PD-1/PD-L1 interaction
Human programmed death-ligand 1 (PD-L1) (blocks PD-1/PD-L1 interaction)[2]

BMS-1001 将自身附着在人类 PD-L1 上并阻止其与 PD-1 相互作用。 BMS-1001 对所检查的细胞系表现出最小的毒性，并抑制可溶性 PD-L1 和细胞表面表达的 PD-1 之间的通讯。 BMS-1001 可减弱可溶性 PD-L1 对 T 细胞受体介导的 T 淋巴细胞活化的抑制作用 [1]。

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BMS-1001 与人源PD-L1结合，并阻断其与PD-1的相互作用，这通过基于核磁共振的拮抗剂诱导解离实验证实。它能减轻可溶性及膜结合PD-L1对Jurkat T细胞（PD-1效应细胞）T细胞受体介导的激活的抑制作用。在使用PD-1效应细胞与表达PD-L1的人工抗原呈递细胞共培养的PD-1/PD-L1检查点实验中，BMS-1001 剂量依赖性地诱导荧光素酶活性，证明其在细胞界面拮抗PD-1/PD-L1检查点的能力，但其效力和最大激活水平低于治疗性抗体。[2]
BMS-1001 剂量依赖性地消除了可溶性PD-L1 (sPD-L1) 对T细胞激活的抑制作用。在相对于sPD-L1为2倍和5倍摩尔过量的浓度下，它能将细胞激活完全恢复到仅使用抗CD3抗体观察到的水平。[2]
流式细胞术分析表明，将荧光标记的sPD-L1与BMS-1001 预孵育可显著降低其与表达PD-1的Jurkat细胞的结合，表明其在细胞表面干扰了PD-1/PD-L1相互作用。[2]
BMS-1001 在溶液中诱导可溶性PD-L1形成二聚体，这通过NMR滴定（谱线增宽）、尺寸排阻色谱（保留时间偏移）和交联实验（SDS-PAGE显示二聚体条带）证实。[2]

NP19 [[BMS-1001类似物]]在H22肝癌小鼠模型中的体内抗肿瘤活性[3]
鉴于NP19在黑色素瘤B16-F10肿瘤模型中具有良好的体内抗肿瘤效果，且PD-1/PD-L1抑制剂具有广谱的抗肿瘤活性，我们进一步利用H22肝癌模型BALB/c小鼠对复方NP19的体内抗肿瘤效果进行了评价。每只小鼠右侧皮下注射80万个H22细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时，随机选取小鼠，通过腹腔注射NP19或载体溶液治疗14天。如图8所示，NP19在25 mg/kg剂量下具有显著的体内抗肿瘤功效，TGI为76.5%（图8A， 8B, 8C）。此外，NP19没有引起明显的体重减轻（图8D），表明该化合物耐受性良好。

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NP19 [[BMS-1001类似物]]在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中的体内抗肿瘤活性[3]
为了确定新合成化合物的体外抗pd -1/PD-L1活性是否可以转化为体内功效，我们在小鼠黑色素瘤B16-F10肿瘤模型上测试了化合物NP19的抗肿瘤活性。选择NP19进行体内疗效研究，是因为与更有效的化合物NP2或同样有效的化合物NP12相比，NP19易于合成且细胞毒性较小（表9）。我们将携带黑色素瘤的BALB/c小鼠分别以载药对照和NP19 （25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）灌胃治疗，每天1次，持续15天。如图6所示，治疗15天后，NP19治疗显著抑制了黑色素瘤的生长。

