KRAS(G12C)

体外活性：ARS-1620 是一种新型、强效、口服的 KRASG12C 共价抑制剂，对 KRASG12C 具有高效力和选择性。它是通过基于结构的设计确定的，可以实现快速、持续的体内靶点占据，从而诱导肿瘤消退。最近发现 KRASG12C 通过等位基因特异性共价靶向诱导型变构开关 II 口袋 (S-IIP) 附近的 Cys-12 具有潜在的药物作用。这种方法的成功需要 KRASG12C 在其活性 GTP 和非活性 GDP 构象之间主动循环，因为 S-IIP 的可及性仅限于 GDP 结合状态。事实证明，该策略对于体外抑制突变型 KRAS 是可行的；然而，尚不确定这种方法是否会转化为体内。 ARS-1620 实现快速、持续的体内靶点占据，诱导肿瘤消退。这项研究提供了体内证据，证明突变型 KRAS 可以被选择性靶向，并揭示 ARS-1620 代表新一代 KRASG12C 特异性抑制剂，具有良好的治疗潜力。激酶测定：ARS-1620 在 p.G12C 突变癌细胞中以高效力和阻转异构体选择性共价抑制 KRAS (G12C) 活性。 ARS-1620 以浓度和时间依赖性方式快速与 G12C 结合，与其共价抑制机制一致。在一组含有突变等位基因的细胞系中，ARS-1620 在处理 2 小时后，在约 0.3 μM 时表现出半最大 G12C 靶点接合 (TE50)，在 3.0 μM 时表现出接近完全接合。 RS-1620 在 H358 (p.G12C) 中以剂量依赖性和选择性的方式抑制 RAS-GTP 以及 MEK、ERK、RSK、S6 和 AKT 的磷酸化，但在缺乏 p.G12C 的阴性对照肺癌细胞系中则不然。 A549、H460 和 H441）。 ARS-1620 引发亚微摩尔等位基因特异性效力（IC50 = 0.3 μM；IC90 = 1 μM）。 ARS-1620 的活性对 G12C 等位基因具有特异性，并由 Cys-12 的共价修饰介导。细胞测定：将细胞接种到 24 孔 ULA 板中并静置过夜。然后用 DMSO 或 ARS-1620 处理细胞。处理 2 天后，通过使用annexinV-APC 和碘化丙啶染色或通过 70% 乙醇固定，然后进行 FxCycle 紫染色来测量细胞凋亡和细胞死亡，以通过流式细胞术测量 DNA 含量（细胞周期）和亚二倍体事件的百分比

单次口服剂量或连续 5 次每日剂量后，ARS-1620 产生的平均肿瘤峰值浓度分别为 1.5 μM (50 mg/kg) 和 5.5 μM (200 mg/kg)，从而实现显着的 KRASG12C 靶点占有率 (>=70 % G12C-TE (200 mg/kg) 持续 >24 小时。在 MIAPaCa2 异种移植物 (p.G12C) 中，ARS-1620 以剂量依赖性方式显着抑制肿瘤生长 (p<0.001)，每天一次给予 200 mg/kg 剂量时，ARS-1620 显着消退。在所有采用的肿瘤模型中，ARS-1620 在整个 3 周的治疗期内具有良好的耐受性。此外，即使在 7 天的时间内每天口服剂量高达 1,000 mg/kg，也没有在 CD-1 小鼠中观察到 ARS-1620 的临床症状或毒性。

