Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) (IC50 = 1.1 nM)

当 SKOV-3 和 Jurkat 克隆 E6-1 细胞用林罗司他 (0.01-100 μM) 处理 72 小时时，活细胞的比例低于未处理的对照组。 linrodostat 的 IC50 为 6.3 μM，同样在低得多的浓度下也会导致细胞死亡[1]。

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为了支持临床试验，对BMS-986205进行了临床前评估。体外特征包括在IDO-1-HEK293细胞中有效抑制犬尿氨酸（kyn）的产生（IC50=1.1 nM），但在TDO-HEK293细胞中没有，在洗脱后基于IDO1细胞的测定中持续抑制，以及在人类耐受性MLR测定中的单位数nM效力。[2]

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Linrodostat表现出强大的细胞活性，抑制过表达人IDO1的HEK293细胞和用IFNγ刺激的HeLa细胞中犬尿氨酸的产生，但未检测到对色氨酸2,3-双加氧酶或小鼠吲哚胺2,3-双合氧酶2的活性。Linrodostat在T细胞和表达同种异体IDO1的树突状细胞的混合淋巴细胞反应中恢复了T细胞增殖[3]。

根据临床前数据，预计 150 mg QD 人体剂量可最大程度地抑制 IDO1。在正在进行的临床研究中，已有 42 名患者接受了治疗。除三项 3 级毒性（自身免疫性肝炎 [剂量限制；BMS-986205 100 mg/nivo 240 mg]、皮疹和无症状低磷血症）外，所有治疗相关不良事件均为 1/2 级。第 14 天，个体谷浓度开始超过从 25 mg QD 开始的人全血 IC50，以及从 50 mg QD 开始的 IC90；所有接受 200 mg QD 治疗的患者均超过了 IC90。所有剂量下血清 kyn 均显着降低（每个剂量平均降低 > 45%），100 和 200 mg QD 剂量下平均降低 > 60%。重要的是，在可评估的配对治疗前和治疗中样本中，瘤内 kyn 减少了 90%。

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人SKOV3异种移植物中Linrodostat PK/PD谱[3]
接下来，我们在小鼠异种移植物模型中使用SKOV3细胞评估了linrodostat的PK/PD特性。通过测量血清和肿瘤内犬尿氨酸水平来评估林罗多司坦的剂量依赖性PD活性，每天给药一次，剂量为5、25或125 mg/kg（补充表S1；PK报告为AUC0-24，μmol/L×h）。在5、25和125 mg/kg的剂量下，林罗达治疗的肿瘤中犬尿氨酸减少百分比的AUEC测量值分别为60%、63%和76%，表明肿瘤中存在剂量依赖性PD活性。在评估的时间点中，治疗后6小时观察到最大的PD效应（犬尿氨酸减少96%）（图4A）。在最后一次服用10mg/kg林罗司他和100mg/kg依帕卡多斯塔后24小时，犬尿氨酸水平保持降低（≥30%）。根据这些PK/PD分析，利诺司他在SKOV3肿瘤血清中的体内IC50中值为3.4 nmol/L，与人全血中的体外IC50中值9.4 nmol/L相似（图4B）。我们还检测了另一种IDO1抑制剂依帕卡多斯塔的效力，并检测到体内和体外的IC50中值分别为227和163 nmol/L（图4C）。这些数据表明，linrodostat显示出个位数的纳摩尔效力。

IDO1抑制[3]
用含有1mmol/L色氨酸、50μmol/L琥珀酰丙酮和50ng/mL人IFNγ 的培养基处理SKOV3人癌症细胞（ATCC）以诱导IDO1合成，并用10、50或100nmol/L的载体（DMSO）、Linrodostat /林洛司他或依帕洛司他 处理72小时。用Ehrlich比色法测定犬尿氨酸水平。用平板读数器（490nm）检测比色变化。根据犬尿氨酸标准曲线测定犬尿氨素浓度。

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IDO1抑制的逆转[3]
SKOV3细胞用5μg/mL环己酰亚胺处理以防止IDO1的进一步合成，并用50μmol/L琥珀酰丙酮孵育。将培养基替换为含有1 mmol/L色氨酸、50μmol/L琥珀酰丙酮和5μg/mL环己酰亚胺的培养基，并用载体（DMSO）或10μmol/L血红素处理重复培养基。如上所述，在0、2、4、6、8和10小时时测量犬尿氨酸水平。

