PD-1/PD-L1 interaction
Human programmed death-ligand 1 (PD-L1) (blocks PD-1/PD-L1 interaction)[2]

BMS-1001 将自身附着在人类 PD-L1 上并阻止其与 PD-1 相互作用。 BMS-1001 对所检查的细胞系表现出最小的毒性，并抑制可溶性 PD-L1 和细胞表面表达的 PD-1 之间的通讯。 BMS-1001 可减弱可溶性 PD-L1 对 T 细胞受体介导的 T 淋巴细胞活化的抑制作用 [1]。

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BMS-1001 与人源PD-L1结合，并阻断其与PD-1的相互作用，这通过基于核磁共振的拮抗剂诱导解离实验证实。它能减轻可溶性及膜结合PD-L1对Jurkat T细胞（PD-1效应细胞）T细胞受体介导的激活的抑制作用。在使用PD-1效应细胞与表达PD-L1的人工抗原呈递细胞共培养的PD-1/PD-L1检查点实验中，BMS-1001 剂量依赖性地诱导荧光素酶活性，证明其在细胞界面拮抗PD-1/PD-L1检查点的能力，但其效力和最大激活水平低于治疗性抗体。[2]
BMS-1001 剂量依赖性地消除了可溶性PD-L1 (sPD-L1) 对T细胞激活的抑制作用。在相对于sPD-L1为2倍和5倍摩尔过量的浓度下，它能将细胞激活完全恢复到仅使用抗CD3抗体观察到的水平。[2]
流式细胞术分析表明，将荧光标记的sPD-L1与BMS-1001 预孵育可显著降低其与表达PD-1的Jurkat细胞的结合，表明其在细胞表面干扰了PD-1/PD-L1相互作用。[2]
BMS-1001 在溶液中诱导可溶性PD-L1形成二聚体，这通过NMR滴定（谱线增宽）、尺寸排阻色谱（保留时间偏移）和交联实验（SDS-PAGE显示二聚体条带）证实。[2]

NP19 [[BMS-1001类似物]]在H22肝癌小鼠模型中的体内抗肿瘤活性[3]
鉴于NP19在黑色素瘤B16-F10肿瘤模型中具有良好的体内抗肿瘤效果，且PD-1/PD-L1抑制剂具有广谱的抗肿瘤活性，我们进一步利用H22肝癌模型BALB/c小鼠对复方NP19的体内抗肿瘤效果进行了评价。每只小鼠右侧皮下注射80万个H22细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时，随机选取小鼠，通过腹腔注射NP19或载体溶液治疗14天。如图8所示，NP19在25 mg/kg剂量下具有显著的体内抗肿瘤功效，TGI为76.5%（图8A， 8B, 8C）。此外，NP19没有引起明显的体重减轻（图8D），表明该化合物耐受性良好。

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NP19 [[BMS-1001类似物]]在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中的体内抗肿瘤活性[3]
为了确定新合成化合物的体外抗pd -1/PD-L1活性是否可以转化为体内功效，我们在小鼠黑色素瘤B16-F10肿瘤模型上测试了化合物NP19的抗肿瘤活性。选择NP19进行体内疗效研究，是因为与更有效的化合物NP2或同样有效的化合物NP12相比，NP19易于合成且细胞毒性较小（表9）。我们将携带黑色素瘤的BALB/c小鼠分别以载药对照和NP19 （25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）灌胃治疗，每天1次，持续15天。如图6所示，治疗15天后，NP19治疗显著抑制了黑色素瘤的生长。