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ARS-1620在PDX肿瘤模型中显示出强效和选择性的抗肿瘤活性[1]
为了进一步证明ARS-1620的治疗效果，我们分析了一组携带KRAS p.G12C（n=4）的患者衍生（PDX）肿瘤异种移植物模型的抗肿瘤反应，并与缺乏突变等位基因（n=3）的PDX模型进行了比较（靶向测序结果另见表S4）。p.G12C PDX小组由三个腺癌NSCLC组成，这是患者KRAS p.G12C突变频率最高的潜在靶点（11%-16%）（Campbell等人，2016，Jordan等人，2017），以及一个胰腺癌，占KRAS突变胰腺癌的一小部分（<2%）（Bailey等人，2016）。 ARS-1620在p.G12C PDX模型中诱导了显著的TGI（p<0.001），并在使用每日200mg/kg方案治疗3周后出现了明显的消退，而非G12C异种移植物则没有任何反应（图7A）。在研究结束时（最后一次给药后6小时），我们使用每日200mg/kg的治疗方案，确认ARS-1620在肿瘤中的G12C靶点占有率平均≥75%（图7B）。此外，在p.G12C PDX模型中，ARS-1620显著抑制了p-ERK和p-S6（p<0.05）（图7C、S6A和S6B）。通过切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的免疫组织化学（IHC）染色监测，这导致了显著的凋亡诱导（p=0.0148）（图7D）。我们接下来评估了以更高剂量或频率给药ARS-1620是否可以提高荷瘤动物的靶点占有率和疗效。200 mg/kg每日两次（b.i.d.）或400 mg/kg每日一次的ARS-1620方案在p.G12C PDX模型中均提高了反应率（图7A），并与更强的p-ERK抑制有关（图S6A-S6C），与细胞系衍生的异种移植物模型中观察到的更大的G12C占用率一致（图S5E-S5H）。在所有采用的肿瘤模型中，ARS-1620在整个3周的治疗期内耐受良好（图S6D和S6E）。此外，即使在7天内每天口服高达1000mg/kg的剂量，CD-1小鼠中也没有观察到ARS-1620的临床症状或毒性（见STAR方法中的动物研究）。高于400mg/kg时，ARS-1620表现出PK饱和，因此在细胞系衍生和PDX衍生的模型中没有进一步增强抗肿瘤疗效（数据未显示）。总之，ARS-1620通常耐受良好，小鼠未达到最大耐受剂量（MTD）。总之，ARS-1620在各种KRASG12C小鼠癌症模型中的体内疗效和突变选择性观察结果支持了未来共价靶向KRAS的S-IIP的治疗策略。

在p.G12C突变癌症细胞中，ARS-1620以共价和高效力选择性抑制KRAS（G12C）活性。根据其共价抑制机制，ARS-1620以浓度和时间依赖的方式快速与G12C结合。与携带突变变体的一组细胞系相比，ARS-1620在处理2小时后，在3.0μM时表现出接近完全的结合，在约0.3μM时显示出一半最大的G12C靶标结合（TE50）。在H358（p.G12C）中，但不在缺乏p.G12C的阴性对照癌症细胞系（A549、H460和H441）中，RS-1620选择性地和剂量依赖性地抑制RAS-GTP和MEK、ERK、RSK、S6和AKT的磷酸化。ARS-1620的效力是亚微摩尔等位基因特异性的（IC50=0.3μM；IC90=1μM）。Cys-12被ARS-1620共价修饰以介导其活性，这是G12C等位基因所独有的。

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蜂窝KRASG12C目标参与度（G12C-TE）[1]
细胞（30-50x103）按所列时间用指定化合物处理，随后用PBS洗涤两次，并如前所述制备蛋白质提取（Patricelli等人，2016）。在碘乙酰胺烷基化和胰蛋白酶消化后，使用Skyline targeted Mass Spec Environment v3.6软件（MacLean等人，2010）在Dionex RSLCnano LC上通过靶向LC/MS-MS分析样品，并结合Q-Exactive四极轨道阱质谱仪，如前所述（Patricelli等人，2016）。动力学G12C目标交战是用KinTek Global Kinetic Explorer建模的（Johnson，2009）。

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肿瘤KRASG12C靶点结合（G12C-TE）[1]
使用Precellys珠匀浆器在IP裂解缓冲液中制备肿瘤的蛋白质提取物。等分约400μg蛋白质，并加入1皮摩尔重同位素标记的KRASG12C 1-169 his标记蛋白质（Lys-13C6,15N2和Arg-13C6,15N4）作为内标。重同位素标记的KRASG12C在大肠杆菌中产生，蛋白质纯度高于90%，同位素纯度超过99%。使用丙酮沉淀蛋白质，并将其重新悬浮在LDS样品/还原缓冲液中，使用10%NuPAGE-Bis-Tris凝胶通过SDS-PAGE进行分离，随后用考马斯亮蓝染色。从每条泳道上切下覆盖15-25kDa的凝胶带，然后在凝胶内胰蛋白酶消化凝胶包埋的蛋白质。如前所述（Patricelli等人，2016），使用Skyline targeted mass Spec Environment v3.6软件（MacLean等人，2010）在Dionex RSLCnano LC上结合Q-Exactive四极轨道阱质谱仪进行靶向LC/MS-MS分析，分析凝胶中释放的肽。简而言之，前体反应监测用于定量内源性和重同位素标记的胰蛋白酶KRASG12C肽LVVVGAC∗GVGK和KRAS-NRAS标准化肽SYGIPFIETSAK。根据内源性和重同位素标记蛋白的峰面积计算肽轻/重（L/H）同位素比值。参与百分比根据以下公式确定： 拼音双语对照

