MEK5 (IC50 = 1.5 nM); ERK5 (IC50 = 59 nM); CSF1R (FMS) (IC50 = 46 nM); LCK (IC50 = 250 nM); JAK3 (IC50 = 440 nM); TGFβR1 (IC50 = 580 nM); RPS6KA6 (RSK4) (IC50 = 990 nM); RPS6KA3 (RSK2) (IC50 = 2.1 μM); FGFR1 (IC50 = 1 μM); KIT (IC50 = 1.1 μM); ABL1 (IC50 = 2.4 μM); MAPK14 (p38 alpha) (IC50 = 3.7 μM); SRC (IC50 = 7.6 μM)
Mitogen-activated protein kinase kinase 5 (MEK5) inhibitor (IC₅₀ = 1.5 nM).
Extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) inhibitor (IC₅₀ = 59 nM). [1]
MEK5 (IC50 = 1.5 nM)
ERK5 (IC50 = 59 nM)[2]
MEK5/ERK5 pathway (described as a specific MEK5 inhibitor). [3]

BIX02189 阻断 ERK5 磷酸化，而不影响山梨醇刺激的 HeLa 细胞中 ERK1/2 的磷酸化。 BIX02189 抑制 ERK5 磷酸化的基础是剂量依赖性机制[1]。氟伐他汀响应晚期糖基化终末产物 (AGE)，抑制血管平滑肌细胞 (VSMC) 增殖。使用或不使用氟伐他汀对 VSMC 进行 AGE 处理，看看是否存在这种效应，然后对细胞进行 MTT 测定。所观察到的氟伐他汀显着抑制 AGEs 对细胞增殖的剂量依赖性诱导。除 MTT 测定外，通过细胞计数也可获得相同的结果。当 VSMC 接受 BIX02189 作为预处理时，可以避免氟伐他汀的抑制作用。使用 Ad-CA-MEK5α（编码具有组成型活性的 MEK5（ERK5 上游激酶）的突变形式），还研究了激活 ERK5 是否可以抑制增殖。在 Ad-CA-MEK5 存在的情况下，通过 MTT 测定和细胞计数测量，AGE 诱导的增殖显着减少，并且使用 siRNA 消除 Nrf2 可恢复 AGE 诱导的增殖[2]。

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BIX02189 能剂量依赖性地抑制纯化的MEK5酶的催化活性，IC₅₀为1.5 nM。[1]
BIX02189 能抑制纯化的ERK5酶的催化活性，IC₅₀为59 nM。[1]
BIX02189 对MEK5具有高选择性，对密切相关的激酶MEK1和MEK2抑制活性很弱。在高达6300 nM的浓度下，对ERK1、ERK2或JNK2也无显著抑制。[1]
在针对79种激酶的选择性谱测试中，BIX02189在3或10 µM浓度下，对其中85种激酶显示出超过100倍的选择性。在测试浓度下，仅对少数激酶（如CSF1R、RPS6KA3、RPS6KA6）的抑制率超过50%。[1]
针对选定激酶组的剂量反应分析证实了其对MEK5的主要效力，对其他激酶的IC₅₀值较高。[1]
在山梨醇刺激的HeLa细胞中，BIX02189能剂量依赖性地抑制ERK5的磷酸化，但不影响ERK1/2、p38或JNK1/2的磷酸化。[1]
在细胞反式报告基因检测中，BIX02189能剂量依赖性地抑制MEK5/ERK5/MEF2C驱动的荧光素酶基因表达，且Alamar Blue检测未显示细胞毒性。[1]
BIX02189 以剂量依赖方式抑制MEK5催化活性，IC50为1.5 nM；抑制ERK5催化活性，IC50为59 nM。它表现出高选择性，对MEK1和MEK2的IC50 >6200 nM，对ERK1的IC50 >6300 nM，对JNK2的IC50 >6200 nM。在对79种激酶进行的单浓度（3 µM 或 10 µM）测试中，BIX02189 对87种激酶中的85种显示出大于100倍的选择性。在山梨醇刺激的HeLa细胞中，BIX02189 以剂量依赖方式抑制ERK5磷酸化，但不抑制ERK1/2、p38或JNK1/2的磷酸化。此外，在使用共转染了组成型活性MEK5、ERK5和MEF2C-GAL4融合蛋白的HeLa或HEK293T细胞的报告基因检测系统中，BIX02189 以剂量依赖方式抑制MEF2C驱动的荧光素酶报告基因表达，且通过Alamar Blue检测未显示细胞毒性。 [2]
在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，用 10 µM 的 BIX02189 预处理 16-24 小时，可抑制层流（12 dynes/cm²，16-24 小时）诱导的 ERK5 磷酸化，以及下游 Nrf2 靶基因 HO-1 和 NQO1 与 KLF2 靶基因 eNOS 的蛋白表达。
在另一项实验中，用 10 µM 的 BIX02189 预处理 HUVECs 16-24 小时。通过细胞分馏和免疫印迹分析发现，BIX02189 强烈抑制了层流诱导的 Nrf2 核转位。同时也抑制了 ERK5 自身的核转位。
此外，在一项报告基因检测中，共转染了 pGL3-ARE-荧光素酶载体的 HUVECs，经 BIX02189 预处理（该检测中浓度未具体说明，但实验方法与 10 µM 预处理一致）后，层流诱导的抗氧化反应元件（ARE，依赖于 Nrf2 转录活性）的激活被抑制。 [3]