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NP19的体内药代动力学性质[[BMS-10016的类似物]][3]
由于化合物NP19在体外表现出较高的药效，接下来通过静脉注射和口服给药来评估雄性Sprague-Dawley大鼠的药代动力学（PK）谱。表8总结了关键po和静脉给药PK参数。单次静脉给药1 mg/kg化合物NP19后，NP19的半衰期（t1/2）为1.5±0.5 h，清除率（CL）为0.9±0.2 L/h/kg，表观分布体积（Vss）为2.1±0.5 L/kg。NP19口服给药剂量为10 mg/kg时，观察到NP19的口服吸收（Tmax = 0.6±0.2 h）、长半衰期（t1/2 = 10.9±7.7 h）和口服生物利用度（F = 5%）。此外，在大鼠中未观察到明显的不良反应。NP19经口服灌胃后的半衰期（10.9 h）比静脉注射的半衰期（1.5 h）长得多；这可能是由于NP19的高亲脂性（logP = 7.9）或水溶性差。结果，NP19表现出翻转式药代动力学。这种翻转式的药代动力学有时会发生在水溶性较差的化合物中，如利巴米胺（43），由于水溶性较差（7.6 μg/mL），其t1/2 (p.o)/t1/2 （i.v）比为13.5。另一个例子是李建明等（44）报道的亲脂化合物IAT（一种水溶性为19 μg/mL的抗微管蛋白剂），其t1/2 (p.o.)/t1/2 （i.v.）的比值为~ 5，类似于NP19 [t1/2 (p.o.)/t1/2 (i.v.) = 7.1]。由于化合物NP19的口服生物利用度较低，我们推测需要高剂量才能提供足够的药物浓度以显示抗肿瘤功效。因此，我们进一步研究了化合物NP19的体内活性。

体外PD-1/PD-L1结合试验[3]
利用PD-1/PD-L1均质时间分辨荧光（HTRF）结合实验研究了化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。PD-1/PD-L1结合检测试剂盒购自Cisbio。实验按照说明书进行，说明书可从https://www.cisbio.com/usa/drug-discovery/human-pd1pd-l1-biochemical-interaction-assay下载。

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BMS 最近公开了第一个针对 PD-1/PD-L1 通路的非肽类小分子抑制剂，该抑制剂在均相时间分辨荧光 (HTRF) 结合测定中显示出活性；但没有提供支持其活动的进一步数据。

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核磁共振测量[2]
在以15NH4Cl为唯一氮源的M9最小培养基中表达蛋白，获得均匀的15N标记。对于核磁共振测量，缓冲液通过凝胶过滤交换到pH为7.4 （PD-L1）的PBS或含有100 mM NaCl pH为6.4 （PD-1）的25 mM磷酸钠。在样品中加入10% （v/v）的D2O来提供锁定信号。所有光谱在300K下使用Bruker Avance III 600 MHz光谱仪记录。化合物与PD-L1的相互作用通过监测1h - 15n2d HMQC中核磁共振化学位移的扰动来评估。测试化合物解离PD-L1/PD-1的能力使用拮抗剂诱导解离试验进行评估。简而言之，15n标记的PD-1 （0.2 mM）与未标记的PD-L1稍微过滴定。这些化合物被合并到所得到的混合物中。实验过程中，h - 15n信号由HMQC监测。

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PD1/PD-L1检查点试验[2]
检测前24小时，将aAPCs以每孔10 000个的密度在培养基中接种于96孔白色板中。在检测当天，在含有1% FBS的RPMI 1640中制备3.5倍连续稀释的抗体。在DMSO中制备了一系列BMS化合物[BMS-1001]，并在含有1% FBS的RPMI 1640中配制。通过这种方法，所有样品中DMSO的浓度保持不变。从孔中取出95 μl的培养基，用40 μl的复合稀释液覆盖细胞。在含有1% FBS的40 μl RPMI 1640溶液中，每孔加入2万个ECs。37℃孵育6 h后，室温平衡10 min，每孔加入80 μl Bio-Glo试剂。孵育10分钟后，用FlexStation 3定量荧光。用Hill方程拟合实验数据，确定了一半最大有效浓度（EC50）和最大发光值（RLUmax）。