在接种到24孔ULA板中后，将5×10⁴细胞静置过夜。之后，将DMSO或ARS-1620应用于细胞。两个治疗日后，使用流式细胞术来评估细胞凋亡和细胞死亡的量，以测量亚二倍体事件的百分比和DNA含量（细胞周期），或通过膜联蛋白V-APC和碘化前啶染色或70%乙醇固定，然后进行FxCycle Violet染色[1]。

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细胞增殖试验[1]
为了比较抗生长活性，使用了基于CellTiter Glo（CTG）发光的测定法。将细胞（每孔800-1200个）接种（使用相同的培养基）在标准组织培养处理的96孔格式板或超低附着表面96孔格式的板中。在接种后的第二天，用9点3倍稀释的指定化合物系列（每孔100μl最终体积）处理细胞，5天后根据制造商的建议说明监测细胞存活率，其中加入50μl CellTiter Glo试剂，剧烈混合，覆盖并放置在摇床上20分钟，以确保在评估发光信号之前完全溶解细胞。 对于诱导型KRASG12V拯救实验，在有或没有强力霉素（100 ng/ml）、最终培养基体积为90μl的情况下，将细胞作为3D悬浮液（超低粘附板）接种。24小时后，向培养物中加入化合物或DMSO（10μl）的浓度。5天后使用如上所述的CTG测定法监测剩余细胞数。 对于使用无Ras MEFs的实验，细胞以3D悬浮液（超低粘附板）的形式接种。在接种后的第二天，用9点3倍稀释的指定化合物系列（每孔100μl最终体积）处理细胞，5天后通过CTG测定监测细胞存活率。

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细胞周期和凋亡测定[1]
将5x104个细胞接种到24孔ULA板中，并静置过夜。然后用DMSO或指定化合物处理细胞。治疗2天后，通过膜联蛋白V APC和碘化丙啶染色或70%乙醇固定，然后进行FxCycle Violet染色，通过流式细胞术测量DNA含量（细胞周期）和亚二倍体事件的百分比，从而测量凋亡和细胞死亡。在MACSQuant流式细胞仪上采集数据，并用FlowJo软件V.10.1进行分析。

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免疫印迹和RAS-GTP下拉[1]
来自活性Ras检测试剂盒的1X裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.2，150 mM NaCl，5 mM MgCl2，5%甘油，1%NP40）补充了磷酸酶抑制剂和无EDTA蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂鸡尾酒桌），用于细胞裂解。对于评估RAS-GTP的裂解物，我们遵循了制造商推荐的程序。简而言之，用冰冷的PBS冲洗0.5-1x106预先粘附的细胞（24小时前），或者如果在3D球体悬浮液（0.5-1x103）中，细胞（在24小时前接种在超低粘附板中）以300 x g的速度造粒3分钟，并用冰冷的PBS:洗涤。之后，用1ml（或0.5ml）含有80μg/ml GST标记的RAF-RBD的裂解缓冲液在冰上裂解细胞10分钟。刮掉剩余的贴壁细胞，在4°C下以14000 rpm离心裂解物5分钟。随后，在4°C下，在恒定摇动下，将90%的预先清除的裂解物加入预先洗涤的谷胱甘肽琼脂糖珠中1小时。随后将珠粒造粒并洗涤3次，用40-60μl 1X SDS-PAGE样品缓冲液洗脱进行蛋白质印迹。剩余的10%裂解物用于通过Bradford蛋白测定法和蛋白质印迹法测定蛋白质浓度，以确定指示的信号标志物。 对于超过24小时的时间过程实验，对RAS-GTP下拉试验进行了小幅修改，以解释治疗引起的细胞数量和/或凋亡诱导的显著差异。为此，细胞裂解物用半体积裂解缓冲液处理，不添加RBD。保存一小部分裂解物样品用于蛋白质浓度测定，其余裂解物被快速冷冻。确保等量的蛋白质经历RBD下拉；随后将裂解物解冻（在室温下），并用裂解缓冲液（0.5mL体积）调节至1mg/ml。然后将等量的裂解物加入到含有RAF-RBD的0.5mL裂解缓冲液中（总体积1mL）。将裂解物涡旋，在冰上孵育10分钟，随后在4°C下以14000 rpm预清5分钟。其余步骤与上述类似。

