BIO-1211

α4β (IC50 = 1:4 nM); α4β7 (IC50 = 2 μM); α1β1 (IC50 >100 μM); α5β1 (IC50 >100 μM); α6β1 (IC50 >100 μM); αLβ2 (IC50 >100 μM); αIIbβ3 (IC50 >100 μM)
BIO-1211 targets the integrin α₄β₁ (VLA-4), a cell surface receptor that mediates leukocyte adhesion to VCAM-1 on endothelial cells. By inhibiting the interaction between VLA-4 and VCAM-1, BIO-1211 blocks leukocyte adhesion and migration into tissues. This reduces the recruitment of inflammatory cells to sites of inflammation, thereby attenuating the inflammatory response. The compound's selectivity for VLA-4 over other integrins makes it a valuable tool for studying VLA-4 function.

在本研究中，研究人员使用高特异性α4β1抑制剂4-((N'-2-甲基苯基)脲基)-苯乙酰基-亮氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-脯氨酸（BIO1211）作为含LDV的配体模型，研究了在影响α4β1激活状态的各种条件下，Jurkat细胞上α4β1整合素与配体的相互作用。观察到的BIO1211结合的KD值范围为：在1 mM Mg2+、1 mM Ca2+条件下，整合素处于非激活状态时为20-40 nM；在2 mM Mn2+条件下，整合素处于激活状态时为100 pM；在2 mM Mn2+和10 μg/ml整合素激活单克隆抗体TS2/16共同激活后，结合的KD值降至18 pM。 KD值的大范围变化几乎完全由整合素-BIO1211复合物解离速率的差异决定，其范围从0.17 × 10⁻⁴ s⁻¹到>140 × 10⁻⁴ s⁻¹。在相同条件下，结合速率常数的变化很小，均落在0.9至2.7 × 10⁶ M⁻¹ s⁻¹的狭窄范围内。与饱和浓度金属离子或单独使用TS2/16相比，在二价阳离子和TS2/16共激活下观察到的亲和力进一步增加，表明这些因素激活的机制不同，并揭示了α4β1上一种先前未被识别的高亲和力状态，该状态此前无法通过传统检测方法检测到。当研究血管细胞黏附分子-1和CS1与α4β1的结合特性时，也观察到了类似的亲和力变化，表明用BIO1211检测到的不同亲和力状态是整合素的固有特性。[1]整合素α4β1介导白细胞募集、活化、介质释放和凋亡抑制，并在炎症病理生理过程中发挥核心作用。本文描述了基于细胞纤连蛋白选择性剪接连接片段-1 (CS-1)肽段的Leu-Asp-Val (LDV)序列的高亲和力、选择性α4β1抑制剂，该抑制剂采用了一种新型的N端肽“帽”策略。其中一种抑制剂BIO-1211的效力约为起始肽的10⁶倍，并表现出紧密结合特性（koff = 1.4 × 10⁻⁴ s⁻¹，KD = 70 pM），这对于一种非共价的小分子蛋白受体抑制剂而言是一个显著的发现。BIO-1211对α4β1活化形式的选择性也高出200倍，并且能够刺激整合素β1亚基上配体诱导表位的表达，这一特性与受体配体结合位点的占据相一致。用3 mg雾化剂量的BIO-1211预处理过敏绵羊，可抑制抗原激发后的早期和晚期气道反应，并预防对卡巴胆碱的非特异性气道高反应性的发生。这些结果表明，可以鉴定出对整合素具有高选择性和高效小分子拮抗剂，这些拮抗剂的主要特异性是除Arg-Gly-Asp (RGD) 肽结构域以外的其他肽结构域；它们证实了整合素作为小分子靶点的普遍性；并且验证了α4β1作为哮喘治疗靶点的有效性。[3]

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BIO-1211对α1β1、α5β1、α6β1、αLβ2和αIIbβ3几乎没有作用[3]。
体外实验表明，BIO-1211是VLA-4与VCAM-1结合的高效选择性抑制剂。在基于细胞的实验中，它能抑制白细胞黏附于表达VCAM-1的内皮细胞。在基于细胞的实验中，BIO-1211处理可降低白细胞的黏附和迁移。选择性分析证实了该化合物对VLA-4相对于其他整合素的选择性。 BIO-1211 对 VLA-4 介导的粘附的抑制作用使其成为研究整合素功能和炎症的宝贵工具。

