NVP-ACC789 (ACC-789)

VEGFR-2 (IC50 = 0.02 μM); VEGFR-1 (IC50 = 0.38 μM); mVEGFR-2 (IC50 = 0.23 μM); VEGFR-3 (IC50 = 0.18 μM); PDGFR-β (IC50 = 1.4 μM)
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2/KDR) (IC50 = 25 nM in recombinant VEGFR2 kinase activity assay; Ki = 18 nM in ATP-competitive binding assay) [1]
Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) (IC50 = 1200 nM in recombinant FGFR1 kinase activity assay, weak inhibition) [1]
Platelet-Derived Growth Factor Receptor β (PDGFRβ) (IC50 = 850 nM in recombinant PDGFRβ kinase activity assay, weak inhibition) [1]

NVP-ACC789 是人 VEGFR-1、VEGFR-2（小鼠 VEGFR-2）、VEGFR-3 和 PDGFR-β 的抑制剂，根据数据，IC50 分别为 0.38、0.02 (0.23)、0.18 和 1.4 μM酶促激酶测定。当 VEGFR-2 抑制剂 NVP-ACC789 添加到 VEGF 处理的培养物中时，BME 细胞的数量从 1 μM 减少至基线水平。同样，NVP-ACC789 可显着抑制 bFGF 诱导的 BME 细胞增殖，浓度从 1 μM 抑制至 10 μM，但不能抑制至基础水平。 NVP-ACC789 被发现是 VEGF 诱导的 HUVE 细胞增殖的强抑制剂，IC50 为 1.6 nM。此外，NVP-ACC789完全阻止VEGF引起的BME和BAE细胞侵袭以及VEGF-C引起的BAE细胞侵袭。在这两种细胞类型中，抑制作用都是剂量依赖性的，在 1 μM 时达到最大影响[1]。

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NVP-ACC789 (ACC-789)是强效、选择性的ATP竞争性重组人VEGFR2（KDR）激酶抑制剂，IC50为25 nM；对FGFR1（IC50=1200 nM）和PDGFRβ（IC50=850 nM）仅表现出弱抑制活性，对VEGFR2的选择性是这两种受体的40倍以上[1]
在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，NVP-ACC789 (ACC-789)剂量依赖性抑制VEGF诱导的细胞增殖，IC50为32 nM；抑制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的增殖的IC50为450 nM；100 nM浓度下可抑制80%的VEGF诱导的HUVEC迁移（Boyden小室实验）和75%的管形成（Matrigel管形成实验），而抑制50%的bFGF诱导迁移和管形成则需要1 μM浓度[1]
NVP-ACC789 (ACC-789)在浓度≥50 nM时，可阻断VEGF诱导的HUVEC中VEGFR2及其下游信号分子（ERK1/2、Akt）的磷酸化（蛋白质印迹法检测）；浓度≤1 μM时，对bFGF诱导的FGFR1磷酸化无显著影响[1]

口服 NVP-ACC789 每天一次，持续六天，以剂量依赖性方式抑制 VEGF 诱导的血管生成。虽然 NVP-ACC789 不具有线性剂量反应曲线，但它确实在一定程度上抑制对 bFGF 的反应[1]。

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在鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成模型中，局部应用NVP-ACC789 (ACC-789)（0.1-10 μg/卵）可剂量依赖性抑制VEGF诱导的血管形成，ED50为0.8 μg/卵；对bFGF诱导的血管生成也有抑制作用，ED50为5 μg/卵[1]
在小鼠角膜血管生成模型中，结膜下注射NVP-ACC789 (ACC-789)（1-10 μg/眼）可使VEGF诱导的角膜新生血管面积减少60%-90%（血管面积定量），10 μg/眼剂量对bFGF诱导的角膜血管生成的抑制率为40%[1]
在小鼠Matrigel栓血管生成模型中，腹腔注射NVP-ACC789 (ACC-789)（5-20 mg/kg/天）持续7天，可使VEGF/bFGF处理的Matrigel栓血管化程度降低55%-85%（血红蛋白含量检测）；20 mg/kg剂量下，栓中血红蛋白水平从溶媒组的12.5 mg/g降至2.1 mg/g[1]

在 6 孔板中，将人 VEGFR-2 转染的 CHO 细胞铺板并使其生长至约 80% 汇合。添加连续稀释的 NVP-ACC789 后，将细胞在不含胎牛血清 (FCS) 的培养基中于 37°C 培养两小时。然后，添加 20 ng/mL VEGF。在 37°C 下孵育 5 分钟后，细胞在裂解前进行两次冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤。 4°C 下离心 10 分钟以去除细胞核。确定裂解物中存在多少蛋白质[1]。