腹膜内给予小鼠 10 mg/kg 的 BIX02189（在 25% DMSO 中）或载体对照（相同体积的 25% DMSO）。在用 BIX02189 治疗的小鼠中，主动脉内皮细胞中 Nrf2 的核定位受到抑制[3]。

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在小鼠体内模型中，腹腔注射 BIX02189（10 mg/kg，溶于 25% DMSO）抑制了在稳态层流（抗动脉粥样硬化区域）条件下，胸主动脉内皮细胞中 Nrf2 的核转位。该结果通过对主动脉内皮进行整体铺片免疫荧光染色评估。 [3]

从杆状病毒表达系统中分离的 MEK5 蛋白用于利用 PKLight ATP 检测试剂测量激酶活性。该测定使用 15 nM GST-MEK5 和 0.75 μM ATP，在不同浓度的 BIX02189 存在下，在由 25 mM Hepes、pH 7.5、10 mM MgCl2、50 mM KCl、0.2% BSA、0.01% CHAPS 组成的测定缓冲液中进行、100 μM Na3VO4、0.5 mM DTT 和 1% DMSO。在室温下孵育 90 分钟后，将 10 μL ATP 检测试剂添加到激酶反应混合物中，然后再孵育 15 分钟。测量相对光单位 (RLU) 信号，并将 RLU 信号转换为对照百分比 (POC) 值以确定 IC50 值。

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MEK5/ERK5催化活性测定： 将纯化的GST标记的MEK5或ERK5酶与ATP在含有不同浓度BIX02189的测定缓冲液中于室温孵育90分钟。反应后，使用基于荧光素酶-荧光素系统的ATP检测试剂定量残留ATP，并通过测量发光信号计算IC₅₀值。[1]
使用从杆状病毒表达系统分离的MEK5和ERK5蛋白测量激酶活性。该检测采用基于荧光素-荧光素酶的均质ATP检测试剂来量化残留ATP。反应混合物包含15 nM GST-MEK5 或 20 nM GST-ERK5 以及 0.75 µM ATP，反应缓冲液成分为：25 mM Hepes (pH 7.5)、10 mM MgCl2、50 mM KCl、0.2% BSA、0.01% CHAPS、100 µM Na3VO4、0.5 mM DTT 和 1% DMSO。激酶反应在室温下孵育90分钟。随后，加入10 µL ATP检测试剂并孵育15分钟。测量相对光单位（RLU）信号并转换为相对于对照的百分比值。抑制剂以10 µM为起始最高浓度进行10点剂量滴定测试，并根据剂量反应曲线计算IC50值。 [2]

MTT法用于测量AGE引起的增殖。 VSMC在24孔板上培养，当它们约80%汇合时，向培养基中添加无血清DMEM。 BIX02189 (2 mM) 预处理后，然后使用氟伐他汀 (5 mM) 刺激细胞。添加MTT试剂，在37°C下孵育4小时，去除，在PBS中洗涤，并在DMSO中洗脱。使用酶标仪在 570 nm 处测量增殖[2]。