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NP19的体内药代动力学性质[[BMS-10016的类似物]][3]
由于化合物NP19在体外表现出较高的药效，接下来通过静脉注射和口服给药来评估雄性Sprague-Dawley大鼠的药代动力学（PK）谱。表8总结了关键po和静脉给药PK参数。单次静脉给药1 mg/kg化合物NP19后，NP19的半衰期（t1/2）为1.5±0.5 h，清除率（CL）为0.9±0.2 L/h/kg，表观分布体积（Vss）为2.1±0.5 L/kg。NP19口服给药剂量为10 mg/kg时，观察到NP19的口服吸收（Tmax = 0.6±0.2 h）、长半衰期（t1/2 = 10.9±7.7 h）和口服生物利用度（F = 5%）。此外，在大鼠中未观察到明显的不良反应。NP19经口服灌胃后的半衰期（10.9 h）比静脉注射的半衰期（1.5 h）长得多；这可能是由于NP19的高亲脂性（logP = 7.9）或水溶性差。结果，NP19表现出翻转式药代动力学。这种翻转式的药代动力学有时会发生在水溶性较差的化合物中，如利巴米胺（43），由于水溶性较差（7.6 μg/mL），其t1/2 (p.o)/t1/2 （i.v）比为13.5。另一个例子是李建明等（44）报道的亲脂化合物IAT（一种水溶性为19 μg/mL的抗微管蛋白剂），其t1/2 (p.o.)/t1/2 （i.v.）的比值为~ 5，类似于NP19 [t1/2 (p.o.)/t1/2 (i.v.) = 7.1]。由于化合物NP19的口服生物利用度较低，我们推测需要高剂量才能提供足够的药物浓度以显示抗肿瘤功效。因此，我们进一步研究了化合物NP19的体内活性。

体外PD-1/PD-L1结合试验[3]
利用PD-1/PD-L1均质时间分辨荧光（HTRF）结合实验研究了化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。PD-1/PD-L1结合检测试剂盒购自Cisbio。实验按照说明书进行，说明书可从https://www.cisbio.com/usa/drug-discovery/human-pd1pd-l1-biochemical-interaction-assay下载。

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BMS 最近公开了第一个针对 PD-1/PD-L1 通路的非肽类小分子抑制剂，该抑制剂在均相时间分辨荧光 (HTRF) 结合测定中显示出活性；但没有提供支持其活动的进一步数据。

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核磁共振测量[2]
在以15NH4Cl为唯一氮源的M9最小培养基中表达蛋白，获得均匀的15N标记。对于核磁共振测量，缓冲液通过凝胶过滤交换到pH为7.4 （PD-L1）的PBS或含有100 mM NaCl pH为6.4 （PD-1）的25 mM磷酸钠。在样品中加入10% （v/v）的D2O来提供锁定信号。所有光谱在300K下使用Bruker Avance III 600 MHz光谱仪记录。化合物与PD-L1的相互作用通过监测1h - 15n2d HMQC中核磁共振化学位移的扰动来评估。测试化合物解离PD-L1/PD-1的能力使用拮抗剂诱导解离试验进行评估。简而言之，15n标记的PD-1 （0.2 mM）与未标记的PD-L1稍微过滴定。这些化合物被合并到所得到的混合物中。实验过程中，h - 15n信号由HMQC监测。

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PD1/PD-L1检查点试验[2]
检测前24小时，将aAPCs以每孔10 000个的密度在培养基中接种于96孔白色板中。在检测当天，在含有1% FBS的RPMI 1640中制备3.5倍连续稀释的抗体。在DMSO中制备了一系列BMS化合物[BMS-1001]，并在含有1% FBS的RPMI 1640中配制。通过这种方法，所有样品中DMSO的浓度保持不变。从孔中取出95 μl的培养基，用40 μl的复合稀释液覆盖细胞。在含有1% FBS的40 μl RPMI 1640溶液中，每孔加入2万个ECs。37℃孵育6 h后，室温平衡10 min，每孔加入80 μl Bio-Glo试剂。孵育10分钟后，用FlexStation 3定量荧光。用Hill方程拟合实验数据，确定了一半最大有效浓度（EC50）和最大发光值（RLUmax）。