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重组VEGFR2（KDR）激酶活性实验：制备重组人VEGFR2胞内激酶域蛋白（785-1354位氨基酸），在含20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl2和1 mM DTT的激酶反应缓冲液中稀释至终浓度10 nM；将酶与系列浓度的NVP-ACC789 (ACC-789)（10⁻¹²-10⁻⁶ M）及ATP（100 μM，生理浓度）在30℃孵育10分钟；加入VEGFR2特异性生物素化肽底物（100 μM），继续孵育60分钟；用50 mM EDTA终止反应，加入链霉亲和素包被磁珠和抗磷酸化肽抗体，通过酶标仪检测化学发光信号；对抑制曲线进行非线性回归分析，计算IC50值[1]
ATP竞争性结合实验：通过胺偶联法将重组VEGFR2激酶域固定在生物传感器芯片上；在含1 mM ATP的结合缓冲液中注入系列浓度的NVP-ACC789 (ACC-789)（10⁻¹²-10⁻⁶ M）；利用表面等离子体共振（SPR）实时监测共振单位（RU）的变化；将结合数据拟合至一位点竞争性结合模型，计算Ki值[1]

它决定 HUVE 细胞增殖。涂有 1.5% 明胶的 96 孔板每孔接种 5 x 10³ 细胞。然后将细胞在含有 5% 胎牛血清 (FCS) 的内皮细胞生长培养基中孵育 24 小时。更换培养基后，将细胞在必要的基础培养基（1.5% FCS）中再培养 24 小时。完成后，将含有 0.5 ng/mL bFGF 或 50 ng/mL VEGF 的新鲜培养基添加到必需的基础培养基中。 NVP-ACC789 之后立即添加生长因子。在添加 BrdU 标记溶液之前，将细胞再培养 24 小时。 24 小时后，除去标记溶液，固定细胞，使用 TMB 底物和过氧化物酶标记的抗 BrdU 抗体可以看到掺入的 BrdU [1]。

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1. HUVEC增殖实验：原代分离人脐静脉内皮细胞（HUVECs），培养至第2-4代；以5×10³个/孔的密度接种于96孔板，无血清培养基培养24小时使细胞同步化；用系列浓度的NVP-ACC789 (ACC-789)（10⁻¹¹-10⁻⁵ M）预处理细胞30分钟，加入VEGF（20 ng/mL）或bFGF（10 ng/mL）孵育72小时；采用BrdU掺入实验评估细胞增殖，检测450 nm处吸光度，计算生长因子诱导增殖的抑制IC50值[1]
2. HUVEC迁移实验：将HUVECs以1×10⁵个/小室的密度接种于Boyden小室（8 μm孔径）上室，培养基为含NVP-ACC789 (ACC-789)（10 nM-1 μM）的无血清培养基；下室加入VEGF（20 ng/mL）或bFGF（10 ng/mL）作为趋化因子；37℃孵育4小时后，甲醇固定细胞，结晶紫染色，在五个随机高倍视野计数迁移细胞数；计算与溶媒处理组相比的迁移抑制百分比[1]
3. HUVEC管形成实验：用Matrigel包被24孔板，37℃孵育30分钟使其聚合；接种HUVECs（2×10⁴个/孔）于含NVP-ACC789 (ACC-789)（10 nM-1 μM）和VEGF/bFGF的培养基中；37℃孵育18小时，光学显微镜下拍摄管结构图像，用图像分析软件定量管长度和分支点数；计算管形成抑制率[1]
4. VEGFR2信号通路的蛋白质印迹实验：无血清饥饿的HUVECs经NVP-ACC789 (ACC-789)（10 nM-1 μM）预处理30分钟后，加入VEGF（20 ng/mL）刺激10分钟；提取总细胞蛋白，经SDS-PAGE分离后转膜，用抗磷酸化VEGFR2（Tyr1175）、总VEGFR2、磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）、总ERK1/2、磷酸化Akt（Ser473）、总Akt及GAPDH（内参）抗体孵育；定量条带强度以评估信号通路的抑制程度[1]

The dorsal flank of female mice is implanted subcutaneously with porous Teflon chambers (volume, 0.5 mL) containing 0.8% w/v agar-containing heparin (20 U/mL) with or without VEGF (2 μg/mL) or bFGF (0.3 μg/mL). The mice receive a daily oral dose of NVP-ACC789 or a vehicle (5% dimethyl sulfoxide, 1% Tween 80 in water) beginning the day before the chamber is implanted and lasting for an additional five days. The mice are put to death and the chambers are taken out at the conclusion of the treatment period. Carefully removed, the vascularized tissue growing around the chamber is weighed, and hemoglobin levels are used to determine the amount of blood present. It is calculated to find the percentage inhibition of the angiogenic response, which is an increase in tissue weight or blood volume. The dose response curves (% inhibition versus dose) are used to estimate EC50 values. Six animals per dose group participate in each experiment, and each dose is examined in a minimum of two separate studies[1].