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ERK5磷酸化检测（蛋白质免疫印迹）： 将HeLa细胞铺板并血清饥饿20小时。在山梨醇刺激前90分钟加入BIX02189。刺激后裂解细胞，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析ERK5、ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平。[1]
MEK5/ERK5/MEF2C反式报告基因检测： 使用脂质体转染试剂将组成型活性MEK5、ERK5、MEF2C-GAL4融合蛋白和GAL4-荧光素酶报告基因的质粒共转染至细胞中。转染后约5小时，将细胞接种到白色96孔板中。加入不同浓度的BIX02189孵育18-24小时后，使用商业荧光素酶检测系统测量荧光素酶活性，并用Alamar Blue法评估细胞毒性。[1]
用于ERK5磷酸化的Western blot分析：将HeLa细胞接种于六孔板中，血清饥饿20小时。细胞在用0.4 M山梨醇于37°C刺激20分钟前，用BIX02189预处理1.5小时。然后收集细胞，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。裂解物离心后与上样缓冲液混合，煮沸，并在10% Tris-甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，并使用抗磷酸化-ERK5、抗总ERK5、抗磷酸化-ERK1/2、抗磷酸化-p38和抗磷酸化-JNK抗体进行免疫印迹。 [2]
报告基因检测：使用脂质体转染试剂转染HeLa或HEK293T细胞。DNA混合物包括组成型活性MEK5、ERK5、MEF2C-GAL4融合蛋白和GAL4-荧光素酶报告载体的质粒。转染5小时后，将细胞接种到白色96孔板中。在测定荧光素酶活性前18-24小时，加入不同浓度的BIX02189。使用市售荧光素酶检测试剂测定荧光素酶活性。使用Alamar Blue试剂平行评估化合物的细胞毒性。 [2]
用于分析流动诱导蛋白表达的蛋白质印迹法：将 HUVECs 培养在明胶包被的培养皿上。汇合的细胞在 37°C、5% CO2 条件下，使用锥板流动腔系统暴露于单向层流（12 dynes/cm²）16-24 小时。测试 BIX02189 时，在流动暴露前 16-24 小时将化合物（终浓度 10 µM，从 DMSO 母液添加）加入培养基。刺激后，收集细胞并进行裂解。蛋白质通过 SDS-PAGE 分离，转膜，并使用针对目标蛋白（如 HO-1、NQO1、eNOS、磷酸化 ERK5、总 ERK5、微管蛋白）的特异性抗体进行免疫印迹。
用于分析蛋白质亚细胞定位的实验：用 10 µM BIX02189 预处理 HUVECs 16-24 小时，然后暴露于层流或保持静态条件。随后使用适当的缓冲液将细胞分馏为胞质和核组分。通过免疫印迹分析 Nrf2 和 ERK5 等蛋白在这些组分中的分布，并使用区室特异性标志物抗体（如胞质用微管蛋白，细胞核用 lamin B）确认分馏纯度。
用于荧光素酶报告基因检测的实验：将含有 ARE 启动子连接荧光素酶的质粒（pGL3-ARE-luc）与用于标准化的对照海肾荧光素酶质粒共转染到 HUVECs 中。转染后，用 BIX02189 预处理细胞，然后暴露于层流 16-24 小时。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测量荧光素酶活性，萤火虫荧光素酶活性通过海肾荧光素酶活性进行归一化。
用于检测细胞内源性蛋白相互作用的实验：将 HUVECs 暴露于层流不同时间。使用针对 ERK5 和 Nrf2 的抗体，按照制造商说明进行原位邻近连接检测（Duolink）。相互作用在荧光显微镜下可视化为荧光点，细胞核进行复染。 [3]

Mice: The mice used are C57BL/6-specific pathogen-free mice. Six-week-old male C57BL/6 mice are intraperitoneally treated with BIX02189 (10 mg/kg of body weight in 25% DMSO) or vehicle control to determine the role of ERK5 on laminar flow-dependent Nrf2 nuclear translocation in vivo. Following euthanasia, vascular perfusion with saline is carried out for 5 min, and then the animal is fixed for 5 min in 4% paraformaldehyde. Fat is removed after a 0.1% PBS with Tween incubation on an isolated aorta. Antibody diluents and blocking solutions are made with 5% goat serum. Anti-vascular endothelial-cadherin antibody and Topro3 are used to stain aortic endothelial cells for the endothelial cell junction and the nuclear, respectively. Immunofluorescence staining with anti-Nrf2 antibody and a Confocal microscope are used to identify Nrf2's cellular localization[3].