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PD-1/ pd - l1效应试验[2]
为了评估BMS对可溶性PD-L1抑制T细胞的影响，在重组人PD-L1存在的情况下，用抗cd3抗体刺激ECs。为此，用5 μg/ml的抗cd3抗体或PBS中的同型对照液在96孔白色平底板上涂覆过夜，温度为4℃。除去抗体溶液，用PBS洗涤3次并干燥。将sPD-L1 （aa 18-134）在PBS中稀释，PBS中加入青霉素/链霉素溶液（每个溶液的终浓度为100 U/ml），存在BMS化合物[BMS-1001]或相应体积的DMSO。然后在抗体包被板的每孔中加入15 μl的溶液。ECs离心后稀释至5万/ ml，每孔加入细胞液60 μl。sPD-L1终浓度为10 μg/ml （0.6 μM）。BMS化合物[BMS-1001]的最终浓度分别为：0.12、0.3、1.2和3 μM，得到BMS:sPD-L1的摩尔比分别为1:5、1:2、2:1和5:1。细胞培养24小时，根据制造商的说明，使用Bio-Glo荧光素酶测定系统进行荧光素酶活性测定。

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使用基于核磁共振的拮抗剂诱导解离实验评估BMS-1001破坏PD-1/PD-L1相互作用的能力。简而言之，将¹⁵N标记的PD-1与未标记的PD-L1轻微过滴定以形成复合物。向混合物中加入BMS-1001，并通过¹H-¹⁵N HMQC NMR监测。复合物的解离通过PD-1的尖锐¹H-¹⁵N信号的恢复来可视化，这些信号因复合物形成而变宽。[2]
使用直接NMR滴定评估BMS-1001与PD-L1的相互作用。用该化合物滴定均匀¹⁵N标记的PD-L1，监测¹H-¹⁵N HMQC谱中的化学位移变化和谱线增宽，以确认结合并表明化合物诱导的分子量增加（二聚化）。[2]

细胞系[2]
为了验证BMS化合物[BMS-1001]抑制PD-1/PD-L1相互作用的效力，使用了基于细胞的PD-1/PD-L1免疫检查点阻断模型。在实验中，使用了两种模型细胞系：人工抗原呈递细胞（PD-L1+ aAPC/CHO-K1细胞，称为aAPCs）过表达TCR配体和PD-L1， T细胞替代品，一种经过修饰的过表达PD-1的Jurkat T细胞系，在NFAT启动子（PD-1效应细胞，称为ECs）的控制下携带荧光素酶报告细胞。从Promega中获得细胞，在添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养。此外，细胞在持续存在的潮霉素B （50 μg/ml）和G418 （250 μg/ml）中繁殖，以提供引入的遗传构建物的稳定表达。后两种抗生素在实验中被省略。流式细胞术证实了ECs上PD-1和aAPCs上PD-L1的过表达（未示出），通过监测抗cd3抗体刺激后的荧光素酶活性证实了荧光素酶表达基因的存在。抗生素选择、流式细胞术和报告基因表达作为细胞系鉴定方法。使用基于pcr的方法对细胞进行周期性检测，发现支原体污染呈阴性。

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细胞毒性试验[2]
将5 000个ECs接种在透明96孔板上，在BMS化合物[BMS-1001]浓度增加或DMSO作为对照（所有样品中DMSO浓度保持不变）的条件下培养48 h。处理后，根据制造商的说明，使用Biolog氧化还原染料混合MB进行代谢活性测试。

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流式细胞术测定[2]
流式细胞术检测sPD-L1 （aa 18-134）与ECs的结合情况。将his标记的PD-L1蛋白或其突变体用NTA-Atto 647 N荧光染料在22°C下以8:1的摩尔比（蛋白：染料）染色2小时。将PD-L1-Atto与所测化合物或抗体在150 μl PBS中配制。样品在4°C黑暗中孵育30分钟。同时，将ECs离心，PBS洗涤，并以1 × 106个细胞/ml的浓度悬浮在新鲜PBS中，每个样品中加入50 μl ECs，冰孵育60 min，最终成分浓度为：PD-L1 (1.5 μM) 25 μg/ml，抗PD-L1抗体和对照抗体125 μg/ml， BMS化合物1 μM [BMS-1001]。使用BD FACS Verse流式细胞仪和BD FACSuite v1.0.6软件对样本进行分析。

