉平滑肌的环磷酸鸟苷（cGMP）水平，其降低幅度与亚甲蓝预处理的兔肺动脉平滑肌与未经处理的内皮细胞共培养时观察到的降低幅度相当，并且超氧化物歧化酶可部分抑制这种降低。

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精神分裂症是一个主要的公共卫生问题，影响着全球约1%的人口。苯环利定（PCP）是一种具有显著致精神病特性的药物，可在人类中诱发类似精神分裂症的症状。苯环利定会破坏啮齿动物的声惊反射前脉冲抑制，而精神分裂症患者的这种抑制作用也已被证实存在。一氧化氮合酶（NOS）抑制剂可阻断这种效应，表明一氧化氮在苯环利定的这种效应中起着重要作用。亚甲蓝是一种鸟苷酸环化酶和一氧化氮合酶抑制剂，已显示出作为传统抗精神病药物辅助治疗精神分裂症的疗效。本研究旨在探讨苯环利定（4 mg/kg）诱导的小鼠前脉冲抑制破坏是否受亚甲蓝（50 或 100 mg/kg）的影响。此外，本研究还探讨了亚甲蓝（50 mg/kg）对苯环利定（4 mg/kg）诱导的运动亢进的影响。结果表明，苯环利定可轻易破坏小鼠的前脉冲抑制，但不影响单独脉冲刺激试验。研究还发现，亚甲蓝以剂量依赖的方式抑制苯环利定引起的前脉冲抑制减弱。此外，亚甲蓝预处理可降低苯环利定引起的运动亢进。本研究结果进一步支持了苯环利定药理学和行为学效应与一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶通路相关的观点。由于苯环利定也具有精神病样特征，因此干扰一氧化氮合酶/鸟苷酸环化酶通路的药物可能对精神分裂症的治疗也具有治疗价值。[1]

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引言：由Tau蛋白组成的神经原纤维缠结（NFT）是阿尔茨海默病神经退行性变的标志。表达全长促聚集人Tau蛋白（2N4R Tau-ΔK280，简称Tau(ΔK)）或其重复结构域（TauRD-ΔK280，简称TauRD(ΔK)）的转基因小鼠会逐渐出现Tau蛋白病理改变，包括Tau蛋白的错误分选、磷酸化、聚集、突触丢失和功能缺陷。 TauRD(ΔK) 会组装成神经纤维缠结 (NFT) 并伴随神经元死亡，而 Tau(ΔK) 则会在不引起明显神经元丢失的情况下聚集形成 Tau 蛋白原缠结。两种形式的 Tau 蛋白均会导致类似的认知功能下降（分别在 10 个月和 12 个月时发病），而关闭转基因表达后，认知功能下降均可得到恢复。由于亚甲蓝 (MB) 能够在体外抑制 Tau 蛋白聚集，我们研究了 MB 是否能够预防或改善我们小鼠模型中 Tau 蛋白引起的认知障碍。我们采用不同的预防和治疗方案，分别在疾病发作前或发作后开始口服 MB，并对两种类型的小鼠进行给药。通过行为学测试（旷场实验、莫里斯水迷宫实验）评估小鼠的认知状态，以确定最佳的治疗干预条件。结果：预防性和治疗性 MB 应用均未能阻止或改善 TauRD(ΔK) 小鼠的学习和记忆缺陷。同样，在认知障碍发作后开始的治疗性 MB 治疗对 Tau(ΔK) 小鼠也无效。相反，在功能障碍出现之前开始预防性应用亚甲蓝（MB）可以保护Tau(ΔK)小鼠的认知功能。除了学习和记忆能力的改善外，MB治疗的Tau(ΔK)小鼠还表现出不溶性Tau蛋白的显著减少、构象改变的Tau蛋白（MC1）和磷酸化Tau蛋白（AT180、PHF1）的减少，以及蛋白质降解系统（自噬和蛋白酶体）的上调。这表明MB除了作为Tau蛋白聚集抑制剂的特性外，还具有其他多效性作用。结论：我们的数据支持将Tau蛋白聚集抑制剂作为治疗阿尔茨海默病和其他tau蛋白病的潜在药物，并强调了在认知障碍出现之前进行预防性治疗的必要性。[2]

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创伤性脑损伤（TBI）与脑水肿、血脑屏障破坏和神经炎症有关，这些因素都会影响损伤的严重程度和功能恢复。遗憾的是，目前尚无有效的预防性治疗方法来限制TBI的近期或远期后果。因此，本研究旨在确定抗氧化剂亚甲蓝（MB）在减轻弥漫性脑损伤相关炎症和行为并发症方面的疗效。我们发现，在小鼠中线液体冲击伤后立即静脉注射MB（创伤性脑损伤后15-30分钟）可减轻脑水肿、抑制小胶质细胞活化、减少神经炎症并改善行为恢复。具体而言，MB在损伤后1天显著降低了海马中创伤性脑损伤相关的脑水肿和炎症基因表达。此外，MB干预在损伤后1天减弱了富集的小胶质细胞/巨噬细胞中创伤性脑损伤诱导的炎症基因表达（白细胞介素[IL]-1β、肿瘤坏死因子α）。脂多糖激活的BV2小胶质细胞培养实验证实，MB治疗可直接降低小胶质细胞中IL-1β的水平并增加IL-10的水平。最后，研究人员在脑外伤后一周内评估了功能恢复情况和抑郁样行为。MB干预并未阻止脑外伤后1-7天内体重或运动协调能力的下降。然而，MB减轻了脑外伤后7天急性抑郁样行为的发展。综上所述，立即使用MB进行干预可有效减轻弥漫性脑损伤后的神经炎症并改善行为恢复。因此，MB干预可能减少脑外伤的危及生命的并发症，包括脑水肿和神经炎症，并预防神经精神并发症的发生。[3]

C16H18CLN3S

319.85222

319.091

C, 60.08; H, 5.67; Cl, 11.08; N, 13.14; S, 10.02

61-73-4

Methylene blue trihydrate;7220-79-3;Methylene blue hydrate;122965-43-9; 61-73-4 (Cl)

6099

Reddish brown to brown solid powder

1.0 g/mL at 20 °C

190 °C (dec.)(lit.)

45 °C

47.38

0

4

1

21

483

0

CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C16H18N3S.ClH/c1-18(2)11-5-7-13-15(9-11)20-16-10-12(19(3)4)6-8-14(16)17-13;/h5-10H,1-4H3;1H/q+1;/p-1

[7-(dimethylamino)phenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;chloride

CI52015; 61-73-4; Basic blue 9; Methylthioninium chloride; Solvent blue 8; Swiss Blue; Methylene Blue anhydrous; Chromosmon; Methylene blue

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~50 mg/mL (~156.32 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。