AI-10-49   中文名称: AI-10-49

CBFβ-SMHHC

AI-10-49 的 IC50 值为 0.26 μM，可阻断 CBFβ-SMMHC 与 RUNX1 Runt 结构域的结合 [1]。 AI-10-49（1 μM；3、6、12 小时）以特定方式减少 CBFβ-SMMHC 与 RUNX1 的结合[1]。

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肝微粒体稳定性的测量表明，AI-10-47降低了代谢不稳定性，因此证明了二价衍生物AI-10-49的合成是合理的（表1）。AI-10-49是强效的（FRET IC50=260nM）（表1）[等温滴定量热法（ITC）测量得出解离常数（KD）=168 nM]（图S6），改善了体内药代动力学特性（t½=380min）（图S5），与母体质子化二价化合物AI-4-83（IC50约为3μM）相比，对ME-1细胞生长的抑制活性增强（IC50=0.6 mM）（图1F）（图1E）。请注意，AI-10-49在正常人骨髓细胞中显示出可忽略的活性（IC50>25μM）（图1G），这表明了一个强大的潜在治疗窗口。在11种人类白血病细胞系中，ME-1细胞是唯一对AI-10-49高度敏感的细胞系（图S7）。
在ME-1细胞中评估了AI-10-49在破坏内源性RUNX1与CBFβ-SMMHC结合方面的特异性。AI-10-49有效地将DRUNX1与CBFβ-SMMHC分离，治疗6小时后分离率为90%，而它对CBFβ-RUNX1的结合只有适度的影响（图2A）。AI-10-49不影响RUNX1、CBFβ和CBFβ-SMMHC的稳定性（图S8A）。在inv（16）AML中，CBFβ-SMMHC抑制了RUNX1调控基因RUNX3、CSF1R和CEBPA的表达。先前的研究表明，在CBFβ-SMMHC存在的情况下，RUNX1与靶基因的结合减少，这表明CBFβSMMHC通过阻断RUNX1与靶标DNA位点的结合来抑制RUNX1靶基因（图2B）。与该模型一致，染色质免疫沉淀（ChIP）检测表明，用AI-10-49处理ME-1细胞6小时，RUNX3、CSF1R和CEBPA启动子处的RUNX1占有率分别增加了8倍、2.2倍和8倍，而在对照位点没有观察到富集（图2C和图S8、B和C）。据此，用AI-10-49处理ME-1细胞6或12小时可增加RUNX3、CSF1R和CEBPA的表达，但对对照基因PIN1没有影响（图2D）。在inv（16）阴性的U937细胞中没有观察到这些效应。这些数据确立了AI-10-49在抑制CBFβ-SMMHC与RUNX1结合方面的选择性，并验证了我们使用二价抑制剂实现这种特异性的方法[1]。
为了测试AI-10-49在人类inv（16）白血病治疗中的潜在效用，我们评估了用单价AI-10-47和二价AI-10-49剂量范围治疗48小时的四种原发inv（6）AML细胞样本的存活率。如图3B所示，用浓度为5和10μM的AI-10-49处理后，inv（16）患者细胞的存活率降低（个体剂量反应实验如图S12所示）。请注意，二价AI-10-49比单价化合物AI-10-47更有效，因此概括了在人类inv（16）细胞系ME-1中观察到的效果。相比之下，正常核型AML样本的存活率不受AI-10-49治疗的影响（图3C）。对另外五组AML样本的分析表明，AI-10-49治疗特异性降低了inv（16）白血病细胞的存活率，但对其分化没有明显影响（图S13）。当我们通过评估化合物暴露后的集落形成单位（CFU）来评估AML细胞形成集落的能力时，AI-10-49的特异性也很明显。与正常核型和t（8；21）AML患者样本相比，AI-10-49选择性降低了inv（16）AML细胞形成CFU的能力（图3D）。这种抑制作用是剂量依赖性的（在5和10μM时分别为40%和60%）（图3E），而用AI-10-47处理的AML细胞、具有正常核型的AML细胞（图3F）或CD34+脐带血细胞（图3G）的CFU没有变化。这些研究表明，AI-10-49选择性抑制inv（16）AML母细胞的存活率和CFU能力，而它对具有正常核型的AML母细胞或重要的是对正常人类造血祖细胞的影响可以忽略不计[1]。

