mGluR2 ( EC50 = 285 nM )
AZD-8529 increases the effects of glutamate at mGluR2 with an EC50 of 195 nM [1].
AZD-8529 does not cause antagonist reactions on mGluRs at 25 μM[1].

---

AZD8529 potentiation of mGluR2 receptor function[1]
We assessed the effect of AZD8529 at the human mGluR2 receptor by measuring the potentiation of [35S]GTPγS binding in the presence of increasing concentrations of exogenously applied agonist (L-glutamate). AZD8529 potentiated the effects of glutamate at mGluR2 with an EC50 of 195±62 nM and an Emax of 110%±11% (Figure 1A). In order to assess the selectivity of AZD8529 against the family of mGluRs, we used fluorescence-based assays. AZD8529 potentiated mGluR2 activity with an EC50 of 285±20 nM and did not produce any positive allosteric modulator responses at 20-25 M on the mGluR1, 3, 4, 5, 6, 7, and 8 subtypes (Table 1). In addition, at 25 μM AZD8529 did not elicit antagonist responses on mGluRs. When AZD8529 (10 μM) was studied in a broad receptor screen (Table 2), we observed >50% inhibition of ligand biding at adenosine A3 receptors (51% inhibition) and the norepinephrine transporter (NET, IC50=4.73 μM).

---

In vitro electrophysiology tests [2]
The mGlu2/3 receptor agonist DCG-IV induced inhibitory effects on fEPSPs in the pyramidal cells in the CA1 region of the hippocampus. The inhibitory effects of DCG-IV on synaptic transmission were potentiated by AZD8418 and AZD8529, with EC50 values of 0.86 and 1.4 μM, respectively (Fig. 2a). AZD8418 produced a greater maximal potentiation (79.9 ± 4.4) than AZD8529 (61.4 ± 4.3, p < 0.05). The mGlu2/3 receptor antagonist LY341495 (1 μM) effectively blocked the inhibition of fEPSPs that was induced by DCG-IV alone (10 nM) or the combination of DCG-IV with either AZD8529 (10 μM) or AZD8418 (10 μM; Fig. 2b).

AZD8529 增强谷氨酸对 mGluR2 的作用，EC50 为 195 nM[1]。 25 μM 的 AZD-8529 不会引起 mGluR 的拮抗剂反应[1]。

---

AZD8529增强mGluR2受体功能[1]
我们通过测量在外源性激动剂（L-谷氨酸）浓度增加的情况下[35S]GTPγS结合的增强，评估了AZD8529对人类mGluR2受体的影响。AZD8529增强了谷氨酸对mGluR2的影响，EC50为195±62 nM，Emax为110%±11%（图1A）。为了评估AZD8529对mGluRs家族的选择性，我们使用了基于荧光的检测方法。AZD8529增强mGluR2活性，EC50为285±20 nM，在20-25 M下对mGluR1、3、4、5、6、7和8亚型没有产生任何正变构调节剂反应（表1）。此外，在25μM时，AZD8529对mGluRs没有引起拮抗剂反应。当在广泛的受体筛选中研究AZD8529（10μM）时（表2），我们观察到配体结合腺苷A3受体（51%抑制）和去甲肾上腺素转运蛋白（NET，IC50=4.73μM）的抑制率>50%。

---

体外电生理试验[2]
mGlu2/3受体激动剂DCG-IV对海马CA1区锥体细胞中的fEPSPs具有抑制作用。AZD8418和AZD8529增强了DCG-IV对突触传递的抑制作用，EC50值分别为0.86和1.4μM（图2a）。AZD8418产生的最大增强作用（79.9±4.4）大于AZD8529（61.4±4.3，mGlu2/3受体拮抗剂LY341495（1μM）有效阻断了DCG-IV单独（10 nM）或DCG-IV与AZD8529（10μM）或AZD8418（10μM）联合诱导的fEPSPs的抑制作用；图2b）。

---

通过[³⁵S]GTPγS放射自显影法测量，AZD8529 在食蟹猴脑切片中增强了激动剂诱导的mGluR2激活。在次优浓度的mGluR2/3激动剂LY379268（1 µM）存在下，AZD8529（3 µM）对信号的增强作用在大脑皮层、海马体和纹状体中均可观察到。这种增强作用可被mGluR2/3拮抗剂LY341495（1 µM）逆转。[1]

