Neuropeptide Y (NPY) Y1 receptor
BIBO-3304 TFA: Y1 receptor (neuropeptide Y receptor subtype Y1)【2†L46】
IC50 values:
- Human Y1 receptor (SK-N-MC cells): 0.38 ± 0.06 nM【2†L66-L67】
- Human Y1 receptor (BHK cells): 0.69 ± 0.16 nM【2†L62-L63】
- Rat Y1 receptor (HEK 293 cells): 0.72 ± 0.42 nM【2†L67】
- Rat Y1 receptor (high affinity site in hypothalamus): 1.4 ± 0.9 nM (32 ± 6% of total receptors)【2†L77-L78】
Low affinity (IC50 >1000 nM) for human Y2, human/rat Y4, and human/rat Y5 receptors【2†L48-L49】【2†L70-L76】.

1. 合成了一种新型Y1选择性精氨酰胺衍生物BIBO 3304（(R)-N-[[4-(氨基羰基氨基甲基)-苯基]甲基]-N2-(二苯乙酰基)-精氨酰胺三氟乙酸酯），并对其亚型选择性、体外拮抗活性和食物摄入抑制活性进行了研究。2. BIBO 3304对人和大鼠Y1受体均表现出亚纳摩尔级的亲和力（IC50值分别为0.38±0.06 nM和0.72±0.42 nM）。BIBO 3304的非活性对映体（BIBO 3457）对人和大鼠Y1受体亚型的亲和力均较低（IC50>1000 nM）。 BIBO 3304 对人 Y2 受体、人及大鼠 Y4 受体以及人及大鼠 Y5 受体的亲和力均较低（IC50 值 > 1000 nM）。[1]

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为了检测 Y1 受体信号在人胰岛中的生理相关性，我们培养了人胰岛，并在有或无 Y1 受体拮抗剂 BIBO3304 的情况下用葡萄糖刺激。与啮齿动物胰岛类似，经 BIBO3304 处理的人胰岛在葡萄糖刺激下表现出胰岛素分泌增强。[2]
如图 4f 所示，与单独使用葡萄糖相比，在 100 nM 艾塞那肽和 20 mM 葡萄糖存在的情况下，cAMP 水平显著上调。添加 50 nM PYY 可显著降低艾塞那肽诱导的 cAMP 增加，而这种抑制作用在 Y1 受体特异性拮抗剂 BIBO3304 存在的情况下被消除 [2]。

双侧室旁核注射 BIBO3304 TFA (30 μg) 可降低禁食后过度摄食 [1]。BIBO3304 TFA (15-60 μg) 呈剂量依赖性地抑制 1 μg NPY 介导的摄食反应 [1]。口服 BIBO3304 TFA (0.5 μM) 可显著升高血液胰岛素水平 [2]。

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3. 向室旁核注射 30 μg BIBO 3304 可抑制 1 μg NPY 诱导的摄食反应以及 24 小时禁食诱导的过度摄食，提示 Y1 受体在 NPY 介导的摄食中发挥作用。其非活性对映体无此作用。4. BIBO 3304 既不抑制加兰素也不抑制去甲肾上腺素诱导的食欲刺激反应。但它阻断了由[Leu31, Pro24]NPY和NPY(336)诱发的摄食行为，表明不同NPY受体亚型在摄食行为中存在相互作用。5. 本研究揭示，BIBO 3304是一种亚型选择性非肽类拮抗剂，对Y1受体亚型具有亚纳摩尔级的亲和力，可显著抑制NPY或禁食诱导的食物摄入[1]。