AI-10-49（200 mg/kg；每日）可延缓小鼠白血病的进展[1]。
高达90%的inv AML患者在受体酪氨酸激酶途径的成分中存在协同突变，包括N-RAS和c-Kit。我们最近通过结合条件性NrasLSL-G12D和CbfbMYH11等位基因，开发了一种有效的inv AML小鼠模型。为了在体内测试AI-10-49给药的效果，我们用Cbfb+/MYH11:Ras+/G12D白血病细胞移植小鼠，等待5天植入，然后用载体[二甲亚砜（DMSO）]或200mg/kg体重AI-10-49治疗小鼠10天，并评估其对疾病潜伏期的影响。如图3A所示，载体治疗的小鼠死于白血病的中位潜伏期为33.5天，而AI-10-49治疗的小鼠存活时间明显更长（中位潜伏期=61天；P=0.7×10-6）。因此，用AI-10-49进行短暂治疗可以减少体内白血病的扩大。尽管我们没有评估长期暴露后的毒性，但在服用AI-10-49 7天后，我们没有观察到毒性证据[1]。

FRET检测。[1]
如前所述，Cerulean Runt结构域被表达和纯化。Venus CBFβ-SMMHC是通过将6xHis标签和Venus插入NdeI和NcoI位点之间的pET22b载体中，并在NcoI和BamHI位点之间插入CBFβ-SSMHC（CBFβ/SMMHC构建体包含369个氨基酸，CBFβ为1-166，MYH11为166-369（氨基酸1526-1730））构建的。融合蛋白通过标准镍亲和层析纯化，柱上苯并酶处理以去除残留的DNA污染物。使用前，将蛋白质透析到FRET缓冲液（25mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM KCl，2mM MgCl2）中。蛋白质浓度分别通过天蓝色和金星在433和513 nm处的紫外吸光度测定。Cerulean Runt结构域和Venus CBFβ-SMMHC以1:1混合，在96孔黑色COSTAR板中达到10nM的最终浓度。将化合物的DMSO溶液加入至DMSO的最终浓度为5%（v/v），然后在室温下在黑暗中孵育平板一小时。使用PHERAstar微孔板读数器测量荧光（激发波长为433 nm，发射波长为474和525 nm）。对于IC50测定，绘制525nm和474nm处的荧光强度比与化合物浓度的对数，并使用Origin7.0将所得曲线拟合为S形曲线。进行了三次独立的测量，并使用它们的平均值和偏差进行IC50数据拟合。[1]

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蛋白质核磁共振波谱[1]
所有核磁共振实验均在30°C下在配备低温探头的布鲁克800 MHz仪器上进行。所有NMR样品均在50 mM磷酸钾、0.1 mM EDTA、0.1 mM NaN3、1 mM DTT和5%（v/v）D2O中制备，最终pH值为7.5。15N1 H HSQC实验使用500µM样品，13C1 H HSQC试验在1 mM样品上进行。所有核磁共振数据均使用NMRPipe和Sparky进行处理。加权化学位移变化（百万分之几）通过以下方程式计算：�HN |+（|∆�N|/4.69）。[1]

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等温滴定量热法[1]
将由MYH11（MYH11氨基酸1526-1730）的CBFß残基1-166和166-369组成的369个氨基酸CBFß-SMMHC构建体克隆到具有N端6xHis标签和Tev蛋白酶位点的修饰pET22b载体中，并在30°C下用1mM IPTG诱导的Terrific Broth培养基在Rosetta2（DE3）细胞中表达8小时。CBFß-SMMHC通过Niaffinity色谱纯化，然后进行苯并酶处理和Tev蛋白酶消化过夜。然后将融合蛋白第二次通过Ni-NTA柱，然后进行Q-Sepharose离子交换层析以去除残留的核酸。通过使用Sephacryl S300柱的尺寸排阻色谱实现了额外的纯化。将纯化的CBFß-SMMHC透析到1 L ITC缓冲液（12.5 mM KPi（pH 6.5）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2、1 mg/mL NaN3、1 mM DTT和0.25%DMSO）中4小时。将AI-10-49单独加入10 mL ITC缓冲液中，使终浓度达到2µM。使用DSS作为标准，在布鲁克600 MHz NMR光谱仪上使用1H NMR验证了AI-10-49的浓度。所有ITC测量均在30°C下在微量热系统上进行。CBFß-SMMHC和AI-10-49样品脱气20分钟，并在量热池中向400 nM CBFßSMMHC溶液中注射8µL 2µMAI-10-49。ITC数据中一致观察到双相转变，表明有多个过程导致了观察到的热量。因此，由于观察到的热量相对较小，无法使用热量计上可用的标准软件分析这些数据，该软件使用热值来确定KD。相反，使用Origin 7.5对数据进行分析，并在校正稀释焓以得出表观KD值后，将其拟合到单点S形结合曲线。重复测量三次，并将值报告为平均值±标准偏差。

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： ME-1 细胞
测试浓度： 1 μM
孵育时间： > 3、6 小时
实验结果： RUNX1 与 CBFβ-SMMHC 有效解离。