AZD8529（0.3 mg/kg，肌肉注射）可减少松鼠猴中尼古丁启动诱导和提示诱导的恢复[1]。 AZD-8529（30 mg/kg；腹腔注射）可降低自由活动大鼠伏隔核中尼古丁诱导的细胞外多巴胺增加[1]。动物模型：Sprague-Dawley大鼠[1] 剂量：10 mg/kg、30 mg/kg 给药方式：腹腔注射；尼古丁注射前 2 小时 结果：减少了自由活动大鼠伏隔核中由尼古丁（0.4 mg/kg，皮下）引起的细胞外多巴胺增加 [1]。

---

在猴子中，AZD8529在不影响食物自我给药的剂量（.3-3mg/kg）下减少了尼古丁的自我给药。AZD8529还减少了尼古丁引发和线索诱导的尼古丁恢复，在药物消失后寻求增强反应。在大鼠中，AZD8529减少了尼古丁诱导的伏隔核多巴胺释放。 结论：这些结果为mGluR2的正变构调节剂在尼古丁强化和复发的非人灵长类模型中的有效性提供了证据。这类药物应考虑用于尼古丁成瘾治疗。

---

AZD8418（0.37、1.12、3.73、7.46和14.92 mg/kg）和AZD8529（1.75、5.83、17.5和58.3 mg/kg）的急性治疗抑制了尼古丁的自我给药，对食物维持反应没有影响。AZD8418的慢性治疗减弱了尼古丁的自我给药，但对这种作用的耐受性迅速发展。慢性AZD8529给药对尼古丁自我给药的抑制作用在整个14天的治疗过程中持续存在。任何一种PAM的慢性治疗都会抑制食物的自我给药。AZD8418（急性）和AZD8529（急性和亚慢性）阻断了线索诱导的尼古丁和食物寻求行为的恢复。结论：这些发现表明，mGlu2受体在自我给药尼古丁的增强特性以及之前与尼古丁给药相关的线索的动机影响（即线索诱导的尼古丁寻求行为的恢复）中起着重要作用。因此，mGlu2-PAM可能是帮助人们戒烟和防止复发的有用药物[2]。

---

在按固定比率10（FR10）程序训练自我给予静脉注射尼古丁（30 µg/kg/注射）的松鼠猴中，预处理给予AZD8529（0.3、1、3和10 mg/kg，肌肉注射，于实验前3小时）在连续三个测试实验中显著降低了尼古丁的自我给药（注射次数和反应速率），且未出现耐受迹象。0.03 mg/kg剂量无效。[1]
在另一组在相同FR10程序条件下训练自我给予食物丸的松鼠猴中，AZD8529 在10和30 mg/kg剂量（肌肉注射，实验前3小时）下降低了食物维持的反应，而3 mg/kg剂量无显著影响。这表明较低剂量（0.3-3 mg/kg）能选择性降低尼古丁的强化作用。[1]
在松鼠猴中，尼古丁强化反应消退后，预处理给予AZD8529（0.3、1和3 mg/kg，肌肉注射，测试前3小时）剂量依赖性地降低了由尼古丁引燃注射（0.1 mg/kg，静脉注射）诱导的尼古丁寻求行为的恢复。单独给予3 mg/kg的AZD8529 不会恢复已消退的药物寻求行为。[1]
在尼古丁强化反应消退后（尼古丁和线索均被移除），预处理给予AZD8529（0.3、1和3 mg/kg，肌肉注射，测试前3小时）降低了由响应偶联的尼古丁相关线索（注射相关和视觉刺激）触发的线索诱导的尼古丁寻求行为的恢复。3 mg/kg剂量对无线索存在时的基线消退反应无影响。[1]
在伏隔核壳区植入微透析探针的自由活动大鼠中，全身注射AZD8529（30 mg/kg，腹腔注射，尼古丁前2小时）降低了尼古丁（0.4 mg/kg，皮下注射）诱导的细胞外多巴胺水平升高。10 mg/kg剂量的AZD8529 无效。单独给予时，AZD8529（10 或 30 mg/kg）对基础多巴胺水平无影响。[1]

功能性mGluR2测定[1]
受体选择性测定[1]
为了确定mGluR家族中AZD8529的选择性，我们使用了基于荧光的检测和表达人mGluR构建体的HEK 293细胞系。所述细胞系表达嵌合融合构建体hmGluR2/hCaR*、hmGluR1/hCaR+、hmGluR3/hCaR+hmGluR4/hCaR*hmGluR5/hCaR>hmGluR6/hCaR=hmGluR7/hCaR*hmGluR8/hCaR*，各自包含人mGluR的细胞外结构域和跨膜结构域，以及如前所述与混杂嵌合蛋白Gqi5融合的人钙受体的细胞内结构域。

