Ac-DEVD-pNA   中文名称: N-乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸--天冬氨酸-对硝基苯胺

Caspase-3/7

所有3种中国仓鼠半胱天冬酶都能有效地切割相应的人类同源物。然而，在其他底物上的活性也被观察到，特别是caspase-8（图2B）。中国仓鼠caspase-8对人caspase-9的底物Ac-LEHD-pNA活性最高。它切割Ac-LEHD-pNA的速度是为人类caspase-8设计的底物Ac-IETD-pNA的1.4倍。此外，中国地鼠caspase-8对caspase-3和-7 （Ac-DEVD-pNA）、caspase-2 （Ac-VDVAD-pNA）和caspase-6 （Ac-VEID-pNA）设计的底物也显示出相当大的酶活性。中国仓鼠caspase-2是最特异性的，因为它最有效地切割caspase-2 VDVAD五肽底物，并且对Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA仅显示剩余的反应性。人类caspase-9的指定底物Ac-LEHD-pNA也是中国仓鼠caspase-9的最佳底物。然而，中国仓鼠caspase-9对Ac-WEHD-pNA、Ac-VEID-pNA和Ac-IETD-pNA也表现出相当大的活性。它切割Ac-WEHD-pNA的效率（49%）几乎是切割Ac-LEHD-pNA的一半。[2]

酶动力学分析
CZaspase-3活性测定采用比色法caspase-3底物Ac- devd -pNA，其中Ac为乙酰基，pNA为对硝基苯胺。Caspase-3在反应缓冲液(50 mM Hepes (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1% （v/v) Chaps, 10% （v/v）甘油，1 mM EDTA， 10 mM二硫苏糖醇）中室温孵育5分钟，然后加入不同浓度的底物。酶裂解释放的对硝基苯胺在405nm波长处用Polarstar Optima酶标仪测定。31 .使用SigmaPlot 9.0通过拟合反应速度得到Km和Vmax值caspase-3底物的催化常数kcat: Ac-DEVD-pNA, Ac-DMQD-pNA, Ac-DVAD-pNA， Ac-VDVAD-pNA和Ac-LDVAD-pNA通过公式kcat = Vmax/[E]测定，其中[E]值在Ki测定过程中通过活性位点滴定法测定，如下所述。caspase-7也采用了同样的方法。[1]

Caspase活性测定[2]
将表达重组中国鼠半胱天冬酶的冷冻大肠杆菌细胞颗粒解冻，用1.5 ml裂解缓冲液（5 mM DTT, 10 mM HEPES pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS/NP40）裂解10分钟，并在冰上孵育。裂解物超声进一步破坏细胞和DNA等大分子。然后将细胞裂解液以13000 rpm离心5分钟。收集上清液中的细胞质提取物。通过测定595 nm处的吸光度，用Pierce's Coomasie Plus-The Better Bradford Assay Reagent测定这些裂解物的蛋白质浓度。在96孔板上，将50 μl大肠杆菌裂解液与Chemicon比色测定试剂盒提供的缓冲液和ddH2O混合至95 μl。然后加入5 μl对硝基苯胺（pNA）标记的caspase底物（Ac-DEVD-pNA、Ac-IETD-pNA、Ac-LEHD-pNA、Ac-VDVAD-pNA、Ac-WEHD-pNA和Ac-VEID-pNA）。反应混合物在37℃下孵育2小时。通过在Tecan GENios微孔板读取器上跟踪405 nm （OD405）吸光度变化，监测caspase裂解从底物释放游离pNA发色团。每个样品的Caspase活性是根据OD405的初始增加率来确定的。背景对照使用不表达重组半胱天冬酶的大肠杆菌细胞裂解物。[2]

[1]. Structural and kinetic analysis of caspase-3 reveals role for s5 binding site in substrate recognition. J Mol Biol. 2006 Jul 14;360(3):654-66.

[2]. Specific inhibition of caspase-8 and -9 in CHO cells enhances cell viability in batch and fed-batch cultures. Metab Eng. 2007 Sep-Nov;9(5-6):406-18.