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接受BIBO3304治疗的小鼠血清胰岛素水平显著升高（图1l，m），证实阻断Y1受体信号传导能够增强生理性胰岛素分泌。为了进一步检验这种药物干预是否能改善胰岛移植的预后，我们使用最少数量的野生型胰岛重复了移植实验，然后将一半小鼠口服BIBO3304，另一半小鼠口服安慰剂。为了控制胰岛质量，我们向一组小鼠移植了最佳数量的胰岛。接受安慰剂治疗的受体小鼠未能达到血糖正常，并在整个实验过程中持续存在糖尿病（图2a，b）。相反，移植了最少量野生型胰岛并接受BIBO3304治疗的小鼠迅速达到血糖正常（图2a）。值得注意的是，当在移植后第10天停止拮抗剂治疗时，这些小鼠能够维持血糖正常直至实验结束（第60天）（图2a）。这表明，在胰岛移植后的早期阶段短暂抑制Y1受体信号传导足以使葡萄糖稳态恢复正常。与血糖控制的改善相一致，与安慰剂组相比，BIBO3304治疗组在移植后第5天的葡萄糖耐量也显著改善（图2c，d）。与安慰剂组相比，BIBO3304 治疗组小鼠的 DIo 值始终显著升高，高出 12.28 倍（安慰剂组 DIo = 0.066 ± 0.0082，BIBO3304 组 DIo = 0.819 ± 0.324；每组 n = 4 只小鼠）。对 BIBO3304 治疗组和未治疗组胰岛移植物的分析显示，胰岛形态、细胞凋亡、移植血管化或内质网 (ER) 应激反应均无明显差异（补充图 3、4a），但 BIBO3304 治疗组移植物中 Ki67 阳性 β 细胞的数量显著增加（图 2e、f）。这些数据共同表明，BIBO3304 处理小鼠血糖控制的改善是由于生理性葡萄糖水平变化引起的胰岛素分泌增加和胰岛增殖能力增强（图 2e–h）[2]。
BIBO-3304 TFA：体内实验：BIBO-3304 TFA（30 μg，单侧 PVN 注射）可抑制大鼠 1 μg NPY 诱导的摄食反应约 50%（食物摄入量：1.87 ± 0.3 g vs. 单独 NPY 组 3.58 ± 0.33 g，n=18）【2†L151-L155】。非活性对映体 BIBO 3457 无此作用【2†L155-L157】。 BIBO-3304 TFA (30 μg) 不抑制去甲肾上腺素 (30 μg) 或加兰素 (4 μg) 诱导的摄食【2†L157-L162】。BIBO-3304 TFA 阻断了 NPY (2-36) (1 μg)、NPY (3-36) (1 μg) 和 [Leu31, Pro34]NPY (2 μg) 诱导的摄食【2†L163-L168】。双侧室旁核 (PVN) 注射 15 μg BIBO-3304 TFA（每侧，共 30 μg）可减轻禁食 24 小时大鼠的过度摄食，尤其是在再摄食后的前 2 小时内【2†L170-L172】。在C57BL/6小鼠中，于葡萄糖负荷前2小时口服0.5 μM BIBO-3304 TFA可显著提高血清胰岛素水平。在移植了少量（60个）野生型胰岛的阿洛沙诱导糖尿病小鼠中，每日口服0.5 μM BIBO-3304 TFA，持续9天，可迅速达到血糖正常化，且即使在停止治疗后（长达60天和超过260天）仍能维持血糖正常。该治疗还显著改善了葡萄糖耐量并提高了胰岛素处置指数。在人胰岛移植受体（NOD RAG1-/-小鼠）中，口服BIBO-3304 TFA（0.5 μM）可加速血糖恢复正常，改善葡萄糖耐量并提高循环人胰岛素水平。在完全MHC错配的同种异体胰岛移植模型中，BIBO-3304 TFA恢复了少量胰岛的代谢功能。在NOD小鼠中，从6周龄开始每日给予0.5 μM BIBO-3304 TFA治疗，可使高血糖的发生延迟2-4周。在确诊高血糖（>12 mM）后，将剂量增加10倍（至5 μM）可逆转这一趋势，并进一步延迟糖尿病的发生。BIBO-3304 TFA治疗还显著改善了15周龄和19周龄NOD小鼠的葡萄糖耐量。[1][2]