---

受体筛查[1]
我们根据已发表的方法，使用放射性配体结合分析（MDS Pharma）评估了10μM下AZD8529的脱靶效应。我们为每种测定都运行了参考标准。我们使用数据分析工具箱（MDL信息系统）的非线性最小二乘回归分析来确定IC50值。

---

[35S]GTPγS结合人mGlu2-CHO膜[1]
我们使用由表达人mGluR2的CHO细胞系制备的膜，并以闪烁邻近试验（SPA）形式进行了试验。我们将表达人mGluR2的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养至约80%融合，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞，并冷冻保存直至膜制备。测定缓冲液含有0.05 M HEPES、0.10 M NaCl、0.01 M MgCl2，pH 7.4，加上100 M二硫苏糖醇和3 M鸟苷二磷酸。我们通过在含有AZD8529或载体的测定缓冲液中加入小麦胚芽凝集素SPA珠（0.75mg/ml）和膜（6g/ml）的混合物来开始测定。孵育15分钟后，我们加入了一种含有[35S]GTPγS和L-谷氨酸盐的溶液（最终浓度为100 pM[35S]GTPγS和0-100 M谷氨酸盐）。在室温下孵育（60分钟）后，我们对测定板进行离心，并在TopCount™闪烁计数器上读取。我们分别测定了在没有谷氨酸和存在100-M谷氨酸的情况下[35S]GTPγS结合的0%和100%水平。我们根据AZD8529的浓度反应曲线估计了AZD8529s对mGluR2激活的调节活性，并用4参数逻辑斯谛方程进行了拟合，以计算表观效力（EC50）和最大效力（Emax）。

---

人mGluR2-CHO细胞膜[³⁵S]GTPγS结合实验： 从表达人mGluR2的CHO细胞制备细胞膜。实验缓冲液含有HEPES、NaCl、MgCl₂、二硫苏糖醇和鸟苷二磷酸。通过加入含有AZD8529 或溶媒的麦胚凝集素SPA珠和细胞膜的混合物启动实验。孵育15分钟后，加入含有[³⁵S]GTPγS和L-谷氨酸的溶液。在室温下孵育60分钟后，离心板并用闪烁计数器测量放射性。通过拟合4参数逻辑方程计算EC₅₀和Emax，从浓度反应曲线评估AZD8529 对mGluR2激活的调节活性。[1]
食蟹猴脑切片[³⁵S]GTPγS放射自显影： 切割并安装食蟹猴纹状体和海马体的脑切片（20 µm）。将切片在实验缓冲液中预孵育，然后在25°C下在以下几种条件之一中孵育2小时：基础缓冲液、含激动剂（LY379268）的缓冲液、含调节剂（AZD8529）的缓冲液、或同时含激动剂和调节剂的缓冲液（含或不含拮抗剂LY341495）。所有条件均含有GDP和[³⁵S]GTPγS。孵育后，洗涤切片，干燥并曝光于胶片。对放射自显影图像进行数字化和分析，以评估区域性[³⁵S]GTPγS结合增强情况。[1]

[35S]食蟹猴脑片GTPγS放射自显影术[1]
我们用戊巴比妥钠（100mg/kg）麻醉猴子，用生理盐水灌注，然后取出大脑并将其冷冻在冷却的异戊烷中。我们在低温恒温器上切下20-μm的纹状体和海马切片，将切片安装在载玻片上，并在80°C下储存直至使用。在实验当天，我们在真空室中将切片加热到室温超过3小时。我们在50 mM Tris-HCl、3 mM MgCl2、0.2 mM EGTA、100 mM NaCl和0.2 mM DTT（Tris测定缓冲液，TAB）中孵育切片；pH 7.4，在25°C下孵育10分钟。然后，我们将载玻片在含有2 mM二磷酸鸟苷（GDP）的TAB中，在25℃下孵育15分钟。我们将载玻片置于以下四种条件之一中，在25°C下放置2小时：基础：TAB+2 mM GDP+0.04 nM[35S]GTPγS；单独使用激动剂：TAB+2 mM GDP+0.04 nM[35S]GTPγS+1μM LY379268；单独使用调节剂：TAB+2 mM GDP+0.04 nM[35S]GTPγS+3μMAZD8529；调节剂+激动剂：TAB+2 mM GDP+0.04 nM[35S]GTPγS+1μM LY379268+3μM AZD8529；调节剂+激动剂+拮抗剂：TAB+2 mM GDP+0.04 nM[35S]GTPγS+1μM LY379268+3μM AZD8529+1μM LY341495。然后，我们在4°C 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）中洗涤切片2次，每次5分钟，在冰冷的H2O中漂洗，并风干载玻片。然后，我们将载玻片暴露在Biomax MR胶片上2天，并使用标准技术进行显影、数字化和分析。