本研究利用肽类似物抑制剂和在P2、P3和P5位点存在差异的底物，探讨了人caspase-3底物特异性的分子基础。我们解析了caspase-3与底物类似物复合物的晶体结构，分辨率为1.7 Å至2.3 Å。caspase-3与这些类似物相互作用的差异与Ac-DEVD-Cho、Ac-VDVAD-Cho和Ac-DMQD-Cho的Ki值分别为1.3 nM、6.5 nM和12.4 nM，以及相应肽底物的相对kcat/Km值分别为100%、37%和17%相符。结合的肽类似物在主链原子以及保守的P1 Asp和P4 Asp位点表现出非常相似的相互作用，而P2和P3位点的相互作用则有所不同。 P2 位于疏水性的 S2 沟槽中，这与 Ac-DMQD-Cho 的 P2 位点为 Gln 且具有极性的抑制作用较弱相一致。S3 是一个表面亲水位点，与 Ac-DEVD-Cho 中的 P3 位点 Glu 存在有利的极性相互作用。Ac-DMQD-Cho 和 Ac-VDVAD-Cho 的 P3 位点残基均为疏水性，且并非位于极性 S3 位点的最佳位置，这与它们抑制作用较弱相一致。在 caspase-3 中发现了一个疏水性的 S5 位点，其中 Phe250 和 Phe252 的侧链与 Ac-VDVAD-Cho 的 P5 位点 Val 相互作用，并通过构象变化包围底物结合位点。通过比较 caspase-3 底物 Ac-VDVAD-pNA 和 Ac-LDVAD-pNA 对 Ac-DVAD-pNA 的水解效率，证实了疏水性 P5 位点残基的动力学重要性。相比之下，caspase-7 对 P5 位点为 Val 或 Leu 的底物的水解效率低于 Ac-DVAD-pNA。caspase-3 和 caspase-2 具有相似的疏水性 S5 位点，而 caspase-1、7、8 和 9 的疏水性残基在结构上并不相同；这些 caspase 对底物 P5 位点的选择性可能存在差异。对 P5 位点的选择性差异将有助于确定每种 caspase 的特定底物和相关信号通路。[1]

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为了研究导致中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞在分批培养和补料分批培养中凋亡的分子机制，我们从 CHO cDNA 文库中克隆了 caspase-2、-8 和 -9。在大肠杆菌中表达的重组中国仓鼠caspase-2和-9对商业肽底物Ac-VDVAD-pNA和Ac-LEHD-pNA（分别是人caspase-2和-9的指定商业底物）表现出最高的活性。然而，中国仓鼠caspase-8表现出广泛的底物特异性，其切割caspase-9底物的效率高于切割caspase-8底物的效率。市售的氟甲基酮类caspase抑制剂，例如Z-LEHD-fmk、Z-IETD-fmk、Z-VDVAD-fmk和Z-DEVD-fmk，被证实完全缺乏抑制这些caspase的特异性。人caspase-8和-9的可逆醛类抑制剂Ac-LEHD-CHO和Ac-IETD-CHO对中国仓鼠caspase-8的抑制效率相当。因此，目前广泛使用的利用“caspase特异性”抑制剂来追踪单个caspase在细胞死亡中作用的方法可能并不准确，甚至会产生误导。作为一种替代方法，我们稳定表达了中国仓鼠caspase-2、-8和-9的显性负性(DN)突变体，以特异性抑制CHO细胞中的这些酶。结果表明，抑制内源性caspase-8或caspase-9均能提高CHO细胞在分批培养和补料分批悬浮培养中的存活率，而抑制caspase-2的效果甚微。这些结果提示caspase-8和-9可能参与CHO细胞在分批培养和补料分批培养中的凋亡过程，而caspase-2则不参与。这些发现对于开发基因工程改造CHO细胞以对抗分批培养和补料分批培养中细胞凋亡的策略具有重要价值。[2]

C26H34N6O13

638.58056

638.218

C, 48.90; H, 5.37; N, 13.16; O, 32.57

189950-66-1

11527474

Ac-Asp-Glu-Val-Asp-pNA; N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilide

Ac-DEVD-p-Nitroanilide; DEVD

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1187.0±65.0 °C at 760 mmHg

671.6±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.593

1.09

303.22

8

13

17

45

1150

4

CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NC1=CC=C(C=C1)[N+](=O)[O-])NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)C

GGXRLUDNGFFUKI-ORGXJRBJSA-N

InChI=1S/C26H34N6O13/c1-12(2)22(26(43)30-18(11-21(38)39)24(41)28-14-4-6-15(7-5-14)32(44)45)31-23(40)16(8-9-19(34)35)29-25(42)17(10-20(36)37)27-13(3)33/h4-7,12,16-18,22H,8-11H2,1-3H3,(H,27,33)(H,28,41)(H,29,42)(H,30,43)(H,31,40)(H,34,35)(H,36,37)(H,38,39)/t16-,17-,18-,22-/m0/s1

(4S)-4-[[(2S)-2-acetamido-3-carboxypropanoyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid

Ac-DEVD-pNA; Ac-Asp-Glu-Val-Asp-PNA; N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide; MFCD00792707; (4S)-4-[[(2S)-2-acetamido-3-carboxypropanoyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid; Z-VDVAD-pNA?; N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-pna; SCHEMBL2028887;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~110 mg/mL (~172.26 mM)
H2O : ~0.67 mg/mL (~1.05 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (4.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 27.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (4.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (4.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。