在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，BIO-1211（5 和 10 mg/kg，口服，隔日一次）可剂量非依赖性地降低细胞因子表达、白细胞迁移并抑制炎症反应。BIO-1211 显著降低了 EAE 的临床评分，这与 TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 的产生减少以及 CD11b+ 和 CD45+ 细胞向大脑皮层的浸润减少有关[2]。
在体内，BIO-1211 已被研究用于治疗炎症性疾病。通过抑制 VLA-4 介导的白细胞黏附，该化合物可以减轻哮喘、多发性硬化症和类风湿性关节炎动物模型中的炎症和组织损伤。BIO-1211 已在临床前研究中得到评估，并显示出抗炎活性。需要进行全面的体内疗效研究以充分表征其治疗潜力。 BIO-1211 是研究炎症的宝贵研究工具。

[3H]BIO1211 与表达 α4β1 的细胞的结合[1]
通过 FACS 分选富集 α4β1 表达的 Jurkat 细胞在含有 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中，于 37 °C 组织培养箱中培养。分别转染人 α4、人 α2 或人 α1 基因，并通过 FACS 筛选出高表达 α4β1、α2β1 和 α1β1 的 K562 细胞，在添加了 1 mg/ml G418、10 μg/ml 硫酸庆大霉素和 50 μg/ml 链霉素的相同培养基中培养。α2 和 α4 K562 细胞由 Martin Hemler 博士惠赠。在结合实验中，细胞经离心沉淀后，用TBS缓冲液（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%牛血清白蛋白，2 mM葡萄糖，10 mM HEPES，pH 7.4）洗涤两次，重悬于TBS缓冲液中，细胞浓度约为2 × 10⁶个/ml，并使用纽鲍尔血细胞计数板进行计数。将细胞用TBS缓冲液进一步稀释至指定浓度，并在室温下用[³H]BIO1211处理。然后，细胞经离心沉淀后，重悬于100 μl含Mn²⁺的TBS缓冲液中，并转移至含有2.9 ml ScintiVerse II（Fisher）的闪烁瓶中。通过闪烁计数法定量细胞结合的放射性。所有实验均在硅化1.5 ml Eppendorf管中进行，标准样品体积为1 ml。每种条件均在至少两项独立研究中进行了测试。在指定的研究中，在与[3H]BIO1211孵育后，向样品中加入100-1000倍过量的未标记BIO1211，以防止进一步结合。如前所述，在含2 mM MnCl2的TBS缓冲液中进行结合实验，以测试细胞数量、孵育时间和[3H]BIO1211浓度的影响。在TBS缓冲液中，于不添加金属离子的情况下，评估了每种细胞密度和[3H]BIO1211浓度下[3H]BIO1211与细胞的非特异性结合。通过从总结合计数中减去非特异性结合计数来计算特异性结合计数。其他测试活化对结合影响的研究也按所述进行。在 1 mM Ca2+、1 mM Mg2+ 条件下，BIO1211 与 α4β1 结合的 KD 为 20–40 nm，标准检测方法中较高 BIO1211 浓度（10 nm 时为 3,000 cpm）下的背景信号较高，限制了可测试的 [3H]BIO1211 浓度约为 10 nm；然而，通过将标记物的比活度从 50 Ci/mmol 稀释到 5 Ci/mmol，可以在高达 100 nm 的 BIO1211 浓度下评估结合情况，尽管精度有所降低。[1]
对于动力学速率测量，将 Jurkat 细胞在室温下用 2 nm [3H]BIO1211 处理指定时间，然后用 500 倍过量的未标记 BIO1211 处理，以淬灭 [3H]BIO1211 的进一步结合。细胞经离心收集后进行闪烁计数。为测定动力学解离速率，将Jurkat细胞在室温下用5 nM [3H]BIO1211处理1小时。加入500倍过量的未标记BIO1211，并继续孵育指定时间。在每个时间点收集细胞，并通过闪烁计数测定细胞结合的[3H]BIO1211。结合和解离数据以最大特异性结合计数的百分比表示，作为时间的函数。数据通过非线性回归拟合指数曲线。对于解离速率常数（k_off），指数速率常数即为解离速率。对于结合速率常数（k_on），观测速率常数为真实速率常数乘以[3H]BIO1211浓度。在100 nM（20倍过量）至50 μM（10,000倍过量）的宽浓度范围内测试了添加未标记的BIO1211对解离速率的影响。在此浓度范围内，解离曲线可以重叠，表明过量的未标记配体对解离速率没有变构效应（数据未显示）。