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PD-1/ pd - l1效应试验[2]
为了评估BMS对可溶性PD-L1抑制T细胞的影响，在重组人PD-L1存在的情况下，用抗cd3抗体刺激ECs。为此，用5 μg/ml的抗cd3抗体或PBS中的同型对照液在96孔白色平底板上涂覆过夜，温度为4℃。除去抗体溶液，用PBS洗涤3次并干燥。将sPD-L1 （aa 18-134）在PBS中稀释，PBS中加入青霉素/链霉素溶液（每个溶液的终浓度为100 U/ml），存在BMS化合物[BMS-1001]或相应体积的DMSO。然后在抗体包被板的每孔中加入15 μl的溶液。ECs离心后稀释至5万/ ml，每孔加入细胞液60 μl。sPD-L1终浓度为10 μg/ml （0.6 μM）。BMS化合物[BMS-1001]的最终浓度分别为：0.12、0.3、1.2和3 μM，得到BMS:sPD-L1的摩尔比分别为1:5、1:2、2:1和5:1。细胞培养24小时，根据制造商的说明，使用Bio-Glo荧光素酶测定系统进行荧光素酶活性测定。

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使用基于核磁共振的拮抗剂诱导解离实验评估BMS-1001破坏PD-1/PD-L1相互作用的能力。简而言之，将¹⁵N标记的PD-1与未标记的PD-L1轻微过滴定以形成复合物。向混合物中加入BMS-1001，并通过¹H-¹⁵N HMQC NMR监测。复合物的解离通过PD-1的尖锐¹H-¹⁵N信号的恢复来可视化，这些信号因复合物形成而变宽。[2]
使用直接NMR滴定评估BMS-1001与PD-L1的相互作用。用该化合物滴定均匀¹⁵N标记的PD-L1，监测¹H-¹⁵N HMQC谱中的化学位移变化和谱线增宽，以确认结合并表明化合物诱导的分子量增加（二聚化）。[2]

细胞系[2]
为了验证BMS化合物[BMS-1001]抑制PD-1/PD-L1相互作用的效力，使用了基于细胞的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断模型。在实验中，使用了两种模型细胞系：人工抗原呈递细胞（PD-L1+ aAPC/CHO-K1细胞，称为aAPCs）过表达TCR配体和PD-L1， T细胞替代品，一种经过修饰的过表达PD-1的Jurkat T细胞系，在NFAT启动子（PD-1效应细胞，称为ECs）的控制下携带荧光素酶报告细胞。从Promega中获得细胞，在添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养。此外，细胞在持续存在的潮霉素B （50 μg/ml）和G418 （250 μg/ml）中繁殖，以提供引入的遗传构建物的稳定表达。后两种抗生素在实验中被省略。流式细胞术证实了ECs上PD-1和aAPCs上PD-L1的过表达（未示出），通过监测抗cd3抗体刺激后的荧光素酶活性证实了荧光素酶表达基因的存在。抗生素选择、流式细胞术和报告基因表达作为细胞系鉴定方法。使用基于pcr的方法对细胞进行周期性检测，发现支原体污染呈阴性。

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细胞毒性试验[2]
将5 000个ECs接种在透明96孔板上，在BMS化合物[BMS-1001]浓度增加或DMSO作为对照（所有样品中DMSO浓度保持不变）的条件下培养48 h。处理后，根据制造商的说明，使用Biolog氧化还原染料混合MB进行代谢活性测试。

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流式细胞术测定[2]
流式细胞术检测sPD-L1 （aa 18-134）与ECs的结合情况。将his标记的PD-L1蛋白或其突变体用NTA-Atto 647 N荧光染料在22°C下以8:1的摩尔比（蛋白：染料）染色2小时。将PD-L1-Atto与所测化合物或抗体在150 μl PBS中配制。样品在4°C黑暗中孵育30分钟。同时，将ECs离心，PBS洗涤，并以1 × 106个细胞/ml的浓度悬浮在新鲜PBS中，每个样品中加入50 μl ECs，冰孵育60 min，最终成分浓度为：PD-L1 (1.5 μM) 25 μg/ml，抗PD-L1抗体和对照抗体125 μg/ml， BMS化合物1 μM [BMS-1001]。使用BD FACS Verse流式细胞仪和BD FACSuite v1.0.6软件对样本进行分析。