---

切片记录[2]
将切片浸入切片室中，以1-2ml/min的流速浸泡在32°C aCSF中。用铂丝制成的砝码将切片固定到位。用连接到隔离脉冲刺激器（型号2100）的单极钨电极（型号575300，0.5-1mΩ）刺激辐射层中的Schaeffer侧支纤维。用从硼硅酸盐玻璃（型号TW150-4）中拔出并填充2mM NaCl的电极记录CA1层锥体细胞的细胞外群体尖峰。用每30秒一次的10毫秒脉冲刺激切片。建立基线反应（最大值的50-70%），然后记录大约15分钟的控制期。在控制期后，将化合物浴敷40分钟或直至达到稳态响应。

---

受体选择性实验（荧光法）： 使用在表达各种mGluR亚型（hmGluR1-8/hCaR）人嵌合融合蛋白的HEK 293细胞系中进行的荧光检测，确定AZD8529 在mGluR家族内的选择性。在存在或不存在亚型特异性激动剂的情况下处理细胞。测量荧光变化以评估AZD8529 在每个受体上的激动剂、正向变构调节剂或拮抗剂活性。[1]
受体筛选（放射性配体结合）： 使用针对多种受体和转运体（如腺苷能、肾上腺素能、多巴胺能、血清素能等）的放射性配体结合实验组评估AZD8529（10 µM）的脱靶效应。计算特异性放射性配体结合的抑制百分比。对于显示>50%抑制的靶点，使用非线性回归分析确定IC₅₀值。[1]

Sprague-Dawley 大鼠
\\\\n10 mg/kg，30 mg/kg
\\\\n腹腔注射；尼古丁注射前 2 小时

---

\\\\n\\\\n尼古丁自我给药[1]
\\\\n此阶段持续 14 周，包括周一至周五的 1 小时实验。每次实验开始前，我们将猴子放在有机玻璃椅上，并用腰部锁将其固定在坐姿。我们首先训练猴子在固定比率强化程序（FR10，60 秒暂停）下按压杠杆，强化物为静脉注射尼古丁（30 μg/kg/次）。用 1 ml 生理盐水冲洗导管后，我们将其连接到电动注射器。每次实验开始时，白色照明灯关闭，绿色刺激灯开启；按压操作杆10次后，绿色灯熄灭，并亮起持续2秒的琥珀色灯光，同时注射尼古丁（0.2毫升）。在60秒的暂停期内，实验箱处于黑暗状态，按压操作杆不会产生任何预设后果。当连续至少5次实验的反应变异性小于15%时，我们测试了AZD8529预处理（0.03、0.3、1、3和10毫克/千克，肌注，实验前3小时）对尼古丁自我给药的影响，共进行了3次实验；并将这些数据与每次实验前连续3次注射载体预处理的数据进行比较。 3 小时的预处理时间是基于阿斯利康 Tmax 药代动力学研究（数据未显示）。

---

尼古丁渴求的恢复[1]
我们在 9 周内完成了该阶段的研究。首先，我们测试了猴子在药物强化反应消退后，尼古丁启动诱导的渴求恢复情况。然后，我们重新训练它们在 5 天内进行尼古丁自我给药，并在药物强化反应消退后，测试了线索诱导的渴求恢复情况。我们测试了 3 mg/kg 或更低剂量的 AZD8529，因为 3 mg/kg 是能减少尼古丁摄入量但不减少食物摄入量的最高有效剂量。\n

---

\\\\n尼古丁启动诱导的复吸 [1]
\\\\n在猴子接受每日消退训练后，我们进行了尼古丁启动诱导的复吸测试。在消退训练中，按压操作杆会导致生理盐水输注，并伴随之前与尼古丁输注配对的视觉提示，但不会出现尼古丁。我们在每次消退训练前都给予一次非条件性的生理盐水注射，作为尼古丁启动注射的载体对照。经过至少两次消退训练，当反应达到较低且稳定的水平后，我们测定了预先注射AZD8529（0.3、1 或 3 mg/kg，肌注）或其溶剂对尼古丁（0.1 mg/kg，静脉注射）诱导的复吸的影响。我们在测试开始前立即注射尼古丁作为启动剂。测试期间，按压操作杆（FR10）仍然只产生生理盐水注射和离散提示。我们还测试了 3 mg/kg 的 AZD8529 对生理盐水启动的影响，以确定单独使用 AZD8529 是否会影响消退后的尼古丁渴求。\n