BIBO-3304 TFA：使用表达不同 NPY 受体亚型的各种细胞系或大鼠下丘脑的膜匀浆进行受体结合实验【2†L54-L87】。对于大鼠下丘脑，将组织在蔗糖缓冲液中匀浆并离心，所得沉淀物重悬于 Krebs-Ringer 缓冲液中【2†L54-L57】。将膜制备物与 30 pM [125I]NPY 和递增浓度的 BIBO-3304 TFA (10⁻¹³ - 10⁻⁴ M) 在 37°C 下孵育 45 分钟【2†L57-L59】。在 100 nM NPY 存在下测定非特异性结合【2†L60】。对于基于细胞的检测，使用了SK-N-MC（人神经母细胞瘤，内源性Y1）、SMS-KAN（人神经母细胞瘤，Y2）、BHK细胞（稳定表达人Y1、Y2或大鼠Y4）、HEK 293细胞（稳定表达大鼠Y1或人Y5）以及CHO细胞（瞬时转染人Y4或大鼠Y5）【2†L62-L87】。将细胞与30 pM [125I]NPY和不同浓度的BIBO-3304 TFA在室温下孵育2-3小时【2†L62-L87】。离心和洗涤后测量结合的放射性【2†L59-L60】。在SK-N-MC细胞中评估了BIBO-3304 TFA拮抗NPY介导的cAMP合成抑制的能力【2†L91-L99】。细胞预先用罂粟碱和拮抗剂孵育，然后用NPY和福斯克林刺激【2†L94-L96】。孵育后，使用商业试剂盒测定cAMP水平【2†L97-L99】。在有无拮抗剂的情况下，根据NPY剂量反应曲线的剂量比确定pKb值【2†L106-L107】。为了测定胰岛中的cAMP，将胰岛在IBMX存在下与葡萄糖、艾塞那肽（GLP-1受体激动剂）和/或PYY一起培养。使用ELISA试剂盒测定细胞内cAMP，并以总蛋白含量进行标准化。 [1][2]

人Y1受体在幼仓鼠肾（BHK）细胞中稳定表达[1]
细胞培养于含4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1 mg/mL G-418和1 mg/mL潮霉素B的DMEM培养基中。在受体结合实验前96小时，加入1 mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达（Stratagene公司的Lac Switch表达系统）。用0.06% EDTA/PBS（孵育1分钟）去除汇合的细胞，并重悬于15 mL孵育缓冲液（MEM/25 mM HEPES+1%牛血清白蛋白、50 mM PMSF、0.1%杆菌肽、3.75 mM CaCl2）中。室温下以 150 g 离心 10 分钟后，将沉淀物重悬于 50 ml 孵育缓冲液中，再次离心后重悬于 30 ml 孵育缓冲液中。计数后，将细胞稀释至最终浓度为 2.5 × 10⁵ 个细胞/ml。取 200 μL 该细胞悬液，加入 30 pM [¹²⁵I]NPY 和递增浓度的测试化合物（10⁷¹³ ± 10⁷⁴ M），在 250 ml 总体积中于室温下孵育 3 小时。孵育结束后，于 48℃ 下以 3000 g 离心 10 分钟终止反应。将沉淀物用 0.25 ml PBS 重悬，再次离心，并在 g 计数器中测量沉淀物的重力。

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表达大鼠 Y1 受体的人胚肾 (HEK) 293 细胞 [1]
用 0.02% EDTA/PBS 去除汇合细胞，并重悬于 10 ml 培养液（MEM/25 mM HEPES+0.5% BSA，50 mM PMSF，0.1% 杆菌肽，3.75 mM CaCl2）中。离心 5 分钟（150 g）后，将沉淀物重悬于等体积的培养液中，并在 10 ml 培养液中再次离心。将细胞稀释至 100 万个细胞/ml 的浓度。将 100 ml 细胞悬液与 30 pM [125I]NPY 溶液和递增浓度的测试化合物在室温下孵育 3 小时，总体积为 250 ml。孵育终止方法与大鼠下丘脑实验相同。

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稳定转染 HEK 293 细胞中的人 Y5 受体[1]
离心后的细胞培养方法与 BHK/Y1 细胞相同，但使用浓度为 0.7 mg/ml 的 G-418，不添加潮霉素，也不需要 IPTG 诱导。细胞培养和受体结合的孵育方法与上述相同。最终浓度为 550 HA Wieland 等人研究了新型 Y1 受体拮抗剂 BIBO 3304 及其对喂养的影响。1.5 6 106 个细胞 ml71，离心停止，方法与 Y1/BHK 细胞相同。