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半胱氨酸选择性分析[1]
H358细胞（5x106）用指定的化合物和浓度处理4小时。随后洗涤细胞并收获，如前所述（Patricelli等人，2016），通过LC/MS-MS进行蛋白质组学分析。简而言之，细胞裂解物中暴露于溶剂的半胱氨酸用100μM碘乙酰胺去硫生物素标记。胰蛋白酶消化后，使用高容量链霉抗生物素蛋白琼脂糖富集去硫生物素化肽。使用与Q-Exactive Plus质谱仪耦合的Dionex RSLCnano-LC分析肽样品。Progenesis LC-MS for proteomics v3.0软件用于整个数据集的自动运行比对、峰提取、归一化和峰丰度计算。使用Proteome Discoverer v1.4通过数据库搜索获得去硫生物素化肽的鉴定。将每种肽的标准化峰丰度导出到Excel 2013。计算每个样品组的平均值和%CV，每个样品组包含3个生物重复。计算DMSO对照组和处理样品组之间的Log2倍变化。对每种肽进行双尾t检验，以确定处理组和DMSO对照组之间的统计学意义，假设方差相等。

本研究采用6至8周龄的雄性BALB/c小鼠进行药代动力学(PK)研究。小鼠分别以10 mg/kg的剂量通过灌胃法或单次静脉注射(IV)给予ARS-1620，以评估其口服生物利用度。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术测定血浆中ARS-1620的浓度。利用平均血浆浓度-时间曲线估算药代动力学参数。采用线性梯形法则，根据时间-浓度数据计算曲线下面积(AUC)。口服和静脉注射ARS-1620的AUC比值用于计算其口服生物利用度。相对剂量用于标准化计算[1]。

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\n\n小鼠药代动力学 (PK) 研究[1]
\n药代动力学 (PK) 研究采用 6 至 8 周龄雄性 BALB/c 小鼠。为测定口服生物利用度，分别以 2 mg/kg 和 10 mg/kg 的剂量，通过单次静脉注射 (IV) 或灌胃给予小鼠 ARS-1620。ARS-1620 配制成水溶液，其中包含 1% N-甲基-2-吡咯烷酮、19% 聚乙二醇 400 和 10% 环糊精，然后经过滤除菌后用于静脉注射。口服制剂配制成溶液（100% Labrasol®，Gattefossé）。采用基于液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 的方法定量血浆中的药物浓度。使用 Phoenix WinNonlin 软件，根据平均血浆浓度-时间曲线估算药代动力学参数。采用线性梯形法则，根据时间-浓度数据计算曲线下面积 (AUC)。口服生物利用度计算为口服和静脉注射 ARS-1620 的 AUC 比值，并按相对剂量进行标准化。在所有实验中，ARS-1620 的口服生物利用度均大于 50%。对于肿瘤样本的药代动力学分析，将含有肿瘤样本的小瓶加入 5 倍体积的水，并用珠磨匀浆器进行匀浆。对于校准标准品或质控样品，将 40 μl 空白肿瘤匀浆转移至 96 孔可拆卸试板的每个孔中，并加入 10 μl 用 100% DMSO 配制的 5 倍浓度 ARS-1620 标准储备液。对于PK样品，将40 μl肿瘤匀浆转移至96孔可拆卸管板的每个孔中，并加入10 μl 100% DMSO。所有样品均加入150 μl含内标的100%冰乙腈，涡旋混匀。样品以3400 rpm离心10分钟，取上清液30 μl转移至含有170 μl 0.1%甲酸水溶液的96孔板中。盖上盖子，短暂涡旋混匀，以确保提取的样品充分混合。使用安捷伦科技6430三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）对样品进行分析。
\n\nLC-MS/MS分析采用Phenomenex Gemini-NX色谱柱（C18，3 μm，110 Å，20 mm × 2.0 mm），流动相A为10 mM NH4HCO3水溶液（pH 10，用NH4OH调节），流动相B为100%乙腈。液相色谱梯度洗脱程序为：0分钟时流动相B的比例为10%，持续0.3分钟；2分钟时流动相B的比例增加至90%；2.4分钟至2.5分钟时流动相B的比例从90%降至10%；之后，色谱柱在10%流动相B的条件下平衡至3分钟。采用多反应监测 (MRM) 法，利用 431.1 > 124.1 amu 的离子跃迁监测 ARS-1620 的质谱峰。色谱图信号使用 Agilent MassHunter 工作站软件 B.06.00 进行积分和校准。药代动力学参数通过 Phoenix WinNonlin (版本 6.3) 软件，利用非房室模型分析，从个体肿瘤浓度-时间曲线中导出。结果以均值±标准差表示。未进行进一步的统计分析。\n