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细胞毒性实验： 将改造的Jurkat T细胞（PD-1效应细胞，ECs）接种于96孔板中，用递增浓度的BMS-1001或DMSO对照处理48小时。然后使用氧化还原染料混合物测量代谢活性，以确定细胞活力并计算EC₅₀值。BMS-1001显示出低毒性，EC₅₀为33.4 µM。[2]
PD-1/PD-L1检查点实验： 将人工抗原呈递细胞（aAPCs，表达TCR配体和PD-L1的CHO-K1细胞）接种于白色96孔板中。将BMS-1001在DMSO中进行系列稀释，并用含1% FBS的RPMI培养基配制，保持DMSO浓度恒定。将PD-1效应细胞（ECs，表达PD-1和NFAT驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞）加入含有化合物稀释液的aAPCs中。在37°C共培养6小时后，使用荧光素酶检测试剂测量发光强度。发光表明从PD-1/PD-L1抑制中释放的TCR介导的激活。[2]
PD-1/sPD-L1效应细胞实验： 将96孔板在4°C用抗CD3抗体包被过夜。将可溶性PD-L1 (sPD-L1) 与BMS-1001或DMSO在含有青霉素/链霉素的PBS中预孵育。将此混合物加入抗体包被的孔中。然后加入PD-1效应细胞（ECs）。培养24小时后，测量荧光素酶活性以评估T细胞激活。测试的BMS-1001最终浓度为0.12、0.3、1.2和3 µM，对应的BMS-1001与sPD-L1的摩尔比为1:5、1:2、2:1和5:1。[2]
流式细胞术结合实验： 将His标签的可溶性PD-L1用荧光NTA染料标记。将标记的PD-L1与BMS-1001、对照抗体或DMSO在PBS中预孵育。然后将表达PD-1的Jurkat细胞（ECs）加入混合物中并在冰上孵育。孵育后，通过流式细胞术分析细胞以测量荧光强度，指示sPD-L1与细胞表面PD-1的结合水平。[2]

雄性Sprague-Dawley大鼠药代动力学研究[3]
本研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠（200-220 g）研究化合物NP19（BMS-1001类似物）的药代动力学。实验前12小时禁食，但可自由饮水。分别于口服（10 mg/kg）或静脉注射（1 mg/kg）化合物NP19后0.0833、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12和24小时，从尾静脉采集血样（0.3 mL）至肝素化1.5 mL聚乙烯管中。该化合物溶于 5% DMSO 和 95% PEG-300 的混合溶液中用于静脉注射，或悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 溶液中用于口服。样品立即以 3000 g 离心 10 分钟。所得血浆 (100 μL) 储存于 -20 °C 直至分析。使用 DAS（药物与统计）软件，通过非房室模型分析，根据个体动物数据确定药代动力学 (PK) 参数。PK 研究的仪器和分析条件：使用配备电喷雾电离 (ESI) 接口的 ACQUITY I-Class UPLC 和 XEVO TQD 三重四极杆质谱仪（Waters 公司，美国马萨诸塞州米尔福德）的 UPLC-MS/MS 系统分析血液样本。UPLC 系统由二元溶剂管理器 (BSM) 和带流通针的样品管理器 (SM-FTN) 组成。使用 Masslynx 4.1 软件（Waters 公司）进行数据采集和仪器控制。采用多反应监测 (MRM) 模式，NP19 的 m/z 555.35 → 181.03 和卡马西平的 m/z 237 → 194.1 进行定量分析。