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RT-PCR[1]
细胞类型： ME-1 和 U937 细胞
测试浓度： 1 μM
孵育持续时间：6、12 小时
实验结果：RUNX3、CSF1R 和 CEBPA 表达增加。

动物/疾病模型：小鼠（Cbfb+/MYH11:Ras+/G12D白血病细胞）[1]
剂量：200 mg/kg
给药途径：每日
实验结果：体内白血病细胞增殖减少，且存活时间显著延长。

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小鼠白血病移植研究[1]
如前所述，在CD45.2 C57BL/6小鼠中生成携带Cbfb+/MYH11和Nras+/G12D致癌等位基因的白血病细胞。简而言之，将2×10³个Cbfb+/MYH11;Nras+/G12D白血病细胞移植到22只经亚致死剂量照射的6至8周龄CD45.1 C57BL/6雌性小鼠体内。在初步试验中，根据既定的实验条件选择每组小鼠的数量，以达到统计效力。移植后第5天，将小鼠随机分为两组，分别腹腔注射50 µL DMSO或溶于DMSO的AI-10-49（200 mg/kg），连续注射10天。为确定白血病潜伏期的中位数，由多人对小鼠进行观察。一旦发现疾病症状，包括活动减少、梳理毛发减少、弓背、爪子苍白（贫血）和体温过低，即对小鼠实施安乐死。安乐死时，提取外周血和脾细胞，并按先前所述方法进行分析。通过测量外周血中白细胞总数和c-kit(+)阳性细胞群的数量来分析白血病负荷。

对 AI-4-57（AI-10-49 的类似物）的药代动力学性质分析表明，该化合物在小鼠血浆中的半衰期较短（t½ = 37 分钟）（图 S5），且甲氧基上的甲基脱除是其主要代谢产物。三氟甲氧基 (CF3O) 取代已被证明反应活性较低 (18, 19)，因此我们合成了带有该取代基的 AI-10-47。FRET 测量结果表明，该取代基实际上增强了单价化合物的活性（表 1）。肝微粒体稳定性测定表明，AI-10-47 降低了代谢风险，因此合成二价衍生物AI-10-49是合理的（表 1）。AI-10-49 具有强效活性（FRET IC50=260nM）（表 1）[等温滴定量热法 (ITC) 测定解离常数 (KD) = 168 nM]（图 S6），体内药代动力学性质得到改善（t½ = 380min）（图 S5），并且与母体质子化二价化合物 AI-4-83（IC50 为 ~3 μM）（图 1E）相比，对 ME-1 细胞生长的抑制活性增强（IC50 = 0.6 mM）（图 1F）。值得注意的是，AI-10-49在正常人骨髓细胞中活性极低（IC50 > 25 μM）（图1G），这表明其具有良好的潜在治疗窗口。在11种人白血病细胞系中，ME-1细胞是唯一对AI-10-49高度敏感的细胞系（图S7）。[1]

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药代动力学研究[1]
研究开始前，小鼠禁食至少3小时，并可自由饮水。动物饲养于12小时光照/12小时黑暗循环、温度72-74°C、相对湿度30-50%的环境中。腹腔注射给药时，将24-28克雄性C57BL/6小鼠进行人工固定，并在胸骨和耻骨之间中点、略偏离小鼠中线的位置进行腹腔注射。每次注射均使用1毫升注射器和27号针头。根据预定时间点采集动物血液。动物用异氟烷麻醉，并通过心脏穿刺采集血液。血液立即转移至1.5毫升肝素化微量离心管中，并在4000转/分钟下离心10分钟。然后将血浆转移至干净的离心管中并冷冻保存。由于放血致死，动物未从麻醉中苏醒，并通过开胸手术确保其在麻醉状态下死亡。该方法符合美国兽医协会（AVMA）关于安乐死的指南中关于使用放血作为安乐死手段的建议。使用PK Solutions 2.0软件对受试化合物的血浆浓度-时间数据进行非房室药代动力学分析。 [1]

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AI-10-49– 采用由岛津SCL-10Avp控制器、SIL-10A自动进样器、LC-10ADvp泵、SPD-10Avp检测器和CTO-10Avp柱温箱组成的液相色谱系统进行高效液相色谱分析。数据采集、峰积分和计算均使用LabSolutions软件完成。采用4.6 mm × 13 mm × 150 mm Atlantis T3 5 μm色谱柱进行分离，流动相为A相和B相，乙腈/水/三氟乙酸的比例分别为5/95/0.1和95/5/0.1，梯度洗脱程序为：4分钟内B相比例从50%升至95%，95% B相保持2分钟，95% B相从0.5分钟降至50%，最后50% B相保持4.5分钟。流速为 1 mL/min，温度为 45°C。进样量为 40 μL，检测波长为 325 nm。定量分析采用空白血浆配制的外部标准品，线性范围为 25 – 750 ng/mL (R² > 0.995)。血浆样品提取步骤如下：取 100 μL 样品，加入 0.5 mL 甲基叔丁基醚 (MtBE)，并加入 10 μL AI-10-49 加标溶液 (10X)，涡旋混匀，室温静置 5 min。将两相混合物涡旋混匀 5 min，然后以 12,000 rpm 离心 5 min。取 450 μL MtBE 层转移至干净的离心管中，蒸干。将所得残渣用 100 µL 50/50/0.1 乙腈/水/三氟乙酸溶液重悬，涡旋振荡后，以 12,000 rpm 离心 5 分钟。取 90 µL 上清液转移至带有聚丙烯插片的自动进样器小瓶中进行分析。