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BIBO-3304 TFA：对于离体葡萄糖刺激胰岛素分泌 (GSIS) 测定，从小鼠中分离胰岛并培养 48 小时。将 5 个胰岛一组在含 2 mM 葡萄糖的 KRB 缓冲液中预孵育 1 小时，然后在含 0.1% BSA 和不同葡萄糖浓度（2、11 或 20 mM）的 KRB 缓冲液中孵育 1 小时，并加入或不加入 100 nM 艾塞那肽、50 nM PYY 和/或 0.5 μM BIBO-3304 TFA。胰岛素释放采用放射免疫分析法测定。在胰岛灌注研究中，用11 mM葡萄糖灌注胰岛，并随时间测量胰岛素释放。对于[Ca²⁺]i测定，将单个β细胞从胰岛中分离出来，并用fura-2标记。胞质Ca²⁺浓度采用双波长微荧光法测定。对于免疫荧光，用抗胰岛素、Ki67、p-CREB和CD31的抗体对胰腺或移植组织切片进行染色。对于蛋白质印迹法，用磷酸化特异性CREB抗体检测胰岛裂解液。对于定量RT-PCR，从胰岛中提取RNA，并分析Gk、Pc、Mdh2、Hadh和其他基因的表达。[1][2]

动物/疾病模型：成年雄性Chbb:Thom大鼠，体重300至340克[1]
剂量：30微克
给药途径：双侧室旁核注射
实验结果：禁食后的过度摄食减轻，尤其是在再进食前2小时内。

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动物/疾病模型： 7周龄C57BL/6JAusb小鼠[2]
剂量： 0.5 μM
给药途径： 口服
实验结果：血清胰岛素水平显著升高。

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食物摄入量研究：体重在300至340克之间的成年雄性Chbb:Thom大鼠单独饲养，并维持在12小时光照/12小时黑暗循环中，从早上6:00开始。除实验期间动物禁食24小时外，其余时间均提供自来水和标准实验室饲料。适应新的饲养环境1周后，用戊巴比妥钠（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉动物，以便放置不锈钢引导套管。根据立体定位坐标（Paxinos & Watson，1986）：AP:71.8，L:0.5，V:7.0，将双侧引导套管（26号）置于室旁核上方1 mm处。引导套管用小型金属螺钉和牙科丙烯酸树脂水泥固定在颅骨上。不使用时，用不锈钢针芯封闭套管。大鼠术后至少恢复1周，并适应注射操作。实验当天，于上午8:00至9:00之间注射药物。注射套管（33号）插入至引导套管尖端远端1 mm处。注射套管通过聚乙烯管连接至安装在输液泵上的Hamilton微量注射器。注射量为0.5 ml，输注速率为0.0125 ml/s。在第一组实验中，每组6±12只大鼠接受递增剂量（0.5±32 mg，单侧）的NPY受体激动剂注射至室旁核（PVN），并监测至少2小时的食物摄入量。在首次给药当天，各组大鼠被随机分配至不同的剂量组。两次注射之间至少间隔3天的洗脱期，之后再次随机分组以测试下一个激动剂。总共注射次数不超过5±6次。在第二组实验中，在注射不同的NPY受体激动剂（加兰素或去甲肾上腺素）前10分钟，给予BIBO 3304或其非活性对映体。所有化合物均注射至PVN，每次实验使用8±22只大鼠，每个剂量组使用不同的大鼠。在最后一组实验中，对禁食24小时的动物注射了BIBO 3304。双侧PVN注射BIBO 3304五分钟后，大鼠（n=12）自由摄食，并监测其摄食量24小时。[1]

