BIO-1211

α4β (IC50 = 1:4 nM); α4β7 (IC50 = 2 μM); α1β1 (IC50 >100 μM); α5β1 (IC50 >100 μM); α6β1 (IC50 >100 μM); αLβ2 (IC50 >100 μM); αIIbβ3 (IC50 >100 μM)

本研究以高特异性alpha4beta1抑制剂4-((N'-2-methylphenyl)ureido)-phenylacetyl-leucine-aspartic acid-valine-脯氨酸(BIO1211)为模型含ldv配体，研究不同条件下Jurkat细胞上alpha4beta1整合素-配体相互作用对alpha4beta1激活状态的影响。观察到BIO1211结合的KD值范围从1 mM Mg2+、1 mM Ca2+中存在的整合素的非激活状态下的20-40 nM到2 mM Mn2+中存在的激活状态下的100 pM到18 pM，在2 mM Mn2+加10微克/毫升整合素激活单克隆抗体TS2/16共激活后测量结合。KD值的大范围几乎完全由整合素- bio1211复合物的解离率差异决定，其范围从0.17 x 10(-4) s-1到>140 x 10(-4) s-1。在相同条件下，缔合速率常数变化不大，均在0.9 ~ 2.7 × 10(6) M-1 s-1的狭窄范围内。与在饱和浓度的金属离子或TS2/16下观察到的结果相比，在二价阳离子和TS2/16共活化下观察到的亲和力进一步增加，表明这些因素导致活化的机制是不同的，并且鉴定出了以前未被识别的高亲和力状态，这是传统检测方法无法检测到的。当研究血管细胞粘附分子-1和CS1与alpha4beta1的结合特性时，也观察到类似的亲和力变化，表明BIO1211检测到的不同亲和力状态是整合素的固有特性[1]。

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整合素alpha4beta1介导白细胞募集、激活、介质释放和细胞凋亡抑制，在炎症病理生理中起核心作用。基于细胞纤维连接蛋白的可选拼接连接片段1 (CS-1)肽的Leu-Asp-Val (LDV)序列，描述了高亲和力、选择性的alpha4beta1抑制剂，采用了一种新的n端肽“帽”策略。其中一种抑制剂BIO-1211的效力大约是起始肽的10(6)倍，并表现出紧密结合特性(koff = 1.4 x 10(-4) s-1, KD = 70 pM)，这是一种非共价小分子蛋白质受体抑制剂的显著发现。BIO-1211对活化形式的alpha4beta1也具有200倍的选择性，并且它刺激了整合素beta1亚基上配体诱导的表位的表达，这一特性与受体的配体结合位点的占用一致。用3mg BIO-1211雾化预处理过敏羊，可抑制抗原刺激后的早期和晚期气道反应，并阻止气道对乙醇的非特异性高反应。这些结果表明，高选择性和强效的小分子拮抗剂可以被鉴定为整合素的主要特异性肽域，而不是Arg-Gly-Asp (RGD);它们证实了整合素作为小分子靶标的普遍性;他们证实alpha4beta1是哮喘的治疗靶点。[3]

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BIO-1211 对 α1β1、α5β1、α6β1、αLβ2 和 αIIbβ3 几乎没有作用 [3]。

在 EAE 中，BIO-1211（5 和 10 mg/kg，口服，每隔一天）剂量独立地降低细胞因子表达、白细胞运输并抑制炎症反应。 BIO-1211 显示显着较低的 EAE 临床评分，这与较低的 TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 产生以及较低的 CD11b+ 和 CD45+ 细胞浸润大脑皮层有关 [2]。