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小鼠 B16F10 黑色素瘤模型体内疗效研究[3]
使用 6-8 周龄的 BALB/c 小鼠研究 NP19（BMS-1001 的类似物）对皮下移植黑色素瘤细胞模型的抑制作用。将处于对数生长期的小鼠 B16F10 黑色素瘤细胞悬浮于 PBS 中，浓度为 2 × 10⁶ 个/mL。每只小鼠皮下接种 200 μL 含有 4 × 10⁵ 个细胞的细胞悬液。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为四组（n = 10），分别给予NP19（25、50、100 mg/kg）和溶剂对照。药物通过灌胃法每日一次给药，持续15天。溶剂对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）。在整个实验期间监测动物的活动和体重，以评估急性毒性。治疗开始16天后处死小鼠，收集肿瘤组织和主要器官（肝脏、脾脏、胸腺和肾脏）样本。收集的肿瘤组织和器官（肝脏、肾脏）用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，苏木精-伊红（H&E）染色，并在显微镜下观察。肿瘤生长抑制值 (TGI) 的计算公式为：TGI(%) = [1 – Wt/Wv] × 100%，其中 Wt 和 Wv 分别为治疗组和载体对照组的平均肿瘤重量。

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小鼠 H22 肝癌模型体内疗效研究[3]
使用 6-8 周龄雄性 BALB/c 小鼠。根据肿瘤移植研究方案，将 8 × 10⁵ 个 H22 细胞接种到每只小鼠的右侧腹部。NP19（BMS-1001 的类似物）溶解于 5% DMSO、40% PEG-200 和 55% 生理盐水中，配制成所需浓度。对照组小鼠腹腔注射 200 μL 载体溶液。每隔2天使用可溯源的电子数显卡尺测量肿瘤体积，并使用公式a × b² × 0.5计算，其中a和b分别代表肿瘤的长径和短径。治疗结束后处死小鼠，切除肿瘤并称重。

BMS-1001在基于细胞的试验中显示出较低的非特异性毒性。代谢活性测定结果显示，经48小时处理后，BMS-1001对修饰的Jurkat T细胞（PD-1效应细胞）的细胞毒性EC₅₀为33.4 µM。[2]

[1]. Small-Molecule Inhibitors of the Programmed Cell Death-1/Programmed Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) Interaction via Transiently Induced Protein States and Dimerization of PD-L1. J Med Chem. 2017 Jul 13;60(13):5857-5867.

[2]. Small-molecule inhibitors of PD-1/PD-L1 immune checkpoint alleviate the PD-L1-induced exhaustion of T-cells. Oncotarget. 2017 Aug 7;8(42):72167-72181.

[3]. Discovery of Novel Resorcinol Dibenzyl Ethers Targeting the Programmed Cell Death-1/Programmed Cell Death-Ligand 1 Interaction as Potential Anticancer Agents. J Med Chem. 2020 Aug 13;63(15):8338-8358.

近年来，靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的抗体在抗癌治疗中取得了显著成功。然而，目前尚未有具有细胞活性的小分子药物被报道。本文提供的证据表明，小分子药物能够缓解PD-1/PD-L1免疫检查点介导的Jurkat T淋巴细胞耗竭。由百时美施贵宝公司开发的两种优化的小分子PD-1/PD-L1相互作用抑制剂BMS-1001和BMS-1166，在分离的蛋白质上进行测试时，能够与人PD-L1结合并阻断其与PD-1的相互作用。这些化合物对所测试的细胞系毒性较低，并且能够阻断可溶性PD-L1与细胞表面表达的PD-1的相互作用。因此，BMS-1001 和 BMS-1166 可减轻可溶性 PD-L1 对 T 细胞受体介导的 T 淋巴细胞活化的抑制作用。此外，这些化合物还能有效减弱细胞表面相关 PD-L1 的抑制作用。我们还解析了 BMS-1001 和 BMS-1166 与 PD-L1 复合物的 X 射线晶体结构，揭示了这些化合物相比其前体化合物效力增强的可能原因。进一步的研究有望开发出基于口服免疫检查点抑制剂的抗癌疗法。[1]