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Y1lox/lox小鼠的构建方法如前所述，并与在鼠胰岛素-2启动子控制下表达Cre重组酶基因的小鼠Tg(Ins2-cre)25Mgn/J(INS2cre/+)杂交，以获得Y1lox/lox/INS2cre/+小鼠。INS2cre/+小鼠还与Gt(ROSA)26Sor tm9(EGFP/Rpl10a)Amc/J小鼠杂交，以产生β细胞特异性表达的EGFP-L10a融合蛋白，用于mRNA分离和qPCR分析。为清晰起见，本文中分别将这些小鼠的胰岛组织称为WT和Y1−/−。除另有说明外，所有实验均使用C57BL/6Ausb背景的年龄和性别匹配的小鼠。雌性NOD小鼠饲养于温度控制在22℃、12小时光照/19:00（光照时间为07:00至19:00）的环境中，可自由饮水，并喂以标准饲料（6%的能量来自脂肪，21%的能量来自蛋白质，71%的能量来自碳水化合物，14.0 MJ/kg）。为避免灌胃引起的应激，将特异性Y1受体拮抗剂BIBO 3304溶解于蒸馏水中，并以凝胶剂的形式每日给药，给药时间见正文。这种给药方法由我们实验室开发，并已在之前的文献³¹中描述。简而言之，我们在实验开始前训练小鼠自愿摄入载体凝胶剂。经过2-5天的训练，超过95%的小鼠在放入笼中1分钟内吃完了全部果冻（25克小鼠195微升），并在整个研究期间保持了对果冻的高亲和力。在实验开始时，小鼠每天接受一次含有BIBO 3304的果冻，持续各研究中指定的时间段，而对照组小鼠则接受载体果冻。[2]

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BIBO-3304 TFA：在食物摄入量研究中，成年雄性Chbb:THOM大鼠（300-340克）被单独饲养，并植入双侧引导套管，靶向PVN【2†L114-L120】。在注射NPY受体激动剂、加兰素或去甲肾上腺素前10分钟，将BIBO-3304 TFA或其非活性对映体（0.5 μL体积，0.0125 μL/s）注射到PVN中【2†L122-L132】。监测食物摄入量2小时【2†L131】。在另一项实验中，将BIBO-3304 TFA双侧注射到禁食24小时的大鼠的PVN中，并监测食物摄入量24小时【2†L132-L134】。在胰岛移植研究中，通过静脉注射阿洛沙（110 mg/kg）诱导受体小鼠发生糖尿病。从供体小鼠中分离出胰岛，并移植到肾包膜下。将BIBO-3304 TFA溶于蒸馏水中，制成凝胶剂，每日给药。小鼠经训练后可自愿服用该凝胶剂。凝胶剂中BIBO-3304的浓度为0.5 μM。在某些实验中，剂量增加至5 μM。给药持续时间各不相同（例如，9天、10天），之后停止给药。定期监测血糖水平。禁食6小时后，通过腹腔注射或静脉注射葡萄糖（1 g/kg）进行葡萄糖耐量试验。采用ELISA或RIA法测定血清胰岛素水平。进行肾切除术以确认移植依赖性。对于人胰岛移植，使用免疫缺陷型NOD RAG1-/-小鼠。将人胰岛移植到肾包膜下，受体小鼠每日接受安慰剂或BIBO-3304 TFA（0.5 μM）治疗。 [1][2]

[1]. Subtype selectivity of the novel nonpeptide neuropeptide Y Y1 receptor antagonist BIBO 3304 and its effect on feeding in rodents. Br J Pharmacol. 1998 Oct;125(3):549-55.

[2]. Inhibition of Y1 receptor signaling improves islet transplant outcome. Nat Commun. 2017 Sep 8;8(1):490.