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\n\n小鼠毒性评估[1]
\n毒性评估中，将6至8周龄的雄性和雌性CD-1小鼠分别以0、200、600和1000 mg/kg/天的剂量，通过灌胃法给予ARS-1620，溶于100% Labrasol®溶液中，剂量为10 ml/kg（每组n=12只小鼠）。评估了死亡率、临床观察、体重、血液学、临床化学、器官重量和毒代动力学。研究期间未出现与受试物相关的临床观察结果。未观察到体重显著下降。除1000 mg/kg剂量组出现中性粒细胞轻度升高外，未发现其他不良血液学结果。未观察到与受试物相关的临床化学变化。未发现与受试物相关的器官总重量变化。在1000 mg/kg/天的剂量下，出现轻微的胃部肉眼可见的炎症。未观察到其他全身毒性迹象。除胃部刺激外，其他器官的显微镜检查未发现与受试物相关的变化。在1000 mg/kg/天的剂量下，研究结束时，男性和女性的Cmax和AUC0-24hr分别为5000-9000 ng/ml和35000-131000 ng·h/mL。

单次口服或连续5天每日给药后，ARS-1620 的平均肿瘤峰值浓度分别为 1.5 μM (50 mg/kg) 和 5.5 μM (200 mg/kg)，从而能够显著提高 KRASG12C 靶点的占有率（200 mg/kg 时 G12C-TE ≥70%），且持续时间超过 24 小时（图 5B 和 S5A）。在这些暴露剂量下，ARS-1620 可引起 RAS-GTP 的剂量和时间依赖性抑制，且单次给药后，MIA-PaCa2 和 H358 异种移植瘤中 G12C 的共价修饰也与此相关（图 5C、S5B 和 S5C）。靶向覆盖范围也扩展到了连续 3 天每日服用 ARS-1620 (200 mg/kg) 的方案，提供了显著的 G12C 靶点占有率 (75% 至 90% G12C-TE)，以及 RAS-GTP 和下游信号抑制（图 5D）。[1]

[1]. Targeting KRAS Mutant Cancers with a Covalent G12C-Specific Inhibitor. Cell. 2018 Jan 25;172(3):578-589.e17.

ARS-1620 是一种喹唑啉衍生物，其 6 位和 8 位分别带有氯和氟取代基，7 位带有 2-氟-6-羟基苯基，4 位带有 4-(丙-2-烯酰基)哌嗪-1-基。它是一种高效、选择性强且口服生物利用度高的共价 KRAS-G12C 抑制剂，能够高效抑制细胞和动物体内编码蛋白 KRAS（Kirsten 大鼠肉瘤病毒）的基因。它可用作抑制剂、抗病毒剂和抗肿瘤剂。

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最近发现，KRASG12C 可通过等位基因特异性共价靶向位于诱导型变构开关 II 口袋 (S-IIP) 附近的 Cys-12 位点进行药物靶向。该方法的成功依赖于KRASG12C在活性GTP结合态和非活性GDP结合态之间的动态循环，因为S-IIP的可及性仅限于GDP结合态。该策略已被证明在体外可有效抑制突变型KRAS；然而，该方法是否适用于体内尚不确定。本文描述了基于结构的ARS-1620的设计和鉴定，ARS-1620是一种对KRASG12C具有高效性和选择性的共价化合物。ARS-1620可在体内快速且持续地占据靶点，从而诱导肿瘤消退。我们利用ARS-1620解析了致癌KRAS的依赖性，并证明单层细胞培养模型显著低估了体内KRAS的依赖性。本研究提供了体内证据，表明突变型KRAS可以被选择性靶向，并揭示了ARS-1620代表了新一代KRASG12C特异性抑制剂，具有良好的治疗潜力。 [1]