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使用单克隆抗体阻断 PD-1/PD-L1 免疫检查点通路已在癌症治疗领域取得了显著进展。然而，基于抗体的免疫疗法也存在一些缺点，例如抗体成本高昂、半衰期有限以及免疫原性。由于该通路结构信息不完整，开发能够克服这些缺陷的小分子PD-1/PD-L1抑制剂进展缓慢。百时美施贵宝公司近期公布了首批化学合成的PD-1/PD-L1抑制剂。本文介绍了这两类抑制剂的核磁共振和X射线晶体结构表征。PD-L1/抑制剂复合物的X射线晶体结构显示，一个抑制剂分子位于PD-L1同源二聚体的中心，填充在两个PD-L1分子之间一个深的疏水通道状口袋中。 (2-甲基-3-联苯基)甲醇衍生物的结构在通道的一侧被封堵，而基于[3-(2,3-二氢-1,4-苯并二恶英-6-基)-2-甲基苯基]甲醇的化合物则诱导扩大的相互作用界面，从而在PD-L1二聚体中形成开放的“面背式”隧道。[2]

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BMS-1001是由百时美施贵宝公司开发的一种PD-1/PD-L1免疫检查点小分子抑制剂。它属于一类旨在阻断PD-1和PD-L1相互作用从而恢复T细胞功能的化合物。[2]
BMS-1001与人PD-L1的Ig样V型结构域复合物的晶体结构已在2.01 Å分辨率下解析。该化合物结合于PD-L1二聚体界面处的隧道中，诱导构象变化，包括Tyr56侧链的旋转。(2R)-2-氨基-3-羟基丙酸部分与Asp122形成氢键，而3-氰基苄基取代基与Tyr123和Arg125形成疏水相互作用。[2]
BMS-1001诱导溶液中PD-L1的二聚化，这种机制被认为通过占据两个亚基上的PD-1结合位点而发挥其抑制作用。[2]
尽管已证实该化合物具有恢复T细胞活化的活性，但其效力低于治疗性抗PD-1/PD-L1抗体。[2]

C35H35CLN2O7

631.1146

630.21327

C, 66.61; H, 5.59; Cl, 5.62; N, 4.44; O, 17.75

2113650-04-5

2113650-03-4;2113650-04-5 (HCl);

145925650

White to off-white solid powder

130Ų

4

9

12

45

957

1

Cl[H].O(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C(C2C([H])=C([H])C3=C(C=2[H])OC([H])([H])C([H])([H])O3)C=1C([H])([H])[H])C1=C([H])C(=C(C([H])=C1C([H])([H])[H])C([H])([H])N([H])[C@@]([H])(C(=O)O[H])C([H])([H])O[H])OC([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C(C#N)C=1[H]

(2-((3-Cyanobenzyl)oxy)-4-((3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-2-methylbenzyl)oxy)-5-methylbenzyl)-D-serine hydrochloride

VKDUZONDVBDCAX-VNUFCWELSA-N SMILES

BMS-1001 HCl BMS 1001 HCl BMS1001 HCl BMS-1001 hydrochloride BMS 1001 hydrochloride BMS1001 hydrochloride

BMS-1001 HCl; BMS 1001 HCl; BMS1001 HCl; 2113650-04-5; BMS-1001 hydrochloride; BMS-1001 (hydrochloride); BMS-1001 HCl; (2-((3-Cyanobenzyl)oxy)-4-((3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-2-methylbenzyl)oxy)-5-methylbenzyl)-D-serine hydrochloride; (2R)-2-[[2-[(3-cyanophenyl)methoxy]-4-[[3-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methylphenyl]methoxy]-5-methylphenyl]methylamino]-3-hydroxypropanoic acid;hydrochloride; (2R)-2-[({2-[(3-cyanophenyl)methoxy]-4-{[3-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methylphenyl]methoxy}-5-methylphenyl}methyl)amino]-3-hydroxypropanoic acid hydrochloride; N-[[2-[(3-cyanophenyl)methoxy]-4-[[3-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methylphenyl]methoxy]-5-methylphenyl]methyl]-D-serine, monohydrochloride; BMS-1001 hydrochloride; BMS 1001 hydrochloride; BMS1001 hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~12.5 mg/mL (~19.81 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (1.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (1.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。