胰岛素分泌不足是1型和2型糖尿病的共同病理特征，并降低了胰岛细胞移植的成功率。本文证明Y1受体信号通路抑制β细胞释放胰岛素，并表明可通过药物手段增强胰岛素分泌。移植Y1受体缺陷型胰岛可加速化学诱导糖尿病受体小鼠血糖恢复正常，短期药物阻断移植小鼠和人胰岛中的Y1受体也能达到相同效果。此外，用Y1受体拮抗剂治疗非肥胖糖尿病小鼠可延缓糖尿病的发生。机制上，Y1受体信号通路抑制胰岛内cAMP的产生，从而通过CREB介导的途径下调糖酵解和ATP生成过程中几个关键酶的活性。因此，调控β细胞中的Y1受体信号通路为纠正1型糖尿病的病理状态以及胰岛移植过程中出现的胰岛素缺乏提供了一个独特的治疗契机。胰岛移植被认为是1型糖尿病的潜在治疗方法之一，但胰岛存活率低和功能受损限制了其应用。Loh等人发现Y1受体在β细胞中表达，抑制其信号通路（包括基因和药理学方法）可以改善小鼠和人类的胰岛功能。[2] 由于Y1受体可能参与抗焦虑作用（Wahlestedt等人，1993；Kask等人，1996），拮抗Y1受体可能会产生类似焦虑的副作用。为了评估焦虑效应是否会干扰BIBO 3304介导的摄食反应抑制，我们检测了BIBO 3304与其他兴奋剂（如去甲肾上腺素和加兰宁）介导的摄食反应之间的相互作用。如果焦虑在BIBO 3304介导的食物摄入抑制中发挥作用，那么去甲肾上腺素和加兰宁诱导的食物摄入也应受到抑制。然而，由于加兰宁和去甲肾上腺素诱导的食物摄入均未受到抑制，因此可以排除BIBO 3304食物摄入抑制特性中存在显著的焦虑成分。先前的研究表明，BIBP 3226介导的摄食拮抗作用并非由实验条件下的一般副作用引起（O'Shea等人，1997；Kask等人，个人交流）。然而，使用BIBP 3226获得的数据并不具有决定性意义（Doods等人，1996）。因此，我们测试了BIBO 3304的非活性对映体，以证明食物摄入的抑制并非由于BIBO 3304结构成分的普遍毒性所致。事实上，该对映体并未影响摄食反应。本研究鉴定出BIBO 3304，一种在亚纳摩尔浓度范围内具有活性且对Y1受体亚型具有选择性的非肽类化合物。我们假设Y1受体在NPY诱导的摄食过程中发挥重要作用，而BIBO 3304是研究食物摄入和其他由Y1受体介导的中枢效应的新工具。此外，使用BIBO 3304和激动剂（例如[Leu31, Pro34]NPY）的数据表明，在摄食行为中，不同的NPY受体之间存在复杂的相互作用。 [1]

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BIBO-3304 TFA：BIBO-3304 TFA是一种非肽类Y1受体拮抗剂，对Y1受体亚型具有亚纳摩尔级亲和力和高选择性【2†L46】。它是研究Y1受体在食物摄入和其他中枢效应中作用的重要工具【2†L181-L183】。该化合物通过抑制Y1受体信号传导发挥作用，从而减少cAMP的产生，并通过CREB介导的通路下调糖酵解和ATP生成中的关键酶，进而增强胰岛素分泌。在胰岛移植方面，短期使用BIBO-3304 TFA治疗可以稳定、长期地改善胰岛移植功能。该化合物还被证实能够延缓NOD小鼠糖尿病的发生，提示其可能具有延长新发1型糖尿病患者蜜月期的临床应用价值。[1][2]

C29H35N7O3

529.63330578804

643.273

C, 52.31; H, 4.92; F, 15.04; N, 12.94; O, 14.78

191868-14-1

191868-13-0;191868-14-1 (TFA);

5311021

White to off-white solid powder

5.748

212.52

7

9

13

46

862

1

O=C(C(C1C=CC=CC=1)C1C=CC=CC=1)N[C@@H](C(NCC1C=CC(CNC(N)=O)=CC=1)=O)CCC/N=C(\N)/N

FBMCYYWIBYEOST-GJFSDDNBSA-N

InChI=1S/C29H35N7O3.C2HF3O2/c30-28(31)33-17-7-12-24(26(37)34-18-20-13-15-21(16-14-20)19-35-29(32)39)36-27(38)25(22-8-3-1-4-9-22)23-10-5-2-6-11-23;3-2(4,5)1(6)7/h1-6,8-11,13-16,24-25H,7,12,17-19H2,(H,34,37)(H,36,38)(H4,30,31,33)(H3,32,35,39);(H,6,7)/t24-;/m1./s1

(2R)-N-[[4-[(carbamoylamino)methyl]phenyl]methyl]-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(2,2-diphenylacetyl)amino]pentanamide;2,2,2-trifluoroacetic acid

191868-14-1; BIBO 3304 TRIFLUOROACETATE; BIBO3304; BIBO3304 (TFA); BIBO3304 TFA; BIBO-3304; BIBO 3457; BIBO-3457;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~155.36 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。