尽管我们尚未评估长期暴露后的毒性，但在连续7天给予AI-10-49后，我们未观察到任何毒性迹象（图S9至S11）。

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毒理学研究[1]
我们评估了AI-10-49每日给药7天后的累积毒性。这些研究不包括最大耐受剂量或长期（>30天）毒性。6周龄C57BL/6雌性小鼠每日腹腔注射DMSO或200mg/kg AI-10-49，持续7天（每组n=3至4）。我们分析了小鼠的外观，以评估毒性迹象，包括梳理毛发、活动能力和体重。末次注射4小时后，我们使用流式细胞术分析外周血细胞，并使用血细胞计数器进行定量。随后，我们对小鼠实施安乐死，以收集组织样本。通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞，包括造血干细胞和多系祖细胞[LSK+= Lin(-), kit(+), Sca1(+)]、髓系祖细胞[CMP=Lin(-)Sca1(-)kit(+)CD34(+)CD16/32(-)]、粒细胞/单核细胞祖细胞[GMP=Lin(-)Sca1(-)kit(+)CD34(+)CD16/32(+)]和巨核细胞/红系祖细胞[MEP=Lin(-)Sca1(-)kit(+)CD34(-)CD16/32(- )]。将骨髓、肝脏、肺、脾脏、肠道和脑制成石蜡切片，并用苏木精和伊红染色，以分析组织结构。

[1]. Chemical biology. A small-molecule inhibitor of the aberrant transcription factor CBFβ-SMMHC delays leukemia in mice. Science. 2015 Feb 13;347(6223):779-84.

急性髓系白血病 (AML) 是成人白血病中最常见的类型。在染色体倒位 inv(16)(p13q22) 的 AML 中表达的转录因子融合体 CBFβ-SMMHC（核心结合因子 β 与平滑肌肌球蛋白重链）会与野生型 CBFβ 竞争结合转录因子 RUNX1，从而扰乱造血过程中 RUNX1 的活性，并诱发 AML。目前，采用非选择性细胞毒性化疗治疗 inv(16) AML 可获得良好的初始疗效，但长期生存率有限。本文报道了一种蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂 AI-10-49 的研发，该抑制剂可选择性地与 CBFβ-SMMHC 结合，并破坏其与 RUNX1 的结合。AI-10-49 可恢复 RUNX1 的转录活性，具有良好的药代动力学特性，并能延缓小鼠白血病的进展。用 AI-10-49 治疗原发性 inv(16) AML 患者的原始细胞可诱导选择性细胞死亡。这些数据表明，直接抑制致癌的 CBFβ-SMMHC 融合蛋白可能是治疗 inv(16) AML 的有效方法，并为其他癌症的转录因子靶向治疗提供了支持。[1]

C30H22F6N6O5

660.5233

660.155

C, 54.55; H, 3.36; F, 17.26; N, 12.72; O, 12.11

1256094-72-0

49806644

Off-white to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

790.3±70.0 °C at 760 mmHg

431.8±35.7 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.611

7

129.29

2

15

12

47

913

0

FC(OC1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])N([H])C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])N=1)OC([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])OC1=C([H])N=C(C([H])=C1[H])C1=NC3C([H])=C([H])C(=C([H])C=3N1[H])OC(F)(F)F)=N2)(F)F

WJBSSBFGPKTMQQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H22F6N6O5/c31-29(32,33)46-17-1-5-21-25(13-17)41-27(39-21)23-7-3-19(15-37-23)44-11-9-43-10-12-45-20-4-8-24(38-16-20)28-40-22-6-2-18(14-26(22)42-28)47-30(34,35)36/h1-8,13-16H,9-12H2,(H,39,41)(H,40,42)

6-(trifluoromethoxy)-2-[5-[2-[2-[6-[6-(trifluoromethoxy)-1H-benzimidazol-2-yl]pyridin-3-yl]oxyethoxy]ethoxy]pyridin-2-yl]-1H-benzimidazole

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.78 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.78 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10% DMSO +90%PEG400: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。