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\\通过竞争评估α4β1-配体相互作用[1]
\[3H]BIO1211也被用于通过竞争研究α4β1的功能，使用放射性作为α4β1占有率的指示剂。在此实验中，将Jurkat细胞（1 × 10⁶/ml）置于指定缓冲液中，用系列稀释的测试化合物处理1小时，然后加入5 nM [³H]BIO1211（足以结合所有未被占据的受体），孵育10分钟后测定结合计数。随后离心收集细胞，并进行闪烁计数。在此条件下测定的结合计数代表未被测试化合物占据的整合素，因此可以自由结合[³H]BIO1211。竞争实验也用于动力学结合研究。结合常数和解离常数根据经测试化合物处理后可自由结合[³H]BIO1211的α₄β₁计算得出。
BIO-1211的体外受体结合实验包括测定其与整合素α₄β₁（VLA-4）的结合亲和力。将受体与放射性标记配体和不同浓度的BIO-1211孵育。测量放射性标记配体的置换情况，并计算IC₅₀或Ki值。使用类似的检测方法评估该化合物对VLA-4相对于其他整合素的选择性。这些检测结果证实了该化合物作为VLA-4抑制剂的作用机制。

采用 qRT-PCR、Western blot 和 ELISA 方法分析神经炎症反应。通过伊文思蓝染色和免疫组织化学 (IHC) 分析检测小胶质细胞/单核细胞 (CD11b) 和白细胞 (CD45) 的特异性标志物，以评估免疫细胞向脑组织的浸润情况。观察到 TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 的表达降低，以及 CD11b+ 和 CD45+ 细胞向大脑皮层的浸润。[2]
体外细胞实验评估了 BIO-1211 对白细胞黏附和迁移的影响。将白细胞用荧光染料标记，并与 BIO-1211 孵育，然后加入表达 VCAM-1 的内皮细胞单层。通过测量荧光强度来量化黏附。使用 Transwell 或 Boyden 小室实验评估迁移。这些检测证实了该化合物作为 VLA-4 抑制剂的功能活性。

动物/疾病模型： 未经免疫的C57BL/6小鼠（雄性，8周龄，体重20-25克）[2]。
剂量： 5和10 mg/kg。
给药途径： 从免疫前一天至免疫后第21天，隔日口服。
实验结果： 可预防EAE的诱导。与载体组相比，显著延缓EAE的发病，并减轻临床EAE的严重程度。与载体组相比，CD11b和CD45的表达显著降低。部分靶向炎症细胞因子（IFNγ、IL-17 和 TNF-α）的 mRNA 和可溶性形式显著降低。

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通过皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG35-55) 对 8 周龄 C57BL/6 小鼠进行免疫，诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)。在 EAE 诱导期间，将小鼠分为不同组，分别给予 BIO-1211（5 和 10 mg/kg）或 NTZ（5 mg/kg），以及两种化合物的联合给药。21 天后，采用 qRT-PCR、Western blot 和 ELISA 方法分析神经炎症反应。通过伊文思蓝染色和免疫组织化学 (IHC) 分析检测小胶质细胞/单核细胞 (CD11b) 和白细胞 (CD45) 的特异性标志物，来研究免疫细胞向脑部的浸润情况。[2]
已在哮喘、多发性硬化症和类风湿性关节炎等炎症性疾病模型中开展了 BIO-1211 的体内动物实验。动物接受 BIO-1211 治疗，并通过临床评分、组织学分析和炎症标志物检测来评估疾病严重程度。正在进行药代动力学研究以确定该化合物的半衰期、清除率和组织分布。全面的体内研究正在进行中。

BIO-1211的药代动力学（PK）数据有限。该化合物的分子量为503.55 g/mol，可溶于DMSO。其代谢稳定性、半衰期和生物利用度尚未得到充分表征。需要开展全面的ADME研究以全面了解BIO-1211的药代动力学特征。

BIO-1211的毒性特征尚未得到充分表征。在实验室环境中，应将BIO-1211作为危险化学品处理。处理该化合物时应使用适当的个人防护装备。该化合物仅供研究使用，不得用于人类或兽医用途。需要进行全面的毒理学研究以充分表征BIO-1211的安全性。

[1]. Multiple activation states of integrin alpha4beta1 detected through their different affinities for a small molecule ligand. J Biol Chem. 1999 May 7;274(19):13167-75.

[2]. Prophylactic Effect of BIO-1211 Small-Molecule Antagonist of VLA-4 in the EAE Mouse Model of Multiple Sclerosis. Immunol Invest. 2015;44(7):694-712.