---

\\\\n线索诱导的复吸 [1]
\\\\n完成尼古丁启动测试后，我们对猴子进行了约 10 次的尼古丁自我给药训练。然后，我们进行了 3 次消退训练，期间按压杠杆没有强化后果（既没有尼古丁也没有线索）；此外，在这些训练之前，我们没有给猴子注射生理盐水启动。消退训练结束后，我们确定了预先注射 AZD8529（0.3、1 或 3 mg/kg，肌注）或其溶剂对线索诱导的复吸的影响。在测试过程中，按压杠杆（FR10）会触发静脉输注生理盐水和呈现视觉提示。我们还测定了3 mg/kg AZD8529对无提示条件下消退反应的影响。每次提示诱导的恢复测试后，都会进行一到两次消退训练。\\\\n

---

\\\\n食物自我给药[1]
\\\\n我们在另一组猴子中测定了AZD8529的影响。这些猴子在与尼古丁相同的强化程序条件下（FR 10，TO 60 s）自我给药190 mg的食物颗粒。我们限制了食物摄入量，以维持猴子的体重在有利于食物强化反应的水平（不超过自由摄食体重的10%）。该组每次实验中给予的强化物数量以及反应率与尼古丁组非常相似（图 2）。我们连续三次实验分别注射不同剂量的 AZD8529（3、10 和 30 mg/kg，肌注），每次注射前均进行三次载体注射。\\\\n

---

\\\\nAZD8529在松鼠猴体内的血浆浓度[1]
\\\\n为了确定行为实验期间的血浆浓度是否达到人类可耐受的水平（根据阿斯利康公司提供的信息），我们给 3 只松鼠猴注射了 AZD8529（1 mg/kg，肌注），3 小时后，在轻度氯胺酮（10 mg/kg，肌注）麻醉下，从股静脉采集静脉血样本（约 1.5 ml）。我们迅速混合血样，并立即置于冰上冷却，直至离心。采血后30分钟内，在4°C下以1500 xg离心10分钟制备血浆。分离血浆后，将其转移至两个2毫升微量离心管中。我们将血浆样本储存于-80°C。我们将样本用干冰运送至阿斯利康公司，该公司采用标准化的LC/MS/MS方法测定AZD8529的浓度。\\\\n

---

\\\\n大鼠体内微透析[1]
\\\\n一般操作流程已在之前描述过(36)。我们在Sprague-Dawley大鼠体内进行微透析，于探针植入伏隔核壳部（距前囟前2.0毫米，侧方1.1毫米，硬脑膜下8.0毫米）后20-24小时进行(37)。我们每隔20分钟采集一次样品（20 μl）（灌注速率：1 μl/min），并立即采用高效液相色谱-电化学检测法分析多巴胺水平。在连续3个样品中观察到多巴胺水平稳定（变化<15%）后，我们注射测试药物或其溶剂。在注射溶剂或尼古丁（0.4 mg/kg，皮下注射）前2小时，我们注射溶剂或AZD8529（10或30 mg/kg，腹腔注射）。尼古丁注射后，我们收集透析液样品2小时。我们根据阿斯利康之前在鼠行为模型中未发表的研究以及最近一项关于该药物对大鼠甲基苯丙胺渴求“潜伏期”影响的研究来确定 AZD8529 的剂量。\\\\n[1]
\\\\nAZD8529 游离碱溶于无菌水中。[1]\\\\n

---

\\\\n\\\\n实验设计[2]
\\\\n实验 1：急性 AZD8418 和 AZD8529 治疗对尼古丁和食物自我给药的影响[2]
\\\\n在建立稳定的尼古丁或食物自我给药（连续三天反应变异性 <20%）后，研究了急性 AZD8418（0、0.37、1.12、采用受试者内拉丁方设计，评估了 AZD8418（3.73、7.46 和 14.92 mg/kg）和 AZD8529（0、1.75、5.83、17.5 和 58.3 mg/kg）治疗对尼古丁和食物自我给药的影响。使用四组未经处理的大鼠，分别考察了急性治疗对以下两组大鼠的影响：(i) AZD8418 对尼古丁自我给药（n = 12）和食物自我给药（n = 10）的影响；(ii) AZD8529 对尼古丁自我给药（n = 12）和食物自我给药（n = 7）的影响。两次给药之间至少间隔 5 天。\\\\n