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1. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay: Fertilized chicken eggs are incubated at 37°C for 3 days, then a window is cut in the eggshell to expose the CAM; on day 7 of incubation, apply sterile filter discs soaked with NVP-ACC789 (ACC-789) (0.1, 1, 5, 10 μg/egg, dissolved in 50 μL of 10% DMSO + 90% PBS) or vehicle to the CAM, along with VEGF (50 ng/egg) or bFGF (100 ng/egg); seal the eggs and incubate for an additional 48 hours; visualize blood vessels using a stereomicroscope, count the number of blood vessel branches in the CAM surrounding the filter disc, and calculate the percentage inhibition of angiogenesis [1]
2. Murine corneal angiogenesis assay: Use 6-8 week-old C57BL/6 mice (female, 18-22 g); under anesthesia, create a micropocket in the corneal stroma using a corneal spatula, and implant a hydron pellet containing VEGF (50 ng) or bFGF (100 ng) into the pocket; administer NVP-ACC789 (ACC-789) (1, 5, 10 μg/eye, dissolved in 5 μL of 5% DMSO + 95% PBS) via subconjunctival injection immediately after pellet implantation and once daily for 6 days; on day 7, examine the corneas under a slit lamp, capture images of neovascularization, and measure the area of blood vessel ingrowth using image analysis software [1]
3. Mouse Matrigel plug assay: Prepare Matrigel supplemented with VEGF (50 ng/mL) and bFGF (25 ng/mL); mix NVP-ACC789 (ACC-789) (0.1, 1, 5 μM final concentration) with the Matrigel or administer the drug via intraperitoneal injection (5, 10, 20 mg/kg/day, dissolved in 10% DMSO + 40% PEG400 + 50% saline) to 8-week-old BALB/c mice (male, 20-25 g) immediately after subcutaneous implantation of the Matrigel plug (0.5 mL/mouse) and once daily for 7 days; on day 8, harvest the Matrigel plugs, homogenize in PBS, and measure hemoglobin content using a colorimetric assay to quantify vascularization; calculate the percentage inhibition compared to vehicle-treated plugs [1]

[1]. Vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 antagonists inhibit VEGF- and basicfibroblast growth factor-induced angiogenesis in vivo and in vitro. J Pharmacol Exp Ther. 2001 Dec;299(3):1073-85.

NVP-ACC789 (ACC-789) is a synthetic small molecule ATP-competitive VEGFR2 (KDR) antagonist that has been developed as a potential anti-angiogenic drug for the treatment of solid tumors and angiogenesis-related diseases (e.g., age-related macular degeneration) [1]
NVP-ACC789 (ACC-789)'s anti-angiogenic mechanism involves selectively inhibiting VEGFR2 kinase activity and downstream signal transduction (ERK1/2, Akt), thereby blocking VEGF-induced endothelial cell proliferation, migration and tubular formation—key steps in angiogenesis; at high concentrations, NVP-ACC789 (ACC-789) also shows a weak cross-inhibitory effect on bFGF-induced angiogenesis, which may be due to its indirect regulation of endothelial cell response to bFGF [1]. NVP-ACC789 showed no significant cytotoxicity to HUVECs or other normal cell lines (such as NIH 3T3 fibroblasts) at concentrations up to 10 μM (cell viability >90% as detected by MTT assay), indicating that it has good safety for anti-angiogenic therapy [1].

C21H17N4BR

405.29048

404.064

C, 62.23; H, 4.23; Br, 19.71; N, 13.82

300842-64-2

300842-64-2

6918616

Light yellow to yellow solid powder

1.441g/cm3

607.7ºC at 760 mmHg

321.3ºC

1.707

4.852

53.93

1

4

4

26

442

0

CC1=CC=C(NC2=NN=C(CC3=CC=NC=C3)C4=C2C=CC=C4)C=C1Br

GXWKSXUPEFVUOO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H17BrN4/c1-14-6-7-16(13-19(14)22)24-21-18-5-3-2-4-17(18)20(25-26-21)12-15-8-10-23-11-9-15/h2-11,13H,12H2,1H3,(H,24,26)

N-(3-bromo-4-methylphenyl)-4-(pyridin-4-ylmethyl)phthalazin-1-amine

ZK-202650; ZK 202650; ZK202650; NVP-ACC789; NVP-ACC 789; NVP-ACC-789; ACC-789; ACC 789; ACC789

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~25 mg/mL (~61.7 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。