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Mice were treated with a single intraperitoneal injection of BIX02189 at a dose of 10 mg/kg. The compound was dissolved in 25% DMSO (vehicle control was the same volume of 25% DMSO). After treatment, the thoracic aorta was harvested. The endothelial layer of the aorta was subjected to en face immunofluorescence staining. Tissues were stained with antibodies against Nrf2 (to visualize its localization), vascular endothelial-cadherin (VE-cadherin, to mark endothelial cell junctions), and a nuclear stain. Stained samples were examined under a confocal microscope to assess the nuclear vs. cytosolic localization of Nrf2 in aortic endothelial cells. [3]

[1]. Identification of pharmacological inhibitors of the MEK5/ERK5 pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Dec 5;377(1):120-5.

[2]. Fluvastatin inhibits AGE-induced cell proliferation and migration via an ERK5-dependent Nrf2 pathway in vascular smooth muscle cells. PLoS One. 2017 May 22;12(5):e0178278.

[3]. Laminar flow activation of ERK5 protein in vascular endothelium leads to atheroprotective effect via NF-E2-related factor 2 (Nrf2) activation. J Biol Chem. 2012 Nov 23;287(48):40722-31.

3-[[3-[(dimethylamino)methyl]anilino]-phenylmethylidene]-N,N-dimethyl-2-oxo-1H-indole-6-carboxamide is an indolecarboxamide.

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BIX02189 is an indolinone-6-carboxamide compound, identified as a novel and potent pharmacological inhibitor of the MEK5 kinase. [1]
It offers high selectivity for the MEK5/ERK5 pathway over other MAPK pathways (ERK1/2, p38, JNK) in cellular models. [1]
This compound is presented as a valuable pharmacological tool for investigating the role of the MEK5/ERK5 signaling cascade in various biological processes, including cell proliferation, survival, and cardiovascular pathophysiology. [1]
BIX02189 is an indolinone-6-carboxamide compound identified as a novel and selective pharmacological inhibitor of the MEK5/ERK5 pathway. It serves as a valuable tool compound to better characterize the role of this pathway in various biological systems, including cell proliferation, survival, stress response, tumor progression, neuronal survival, and cardiovascular pathophysiology. The study highlights the lack of selective catalytic inhibitors for this pathway prior to this report. [2]
BIX02189 is used in this study as a specific pharmacological inhibitor of MEK5 to investigate the role of the MEK5/ERK5 pathway in laminar flow-mediated signaling in vascular endothelial cells. The study demonstrates that ERK5 activation by laminar flow leads to an atheroprotective effect through the activation of the transcription factor Nrf2. BIX02189 was instrumental in showing that inhibition of this pathway blocks Nrf2 nuclear translocation and the expression of cytoprotective genes (e.g., HO-1, NQO1), both in cultured endothelial cells and in the mouse aorta in vivo. The findings suggest that the ERK5-Nrf2 axis is a critical component of flow-mediated endothelial protection and could be a potential target for treating atherosclerosis. [3]

C₂₇H₂₈N₄O₂M

440.53682

440.221

C, 73.61; H, 6.41; N, 12.72; O, 7.26

1265916-41-3

(E/Z)-BIX02189;1094614-85-3

135659062

White to yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

653.4±55.0 °C at 760 mmHg

349.0±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.659

2.05

71.9

2

4

6

33

688

0

O=C(N(C)C)C1=CC(NC2=O)=C(/C2=C(C3=CC=CC=C3)/NC4=CC=CC(CN(C)C)=C4)C=C1

ZGXOBLVQIVXKEB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H28N4O2/c1-30(2)17-18-9-8-12-21(15-18)28-25(19-10-6-5-7-11-19)24-22-14-13-20(27(33)31(3)4)16-23(22)29-26(24)32/h5-16,29,32H,17H2,1-4H3

3-[N-[3-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-C-phenylcarbonimidoyl]-2-hydroxy-N,N-dimethyl-1H-indole-6-carboxamide

BIX02189; BIX 02189; BIX-02189

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~88 mg/mL (~199.8 mM)
Ethanol: ~88 mg/mL (~199.8 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 10mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。