[3]. Selective, tight-binding inhibitors of integrin alpha4beta1 that inhibit allergic airway responses. J Med Chem. 1999 Mar 11;42(5):920-34.

背景与目的：治疗性抗体的功能局限性和经济负担表明，引入具有相同或不同作用机制的替代治疗化合物可能具有重要价值。小分子拮抗剂在这方面可能具有广阔的应用前景；因此，本研究旨在探讨BIO-1211（一种极晚期抗原4 (VLA4) 阻断剂）在多发性硬化症诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 小鼠模型中的预防作用，并将其与市售药物那他珠单抗 (NTZ) 进行比较。方法：通过皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG35-55) 诱导8周龄C57BL/6小鼠发生EAE。在EAE诱导期间，将小鼠分为不同组，分别给予BIO-1211（5和10 mg/kg）、NTZ（5 mg/kg）或二者联合用药。 21天后，我们采用qRT-PCR、Western blot和ELISA分析了神经炎症反应。我们使用伊文思蓝染色和免疫组织化学(IHC)分析检测了小胶质细胞/单核细胞(CD11b)和白细胞(CD45)的特异性标志物，从而评估了免疫细胞向脑内的浸润情况。结果：在小鼠中，使用BIO-1211激动剂靶向并破坏VLA4/VCAM1相互作用可降低细胞因子表达、白细胞迁移，并抑制EAE模型中的炎症反应(p < 0.01)，且该效应与剂量无关（数据未显示）。接受BIO-1211和NTZ联合治疗的小鼠EAE临床评分显著降低，这与TNF-α、IL-17和IFN-γ表达降低以及CD11b(+)和CD45(+)细胞向大脑皮层的浸润减少相关。结论：我们的研究结果表明，化合物BIO12-11可作为深入理解VLA4/VCAM1相互作用生物学功能的有效工具，并可被视为一种EAE抑制剂。[2]尽管已有多种检测方法用于研究α4β1的功能，但[3H]BIO1211产生的数据揭示了传统检测方法无法发现的配体结合的多种特征。最重要的发现是，激活并非由单一状态定义，而是由多种不同的状态构成，这些状态产生一系列亲和力，且亲和力的差异与整合素-配体复合物的解离速率密切相关。作为一种可溶性单价α4β1功能探针，BIO1211及其相关抑制剂代表了有助于进一步揭示整合素激活复杂性的新型工具。 [1]
BIO-1211 是一种高效、选择性的小分子抑制剂，可抑制整合素 α₄β₁ (VLA-4) 与 VCAM-1 之间的相互作用。其分子式为 C₂₈H₂₉N₃O₆，分子量为 503.55 g/mol。BIO-1211 通过阻断 VLA-4 与 VCAM-1 的结合来抑制白细胞的黏附和迁移。该化合物已被研究用于治疗包括哮喘、多发性硬化症和类风湿性关节炎在内的炎症性疾病。BIO-1211 是研究整合素功能的重要研究工具。

C36H48N6O9

708.80112

708.348

C, 61.00; H, 6.83; N, 11.86; O, 20.31

187735-94-0

9961766

White to off-white solid powder

5.433

237.3

7

9

16

51

1250

4

CC1=CC=CC=C1NC(=O)NC2=CC=C(C=C2)CC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)O

NVVGCQABIHSJSQ-KFZSMJGVSA-N

InChI=1S/C36H48N6O9/c1-20(2)17-26(38-29(43)18-23-12-14-24(15-13-23)37-36(51)40-25-10-7-6-9-22(25)5)32(46)39-27(19-30(44)45)33(47)41-31(21(3)4)34(48)42-16-8-11-28(42)35(49)50/h6-7,9-10,12-15,20-21,26-28,31H,8,11,16-19H2,1-5H3,(H,38,43)(H,39,46)(H,41,47)(H,44,45)(H,49,50)(H2,37,40,51)/t26-,27-,28-,31-/m0/s1

(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-3-carboxy-2-[[(2S)-4-methyl-2-[[2-[4-[(2-methylphenyl)carbamoylamino]phenyl]acetyl]amino]pentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid

BIO-1211; 187735-94-0; BIO 1211; UNII-61G4E2353I; 61G4E2353I; CHEMBL88478; L-Proline, N-((4-((((2-methylphenyl)amino)carbonyl)amino)phenyl)acetyl)-L-leucyl-L-alpha-aspartyl-L-valyl-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~352.71 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (2.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (2.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (2.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。