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细胞毒性实验： 将改造的Jurkat T细胞（PD-1效应细胞，ECs）接种于96孔板中，用递增浓度的BMS-1001或DMSO对照处理48小时。然后使用氧化还原染料混合物测量代谢活性，以确定细胞活力并计算EC₅₀值。BMS-1001显示出低毒性，EC₅₀为33.4 µM。[2]
PD-1/PD-L1检查点实验： 将人工抗原呈递细胞（aAPCs，表达TCR配体和PD-L1的CHO-K1细胞）接种于白色96孔板中。将BMS-1001在DMSO中进行系列稀释，并用含1% FBS的RPMI培养基配制，保持DMSO浓度恒定。将PD-1效应细胞（ECs，表达PD-1和NFAT驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞）加入含有化合物稀释液的aAPCs中。在37°C共培养6小时后，使用荧光素酶检测试剂测量发光强度。发光表明从PD-1/PD-L1抑制中释放的TCR介导的激活。[2]
PD-1/sPD-L1效应细胞实验： 将96孔板在4°C用抗CD3抗体包被过夜。将可溶性PD-L1 (sPD-L1) 与BMS-1001或DMSO在含有青霉素/链霉素的PBS中预孵育。将此混合物加入抗体包被的孔中。然后加入PD-1效应细胞（ECs）。培养24小时后，测量荧光素酶活性以评估T细胞激活。测试的BMS-1001最终浓度为0.12、0.3、1.2和3 µM，对应的BMS-1001与sPD-L1的摩尔比为1:5、1:2、2:1和5:1。[2]
流式细胞术结合实验： 将His标签的可溶性PD-L1用荧光NTA染料标记。将标记的PD-L1与BMS-1001、对照抗体或DMSO在PBS中预孵育。然后将表达PD-1的Jurkat细胞（ECs）加入混合物中并在冰上孵育。孵育后，通过流式细胞术分析细胞以测量荧光强度，指示sPD-L1与细胞表面PD-1的结合水平。[2]

Pharmacokinetic Study in Male Sprague–Dawley Rats[3]
Male Sprague–Dawley rats (200–220 g) were used to study the pharmacokinetics of compound NP19 [an analog of BMS-1001]. Diet was prohibited for 12 h before the experiment, but water was freely available. Blood samples (0.3 mL) were collected from the tail vein into heparinized 1.5 mL polythene tubes at 0.0833, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, and 24 h after oral (10 mg/kg) or intravenous (1 mg/kg) administration of compound NP19. The compound was dissolved in 5% DMSO and 95% PEG-300 for intravenous administration or suspended in 0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) for oral administration. The samples were immediately centrifuged at 3000g for 10 min. The plasma as-obtained (100 μL) was stored at −20 °C until analysis. PK parameters were determined from individual animal data using noncompartmental analysis in DAS (Drug and statistics) software. Instruments and analytical conditions for PK studies: A UPLC-MS/MS system with ACQUITY I-Class UPLC and a XEVO TQD triple quadrupole mass spectrometer (Waters Corp., Milford, MA, USA), equipped with an electrospray ionization (ESI) interface, was used to analyze the blood samples. The UPLC system was comprised of a Binary Solvent Manager (BSM) and a Sample Manager with Flow-Through Needle (SM-FTN). Masslynx 4.1 software (Waters Corp.) was used for data acquisition and instrument control. Multiple reaction monitoring (MRM) modes of m/z 555.35 → 181.03 for NP19 and m/z 237 → 194.1 for carbamazepine were utilized to conduct quantitative analysis.