[3H]BIO1211与α4β1表达细胞的结合[1]
将FACS分选富集α4β1表达的Jurkat细胞置于RPMI 1640 + 10%胎牛血清的组织培养箱中，37℃保存。分别转染人α4、人α2或人α1基因并经FACS筛选α4β1、α2β1和α1β1表达水平较高的K562细胞，在分别添加1 mg/ml G418、10 μg/ml硫酸庆大霉素和50 μg/ml链霉素的培养基中生长。α2和α4 K562细胞是Dr. Martin Hemler赠送的。为了进行结合研究，将细胞离心成球，用TBS (50 mm Tris HCl, 150 mm NaCl, 0.1%牛血清白蛋白，2 mm葡萄糖，10 mm HEPES, pH 7.4)洗涤两次，在TBS中悬浮约2 × 106个细胞/ml，并使用Neubauer血细胞计进行计数。将细胞进一步用TBS稀释至所示浓度，并在室温下用[3H]BIO1211处理。将细胞离心成球，在100 μl TBS + Mn2+中重悬，并转移到含有2.9 ml scitiverse II (Fisher)的闪烁瓶中。通过闪烁计数来量化细胞相关放射性。所有研究均在硅化的1.5 ml埃彭多夫管中进行，标准样本量为1 ml。每种情况都在至少两个独立的研究中进行了测试。在上述研究中，在与[3H]BIO1211孵育后，在样品中添加100 - 1000倍的未标记BIO1211，以防止进一步结合。结合研究测试了细胞数量、孵育时间和[3H]BIO1211浓度对TBS和2 mm MnCl2的影响。在不添加金属离子的情况下，在不同的细胞密度和TBS中[3H]BIO1211的浓度下，评估[3H]BIO1211与细胞的非特异性结合。特定计数界限是通过从总计数界限中减去非特定计数来计算的。其他测试激活对结合影响的研究也按照指示进行。在1 mm Ca2+， 1 mmMg2+状态下，当K D = 20-40 nm时，BIO1211与α4β1结合，在标准分析格式中，较高BIO1211浓度下的高背景(在10 nm处3,000 cpm)限制了[3H]BIO1211可以测试的浓度为~ 10 nm;然而，通过将标签的比活性从50稀释到5 Ci/mmol，可以在高达100 nm的BIO1211浓度下评估结合，尽管精度降低。[1]

为了测量动力学速率，将Jurkat细胞在室温下用2 nm [3H]BIO1211处理指定时间，然后用500倍过量的未标记BIO1211处理，以抑制[3H]BIO1211的进一步结合。离心收集细胞，进行闪烁计数。为了测量动力学断率，Jurkat细胞在室温下用5 nm [3H]BIO1211处理1小时。加入500倍的未标记BIO1211，细胞进一步孵育到指定的时间。在每个时间点将细胞制成颗粒，并通过闪烁计数测量细胞相关的[3H]BIO1211。结合和解离数据表示为最大特定计数的百分比，作为时间的函数。通过非线性回归将数据拟合为指数曲线。岔开，指数速率常数就是岔开速率。对于k on，观察到的速率常数为真实速率常数乘以[3H]BIO1211浓度。在100 nm(20倍过量)到50 μm(10,000倍过量)的广泛浓度范围内，测试了添加未标记的BIO1211对解离率的影响。解离曲线在此浓度范围内重叠，表明过量的未标记配体对解离速率没有变构影响(数据未显示)。

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α4β1-配体相互作用的竞争评价[1]
[3H]BIO1211也通过竞争研究α4β1的功能，利用放射性作为α4β1占用的报告因子。在这种格式下，在所示缓冲液中的Jurkat细胞(1 × 106/ml)用连续稀释的测试化合物处理1小时，然后加入5 nm[3H]BIO1211，足以结合所有未被占用的受体，10分钟后测量结合计数。然后将细胞离心成球并进行闪烁计数。在这些条件下结合的计数测量未被测试化合物占用的整合素，因此可以自由地结合[3H]BIO1211。竞争形式也被用于动力学结合研究。结合和解离常数由α4β1计算，该α4β1经过测试化合物处理后可以自由结合[3H]BIO1211。

采用qRT-PCR、western blot和ELISA方法分析神经炎症反应。通过Evans蓝染色和免疫组化(IHC)分析小胶质细胞/单核细胞(CD11b)和白细胞(CD45)的特异性标记物来检测免疫细胞对脑的渗透。观察到TNF-α、IL-17、IFN-γ的表达降低，CD11b+和CD45+细胞在大脑皮层的扩散。[2]

动物/疾病模型： 未经免疫的C57BL/6小鼠（雄性，8周龄，体重20-25克）[2]。
剂量： 5和10 mg/kg。
给药途径： 从免疫前一天至免疫后第21天，隔日口服。
实验结果： 可预防EAE的诱导。与载体组相比，显著延缓EAE的发病，并减轻临床EAE的严重程度。与载体组相比，CD11b和CD45的表达显著降低。部分靶向炎症细胞因子（IFNγ、IL-17 和 TNF-α）的 mRNA 和可溶性形式显著降低。

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在 8 周龄 C57BL/6 小鼠中，通过皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG35-55) 诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)。在 EAE 诱导期间，将小鼠分为不同组，分别给予 BIO-1211（5 和 10 mg/kg）或 NTZ（5 mg/kg），以及两种化合物的联合给药。21 天后，采用 qRT-PCR、Western blot 和 ELISA 方法分析神经炎症反应。通过伊文思蓝染色和免疫组织化学 (IHC) 分析小胶质细胞/单核细胞 (CD11b) 和白细胞 (CD45) 的特异性标志物，检测免疫细胞向脑内的浸润情况。[2]

[1]. Multiple activation states of integrin alpha4beta1 detected through their different affinities for a small molecule ligand. J Biol Chem. 1999 May 7;274(19):13167-75.