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由于缺乏药理学工具，KRAS突变型癌症在体内的KRAS依赖性强度和广度仍未得到充分研究。基于RNAi的方法已利用KRAS突变型癌细胞系和大规模shRNA筛选，发现KRAS沉默的敏感性存在差异（Hayes et al., 2016; Lamba et al., 2014; McDonald et al., 2017; Singh et al., 2009; Sunaga et al., 2011; Vartanian et al., 2013）。在贴壁单层培养和三维培养条件下，对突变型KRAS持续表达的敏感性差异也得到了证实（Fujita-Sato et al., 2015; Patricelli et al., 2016; Vartanian et al., 2013）。在本报告中，我们研究了KRAS p.G12C癌细胞系中KRAS的依赖性。本研究利用ARS-1620作为药理学工具，系统地展示了致癌基因KRAS依赖性在体外系统和体内非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤模型之间的相关性。我们纳入了G12C突变癌细胞，这些细胞对KRAS耗竭的敏感性各不相同，其敏感性已通过Project DRIVE敏感性网络的荟萃分析得到证实（McDonald等人，2017）。利用该细胞系，我们证实了在体外使用ARS-1620抑制KRAS的敏感性存在差异，这些细胞系的KRAS依赖性评分存在高低之分，并且还证实了KRAS依赖性在单层细胞和3D球状体培养中的培养依赖性效应。现在，我们可以将这些KRAS依赖性关系扩展到体内环境。 ARS-1620作为单一药物在多种细胞系和患者来源的小鼠异种移植模型中均表现出高效性，这一发现凸显了突变型KRAS在驱动体内肿瘤生长和存活中的核心作用。此外，我们的研究结果不仅表明3D球状体培养能更好地预测KRAS突变癌细胞对ARS-1620的体内敏感性，而且还证实了使用贴壁单层细胞培养评估KRAS依赖性的体外研究显著低估了体内KRAS依赖性。这对于解释KRAS作为驱动癌基因的体外合成致死关系具有重要的转化意义。尽管 3D 培养越来越受到重视和利用，以更好地模拟体内环境和对化疗的反应（Selby 等人，2017）以及其他治疗靶点（例如 HER2 和 EGFR）（Ekert 等人，2014，Howes 等人，2014，Pickl 和 Ries，2009，Weigelt 等人，2010），但我们尚未发现任何已批准的肿瘤药物在 2D 和 3D 培养中表现出像 KRAS 抑制那样显著的活性差异。未来针对KRASG12C靶向药物的临床试验中患者的反应率将是对利用3D培养预测临床治疗反应价值的绝佳检验。总的来说，ARS-1620作为单一药物在非小细胞肺癌（NSCLC）模型中广泛有效的体内证据，证明了相当一部分携带p.G12C KRAS突变的患者可能受益于KRASG12C靶向治疗。我们的研究首次提供了体内证据，表明S-IIP靶向疗法可能是一种有前景的KRAS p.G12C突变癌症患者的治疗策略。[1]

C21H17CLF2N4O2

430.8351

430.1

C, 58.54; H, 3.98; Cl, 8.23; F, 8.82; N, 13.00; O, 7.43

1698055-85-4

ARS-1323; 1698024-73-5; ARS-1630; 1698055-86-5

137003167

Off-white to light yellow solid powder

4

69.6Ų

1

7

3

30

636

0

ClC1=C(C2C(=CC=CC=2O)F)C(=C2C(=C1)C(=NC=N2)N1CCN(C(C=C)=O)CC1)F

ZRPZPNYZFSJUPA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H17ClF2N4O2/c1-2-16(30)27-6-8-28(9-7-27)21-12-10-13(22)17(19(24)20(12)25-11-26-21)18-14(23)4-3-5-15(18)29/h2-5,10-11,29H,1,6-9H2

1-[4-[6-chloro-8-fluoro-7-(2-fluoro-6-hydroxyphenyl)quinazolin-4-yl]piperazin-1-yl]prop-2-en-1-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5%DMSO + 40%PEG300 + 5%Tween 80 + 50%ddH2O: 4.3mg/ml (9.98mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。