---

\\\\n\\\\n实验 2：长期 AZD8418 和 AZD8529 治疗对尼古丁和食物自我给药的影响 [2]
\\\\n采用组间设计评估了 14 天重复 AZD8418 和 AZD8529 治疗方案对尼古丁和食物自我给药的影响。使用四组未经处理的大鼠来检验以下慢性治疗对大鼠的影响：（i）AZD8418（0、3.73、7.46 和 14.92 mg/kg/天）对尼古丁自我给药的影响（每组 n = 10–11）；（ii）AZD8418（0 和 14.92 mg/kg/天）对食物自我给药的影响（每组 n = 10–11）；（iii）AZD8529（0 和 58.3 mg/kg/天）对尼古丁自我给药的影响（每组 n = 10–12）；以及（iv）AZD8529（0 和 58.3 mg/kg/天）对食物自我给药的影响（每组 n = 8–13）。在开始慢性治疗前，每个受试化合物的亚组均已根据体重和尼古丁/食物摄入量进行平衡。\n

---

\n\n\n实验 3：急性 AZD8418 和 AZD8529 治疗对线索诱导的尼古丁和食物渴求行为恢复的影响[2]
\n完成实验 1 后，对尼古丁自我给药的大鼠进行消退条件下的测试。所有大鼠在第 10 次消退训练结束时均达到了预定的消退标准（见上文）。在给予载体后进行第一次恢复训练，以确保每个受试者在开始药物治疗前均表现出如上所述的显著恢复（与最后三次消退训练的平均值相比，反应增加 >50%）。只有在首次复吸实验中表现出强烈尼古丁渴求行为的大鼠才被纳入后续实验。每次复吸实验前均进行三天的消退实验，以再次消除大鼠的尼古丁渴求行为。在每次恢复实验前，分别给予AZD8418（0、1.12、3.73、7.46和14.92 mg/kg）和AZD8529（0、1.75、5.83、17.5和58.3 mg/kg），采用组内拉丁方设计。使用训练有素的独立未接受过食物自我给药训练的大鼠（每组n = 9-13），采用组间设计评估AZD8418（0、3.73、7.46和14.92 mg/kg）和AZD8529（0、1.75、5.83、17.5和58.3 mg/kg）对线索诱导的食物寻求行为恢复的影响，因为食物寻求行为在重复刺激后会迅速消退。恢复性测试（Bespalov 等，2005）。治疗前各组的体重和食物反应均保持平衡。\\\\n

---

\\\\n\\\\n药代动力学研究[2]
\\\\n将AZD8529（4.7 mg/kg）和AZD8418（5 mg/kg）通过灌胃法给予雄性Wistar大鼠（n = 3–4），单次给药或连续7天每日给药。在给药后第1天或第7天，分别于给药后0.5、1、3、6、12和24小时采集所有大鼠的尾静脉血样（0.25 ml）。采血后30分钟内，将血浆在4℃下以1500×g离心10分钟制备，并采用标准反相液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC/MS/MS）分析AZD8529或AZD8418的浓度。

---

\\n松鼠猴尼古丁自我给药：雄性松鼠猴植入静脉导管，接受训练，使其在FR10强化程序下（每次注射30 µg/kg，间隔60秒）进行尼古丁自我给药。每次训练持续1小时。在达到稳定的基线反应后，测试AZD8529（0.03-10 mg/kg）或其溶剂（无菌水）的效果。AZD8529在训练开始前3小时进行肌内注射。每个剂量均进行连续三次测试，测试前后均设置三个载体对照。[1]
\\n松鼠猴食物自我给药：另一组猴子接受训练，在相同的FR10强化程序下自我给药190毫克食物颗粒。在测试前3小时，分别给予AZD8529（3、10、30毫克/千克，肌注）或载体，每个剂量进行三次测试，测试前后均设置载体对照。限制食物摄入量以维持猴子的动机。[1]
\\n松鼠猴复吸模型（尼古丁启动和线索诱导）：首先训练猴子自我给药尼古丁。对于尼古丁启动诱导的复吸，在消退阶段用生理盐水代替尼古丁（按压杠杆产生生理盐水和线索）。在反应达到较低稳定水平后，进行复吸测试。在测试前3小时，分别给予猴子AZD8529（0.3、1、3 mg/kg，肌注）或载体，并在测试前立即给予尼古丁（0.1 mg/kg，静脉注射）或载体作为非条件性启动注射。测试期间，按压操作杆会产生生理盐水和提示信息。[1]
\\n为了研究提示诱导的复吸，在对猴子进行尼古丁自我给药再训练后，猴子会经历消退训练，在此期间，按压操作杆不会产生任何后果（没有尼古丁，也没有提示信息）。消退训练结束后，进行复吸测试，在测试前3小时给予猴子AZD8529或载体，在此期间，按压操作杆（FR10）会产生与尼古丁相关的提示信息（注射相关和视觉提示），并伴有生理盐水输注。 [1]
\\n大鼠体内微透析：将微透析探针植入雄性Sprague-Dawley大鼠的伏隔核壳部。术后约20-24小时，每20分钟收集一次透析液样本。在获得稳定的基线多巴胺水平后，向大鼠腹腔注射AZD8529（10或30 mg/kg）或溶剂。两小时后，向大鼠皮下注射尼古丁（0.4 mg/kg）或溶剂。尼古丁注射后继续收集透析液2小时。采用高效液相色谱-电化学检测法分析多巴胺水平。[1]