[2]. Prophylactic Effect of BIO-1211 Small-Molecule Antagonist of VLA-4 in the EAE Mouse Model of Multiple Sclerosis. Immunol Invest. 2015;44(7):694-712.

[3]. Selective, tight-binding inhibitors of integrin alpha4beta1 that inhibit allergic airway responses. J Med Chem. 1999 Mar 11;42(5):920-34.

背景与目的：治疗性抗体的一些功能局限性和经济负担表明，引入具有相同或不同作用机制的替代治疗化合物可能是有价值的。在这方面，小分子拮抗剂可能具有广泛的应用前景，因此，本研究旨在探讨BIO-1211（极晚期抗原-4 (VLA4) 阻断剂）在多发性硬化症实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 小鼠模型中的预防作用，并与市售药物那他珠单抗 (NTZ) 进行比较。
方法：通过皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG35-55) 诱导8周龄C57BL/6小鼠发生EAE。在EAE诱导期间，将小鼠分为不同组，分别给予BIO-1211（5和10 mg/kg）或NTZ（5 mg/kg），以及两种化合物的联合给药。 21天后，采用qRT-PCR、Western blot和ELISA方法分析神经炎症反应。通过伊文思蓝染色和免疫组织化学（IHC）分析检测小胶质细胞/单核细胞（CD11b）和白细胞（CD45）的特异性标志物，以评估免疫细胞向脑内的浸润情况。
结果：在小鼠中，使用BIO-1211激动剂靶向破坏VLA4/VCAM1相互作用，可降低EAE模型中细胞因子的表达、白细胞的迁移，并抑制炎症反应（p < 0.01），且该作用与剂量无关（数据未显示）。接受 BIO-1211 和 NTZ 联合治疗的小鼠，其 EAE 临床评分显著降低，这与 TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 的表达降低以及 CD11b(+) 和 CD45(+) 细胞向大脑皮层的浸润减少相关。
结论：我们的结果表明，BIO12-11 化合物可作为进一步了解 VLA4/VCAM1 相互作用生物学功能的有效工具，并可被视为一种 EAE 抑制剂。[2]

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尽管已有许多检测方法用于研究 α4β1 的功能，但我们使用 [3H]BIO1211 生成的数据揭示了配体结合的多种特征，而这些特征是传统检测方法无法揭示的。最重要的观察结果是，激活并非由单一状态定义，而是由几种不同的状态定义，这些状态产生一系列亲和力，并且亲和力的差异与整合素-配体复合物的解离速率密切相关。作为α4β1功能的可溶性单价探针，BIO1211及其相关抑制剂代表了新的工具，有助于进一步揭示与整合素激活相关的复杂性。[1]

C36H48N6O9

708.80112

708.348

C, 61.00; H, 6.83; N, 11.86; O, 20.31

187735-94-0

9961766

White to off-white solid powder

5.433

237.3

7

9

16

51

1250

4

CC1=CC=CC=C1NC(=O)NC2=CC=C(C=C2)CC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)O

NVVGCQABIHSJSQ-KFZSMJGVSA-N

InChI=1S/C36H48N6O9/c1-20(2)17-26(38-29(43)18-23-12-14-24(15-13-23)37-36(51)40-25-10-7-6-9-22(25)5)32(46)39-27(19-30(44)45)33(47)41-31(21(3)4)34(48)42-16-8-11-28(42)35(49)50/h6-7,9-10,12-15,20-21,26-28,31H,8,11,16-19H2,1-5H3,(H,38,43)(H,39,46)(H,41,47)(H,44,45)(H,49,50)(H2,37,40,51)/t26-,27-,28-,31-/m0/s1

(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-3-carboxy-2-[[(2S)-4-methyl-2-[[2-[4-[(2-methylphenyl)carbamoylamino]phenyl]acetyl]amino]pentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid

BIO-1211; 187735-94-0; BIO 1211; UNII-61G4E2353I; 61G4E2353I; CHEMBL88478; L-Proline, N-((4-((((2-methylphenyl)amino)carbonyl)amino)phenyl)acetyl)-L-leucyl-L-alpha-aspartyl-L-valyl-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~352.71 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (2.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (2.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (2.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。