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In Vivo Efficacy Study in Mouse B16F10 Melanoma Model[3]
BALB/c mice, aged 6–8 weeks old, were used to study the inhibition effect of NP19 [an analog of BMS-1001]on subcutaneous transplanted model of melanoma cells. Murine B16F10 melanoma cells growing in a logarithmic growth phase were suspended in PBS at a density of 2 × 106 per mL. Each mouse was inoculated subcutaneously with 200 μL containing 4 × 105 cells. After tumors reached approximately 100 mm3 in volume, mice were divided into four groups randomly (n = 10) and treated with NP19 (25, 50, 100 mg/kg) and vehicle, respectively. The drugs were administered via intragastric gavage once a day for 15 days. The vehicle group was administered with 0.5% sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na). Animal activity and body weight were monitored during the entire experiment period to assess acute toxicity. Mice were sacrificed 16 days after the initiation of the treatment, and the tumor tissue and major organ (liver, spleen, thymus, and kidney) samples were collected. The harvested tumor tissue and organs (liver, kidney) were fixed in 4% paraformaldehyde, processed into paraffin routinely, stained with hematoxylin and eosin (H&E), and captured by microscope. Tumor growth inhibition value (TGI) was calculated using the formula: TGI(%) = [1 – Wt/Wv] × 100%, where Wt and Wv are the mean tumor weight of treatment group and vehicle control.

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In Vivo Efficacy Study in Mouse H22 Hepatoma Tumor Model[3]
6–8 weeks old male BALB/c mice were used. A total of 8 × 105 H22 cells were inoculated into the right flank of each mouse according to protocols of tumor transplant research. NP19 [an analog of BMS-1001]was dissolved in 5% DMSO, 40% PEG-200 and 55% saline solution to produce desired concentrations. Mice in control groups were injected intraperitoneally with 200 μL of vehicle solution only. Tumor volume was measured every 2 days with a traceable electronic digital caliper and calculated using the formula a × b2 × 0.5, where a and b represented the larger and smaller diameters, respectively. The mice were sacrificed after the treatments and tumors were excised and weighed.

BMS-1001在基于细胞的试验中显示出较低的非特异性毒性。代谢活性测定结果显示，经48小时处理后，BMS-1001对修饰的Jurkat T细胞（PD-1效应细胞）的细胞毒性EC₅₀为33.4 µM。[2]

[1]. Small-Molecule Inhibitors of the Programmed Cell Death-1/Programmed Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) Interaction via Transiently Induced Protein States and Dimerization of PD-L1. J Med Chem. 2017 Jul 13;60(13):5857-5867.

[2]. Small-molecule inhibitors of PD-1/PD-L1 immune checkpoint alleviate the PD-L1-induced exhaustion of T-cells. Oncotarget. 2017 Aug 7;8(42):72167-72181.

[3]. Discovery of Novel Resorcinol Dibenzyl Ethers Targeting the Programmed Cell Death-1/Programmed Cell Death-Ligand 1 Interaction as Potential Anticancer Agents. J Med Chem. 2020 Aug 13;63(15):8338-8358.

近年来，靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的抗体在抗癌治疗中取得了显著成功。然而，目前尚未有具有细胞活性的小分子药物被报道。本文提供的证据表明，小分子药物能够缓解PD-1/PD-L1免疫检查点介导的Jurkat T淋巴细胞耗竭。由百时美施贵宝公司开发的两种优化的小分子PD-1/PD-L1相互作用抑制剂BMS-1001和BMS-1166，在分离的蛋白质上进行测试时，能够与人PD-L1结合并阻断其与PD-1的相互作用。这些化合物对所测试的细胞系毒性较低，并且能够阻断可溶性PD-L1与细胞表面表达的PD-1的相互作用。因此，BMS-1001 和 BMS-1166 可减轻可溶性 PD-L1 对 T 细胞受体介导的 T 淋巴细胞活化的抑制作用。此外，这些化合物还能有效减弱细胞表面相关 PD-L1 的抑制作用。我们还解析了 BMS-1001 和 BMS-1166 与 PD-L1 复合物的 X 射线晶体结构，揭示了这些化合物相比其前体化合物效力增强的可能原因。进一步的研究有望开发出基于口服免疫检查点抑制剂的抗癌疗法。[1]