AZD8529 的药代动力学特征 [2] AZD8418 单次给药 5 mg/kg 后，血浆峰浓度 (Tmax) 在给药后 1 小时达到。AZD8529 单次给药 4.7 mg/kg 后，血浆峰浓度在给药后 3 小时达到。AZD8418 的血浆峰浓度 (Cmax) (690 ± 108 nM) 显著高于 AZD8529 (158 ± 30 nM)。同样，AZD8418 的曲线下面积 (AUC) 也高于 AZD8529，表明 AZD8418 的生物利用度高于 AZD8529。连续 7 天每日重复给药 AZD8418 或 AZD8529 并未改变血浆暴露的 Tmax 或 Cmax。根据药代动力学研究结果，确定了AZD8418（0、0.37、1.12、3.73、7.46和14.92 mg/kg；预处理1小时）和AZD8529（0、1.75、5.83、17.5和58.3 mg/kg；预处理3小时）的给药剂量和预处理时间，以反映Cmax和Tmax的差异。

---

AZD8529的血浆浓度[2]
在一组松鼠猴（n=3）中，药物（1 mg/kg）注射后3小时（自我给药和恢复实验中的预处理时间），AZD8529的血浆浓度为112±17 nM。我们研究了全身注射 AZD8529 对尼古丁诱导的大鼠伏隔核壳部多巴胺释放的影响。结果显示，尼古丁（0.4 mg/kg，皮下注射）可增加细胞外多巴胺水平，而 30 mg/kg 的 AZD8529 可降低这种作用，但 10 mg/kg 的 AZD8529 则无此作用（补充图 S1；AZD8529 剂量与时间的交互作用：F(34,170)=2.24；p<0.001）。单独使用 AZD8529（10 或 30 mg/kg）对多巴胺水平无影响（补充图 S1）。在松鼠猴中，肌注 1 mg/kg AZD8529 3 小时后，血浆浓度为 112 ± 17 nM。该时间点与行为学实验中使用的预处理时间一致。[1] 该论文指出，3 小时的预处理时间是基于阿斯利康公司进行的药代动力学（Tmax）研究（数据未显示）。[1] 该论文还指出，在人体研究中，AZD8529 在猴子接受有效剂量后达到的血浆浓度下，具有良好的耐受性。[1]

主要安全性评估基于行为选择性。显著降低尼古丁自我给药和复吸的AZD8529剂量（0.3-3 mg/kg）不影响食物维持的操作性反应，表明对尼古丁相关行为的影响并非由一般运动障碍、镇静或其他非特异性破坏性作用引起。[1]

[1]. The Novel Metabotropic Glutamate Receptor 2 Positive Allosteric Modulator, AZD8529, Decreases Nicotine Self-Administration and Relapse in Squirrel Monkeys. Biol Psychiatry. 2015 Oct 1;78(7):452-62.

[2]. Attenuation of nicotine-taking and nicotine-seeking behavior by the mGlu2 receptor positive allosteric modulators AZD8418 and AZD8529 in rats. Psychopharmacology (Berl). 2016 May;233(10):1801-14.