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使用单克隆抗体阻断 PD-1/PD-L1 免疫检查点通路已在癌症治疗领域取得了显著进展。然而，基于抗体的免疫疗法也存在一些缺点，例如抗体成本高昂、半衰期有限以及免疫原性。由于该通路结构信息不完整，开发能够克服这些缺陷的小分子PD-1/PD-L1抑制剂进展缓慢。百时美施贵宝公司近期公布了首批化学合成的PD-1/PD-L1抑制剂。本文介绍了这两类抑制剂的核磁共振和X射线晶体结构表征。PD-L1/抑制剂复合物的X射线晶体结构显示，一个抑制剂分子位于PD-L1同源二聚体的中心，填充在两个PD-L1分子之间一个深的疏水通道状口袋中。 (2-甲基-3-联苯基)甲醇衍生物的结构在通道的一侧被封堵，而基于[3-(2,3-二氢-1,4-苯并二恶英-6-基)-2-甲基苯基]甲醇的化合物则诱导扩大的相互作用界面，从而在PD-L1二聚体中形成开放的“面背式”隧道。[2]

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BMS-1001是由百时美施贵宝公司开发的一种PD-1/PD-L1免疫检查点小分子抑制剂。它属于一类旨在阻断PD-1和PD-L1相互作用从而恢复T细胞功能的化合物。[2]
BMS-1001与人PD-L1的Ig样V型结构域复合物的晶体结构已在2.01 Å分辨率下解析。该化合物结合于PD-L1二聚体界面处的隧道中，诱导构象变化，包括Tyr56侧链的旋转。(2R)-2-氨基-3-羟基丙酸部分与Asp122形成氢键，而3-氰基苄基取代基与Tyr123和Arg125形成疏水相互作用。[2]
BMS-1001诱导溶液中PD-L1的二聚化，这种机制被认为通过占据两个亚基上的PD-1结合位点而发挥其抑制作用。[2]
尽管已证实该化合物具有恢复T细胞活化的活性，但其效力低于治疗性抗PD-1/PD-L1抗体。[2]

C35H35CLN2O7

631.1146

630.21327

C, 66.61; H, 5.59; Cl, 5.62; N, 4.44; O, 17.75

2113650-04-5

2113650-03-4;2113650-04-5 (HCl);

145925650

White to off-white solid powder

130Ų

4

9

12

45

957

1

Cl[H].O(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C(C2C([H])=C([H])C3=C(C=2[H])OC([H])([H])C([H])([H])O3)C=1C([H])([H])[H])C1=C([H])C(=C(C([H])=C1C([H])([H])[H])C([H])([H])N([H])[C@@]([H])(C(=O)O[H])C([H])([H])O[H])OC([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C(C#N)C=1[H]

(2-((3-Cyanobenzyl)oxy)-4-((3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-2-methylbenzyl)oxy)-5-methylbenzyl)-D-serine hydrochloride

VKDUZONDVBDCAX-VNUFCWELSA-N SMILES

BMS-1001 HCl BMS 1001 HCl BMS1001 HCl BMS-1001 hydrochloride BMS 1001 hydrochloride BMS1001 hydrochloride

BMS-1001 HCl; BMS 1001 HCl; BMS1001 HCl; 2113650-04-5; BMS-1001 hydrochloride; BMS-1001 (hydrochloride); BMS-1001 HCl; (2-((3-Cyanobenzyl)oxy)-4-((3-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl)-2-methylbenzyl)oxy)-5-methylbenzyl)-D-serine hydrochloride; (2R)-2-[[2-[(3-cyanophenyl)methoxy]-4-[[3-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methylphenyl]methoxy]-5-methylphenyl]methylamino]-3-hydroxypropanoic acid;hydrochloride; (2R)-2-[({2-[(3-cyanophenyl)methoxy]-4-{[3-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methylphenyl]methoxy}-5-methylphenyl}methyl)amino]-3-hydroxypropanoic acid hydrochloride; N-[[2-[(3-cyanophenyl)methoxy]-4-[[3-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2-methylphenyl]methoxy]-5-methylphenyl]methyl]-D-serine, monohydrochloride; BMS-1001 hydrochloride; BMS 1001 hydrochloride; BMS1001 hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~12.5 mg/mL (~19.81 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (1.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (1.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。