AZD8529 正在临床试验 NCT00921804（评估 AZD8529 在成年精神分裂症患者中的疗效、安全性和耐受性的研究）中进行研究。

---

背景：基于啮齿动物研究，II 型代谢型谷氨酸受体（mGluR2 和 mGluR3）被认为是成瘾治疗的靶点。然而，LY379268 和其他 II 型激动剂无法区分主要位于突触前抑制的 mGluR2（拟议的治疗靶点）和 mGluR3。这些激动剂在重复给药后会产生耐受性，因此不再被考虑用于成瘾治疗。在此，我们研究了 AZD8529（一种选择性 mGluR2 正向变构调节剂）对松鼠猴和大鼠尼古丁滥用相关效应的影响。方法：我们首先利用表达人mGluR2的细胞系制备的膜以及灵长类动物脑片，通过体外功能性检测评估了AZD8529对mGluR2功能的调节作用。然后，我们测定了AZD8529（0.03-10 mg/kg，肌注）对静脉注射尼古丁自我给药以及尼古丁启动或尼古丁相关线索诱导的尼古丁渴求复发的影响。此外，我们还测定了AZD8529对猴子食物自我给药以及大鼠伏隔核壳部尼古丁诱导的多巴胺释放的影响。[1] 研究背景：许多药物研发策略旨在通过阻断谷氨酸能传递来减少尼古丁摄入量并预防吸烟复发。激活突触前抑制性代谢型谷氨酸受体 (mGlu)2/3 可减少谷氨酸释放，从而抑制尼古丁的强化作用，并阻断大鼠因线索诱导而出现的尼古丁渴求行为的复发。然而，mGlu2 受体在尼古丁依赖中的相对作用尚不清楚。目的：本研究使用新型的、相对选择性的 mGlu2 正向变构调节剂 (PAM) AZD8418 和 AZD8529，评估 mGlu2 受体在尼古丁摄入和渴求行为中的作用。结果：急性给予AZD8418（0.37、1.12、3.73、7.46和14.92 mg/kg）和AZD8529（1.75、5.83、17.5和58.3 mg/kg）可降低尼古丁自我给药行为，但对食物维持的反应无影响。长期给予AZD8418可减弱尼古丁自我给药行为，但很快产生耐受性。长期给予AZD8529对尼古丁自我给药行为的抑制作用持续了14天。长期给予两种正向变构调节剂（PAMs）均可抑制食物自我给药行为。急性给予AZD8418和急性及亚慢性给予AZD8529均可阻断线索诱导的尼古丁和食物渴求行为的恢复。结论：这些发现表明，mGlu2受体在自我给药尼古丁的强化作用以及先前与尼古丁给药相关的线索的动机影响（即线索诱导的尼古丁渴求行为的恢复）中发挥着重要作用。因此，mGlu2正向变构调节剂（PAM）可能有助于人们戒烟并预防复吸。[2]

---

AZD8529是一种选择性代谢型谷氨酸受体2（mGluR2）正向变构调节剂（PAM）。与激活mGluR2和mGluR3的正位激动剂（例如LY379268）不同，AZD8529仅在内源性激动剂（谷氨酸）存在的情况下选择性地增强受体功能。 [1]
该研究提出，mGluR2正向变构调节剂（PAMs），例如AZD8529，代表了一种治疗尼古丁成瘾的新型疗法，由于其能够降低尼古丁强化作用以及由药物再次接触和药物相关线索引发的复吸，因此与现有药物相比具有潜在优势。[1]
在非人灵长类动物模型中，AZD8529能够有效降低尼古丁渴求行为，这支持了将其用于戒烟和预防复吸的临床开发。[1]

C24H24F3N5O3

487.474275588989

487.183

C, 59.13; H, 4.96; F, 11.69; N, 14.37; O, 9.85

1092453-15-0

AZD-8529 mesylate; 1314217-69-0

25125217

Off-white to light yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

650.9±65.0 °C at 760 mmHg

347.4±34.3 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.585

3.17

83.7

1

10

6

35

730

0

FC(OC1C=CC(=CC=1)CN1C(C2C(C)=CC(C3=NC(CN4CCNCC4)=NO3)=CC=2C1)=O)(F)F

IPCYZQQFECEHLI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H24F3N5O3/c1-15-10-17(22-29-20(30-35-22)14-31-8-6-28-7-9-31)11-18-13-32(23(33)21(15)18)12-16-2-4-19(5-3-16)34-24(25,26)27/h2-5,10-11,28H,6-9,12-14H2,1H3

7-methyl-5-[3-(piperazin-1-ylmethyl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-2-[[4-(trifluoromethoxy)phenyl]methyl]-3H-isoindol-1-one

AZD8529; AZD-8529; AZD-8529; 1092453-15-0; AZD-8529 free base; AZD8529; 7-methyl-5-[3-(piperazin-1-ylmethyl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-2-[[4-(trifluoromethoxy)phenyl]methyl]-3H-isoindol-1-one; CHEMBL3937907; UNII-6H81G454I7; 1092453-15-0 (free base); AZD 8529

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~128.2 mg/mL (~71.4 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 6.25 mg/mL (12.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 62.5mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50μL Tween-80+，混匀；然后加入450μL生理盐水定容至1mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。