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芳烃受体测定[3]
根据制造商的说明使用人类AhR报告检测系统（96孔格式）。将分配到96孔板中的报告细胞立即给予2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英（TCDD；1或10 nmol/L）、犬尿氨酸（1或10μmol/L）或林诺司他（1或0μmol/L）。孵育22至24小时后，取出培养基，加入萤光素酶检测试剂（100μL）。约5分钟后，使用板读数光度计检测每个孔的萤光素酶活性。

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SKOV-3 IDO1测定（细胞平板、IDO1诱导、犬尿氨酸测定）[1]
细胞以3×104个细胞/孔的速度铺板，并允许其附着过夜。第二天，将IFNγ以100ng/mL的终浓度加入细胞培养物中以诱导IDO1表达，然后在37°C和5%CO2下孵育24小时。 使用犬尿氨酸标准曲线来插值试验样品中的犬尿氨素浓度。

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半胱天冬酶3/7激活[1]
根据制造商的说明，使用Promega的Caspase 3/7 Glo试剂测量Caspase 3/6的活性。

基于细胞的检测中的半最大抑制浓度[3]
研究中使用的所有细胞系都进行了支原体常规检测，并按照标准方案跟踪传代。使用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI无酚红培养基接种过表达人IDO1、人TDO、小鼠IDO1或小鼠Ido2的HEK293细胞。Linrodostat 的制备方法如专利合作条约国际申请WO 2016073774（实施例19；参考文献32，33）中所述。加入Linrodostat（100 nL；10μmol/L–10 pmol/L），在37°C的5%CO2中孵育细胞20小时。使用含有10%FBS的RPMI无酚红培养基接种HeLa或M109细胞。加入Linrodostat（50μL；10μmol/L–10 pmol/L），细胞在37°C下孵育2小时。加入重组人IFNγ（终浓度，10ng/mL）或重组小鼠IFNγ，终浓度，5ng/mL，以诱导IDO1。细胞在37°C的5%CO2中孵育18小时。停止治疗，计算IC50值。

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相对存活率测定[1]
根据制造商的说明，使用Cell Titer Fluro 评估细胞存活率。根据未处理对照的读数计算相对细胞存活率。%相对存活率=试验值/未治疗对照值×100。

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细胞活力测定[1]
细胞类型： SKOV-3 和 Jurkat 克隆 E6-1 细胞
测试浓度： 0.01-100 μM
<孵化持续时间：72小时
实验结果：与未处理的对照相比，活细胞数量减少，并在低得多的浓度下诱导细胞死亡。

在剂量递增阶段，晚期癌症患者按剂量递增分组接受BMS-986205（截至2017年1月5日，剂量范围为25-200 mg）口服，每日一次（QD），持续2周，随后接受BMS-986205联合纳武利尤单抗（nivo）240 mg静脉注射，每2周一次。研究目标包括安全性（主要）、药代动力学（PK）和药效学（PD）。[2]

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人SKOV3异种移植瘤模型[3]
雌性裸鼠（nu/nu）（7-12周龄；Envigo公司）自由摄取食物和水，并按照国际实验动物评估和认证协会（AAALAC International）的规定饲养于受控环境中。 SKOV3细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于对数生长期收集（6 × 10⁷ 个细胞/mL，溶于Hank's平衡盐溶液），与Matrigel按1:1比例混合，皮下植入小鼠侧腹（0.1 mL或3 × 10⁶ 个细胞/只）。植入15天后，测量肿瘤体积，并将荷瘤小鼠随机分组（每组5只）。Linrodostat配制成乙醇/聚乙二醇(PEG) 400/丙二醇/d-α-生育酚PEG 1000琥珀酸酯（体积比5:55:20:20）混合溶液。每组分别口服给予赋形剂、Linrodostat（5、25 或 125 mg/kg，每日一次）或 epacadostat（30 或 100 mg/kg，每日两次），持续 5 天。在肿瘤速冻前测量肿瘤体积。在给药后指定时间点（第 5 天）采集血清，以定量分析犬尿氨酸和化合物水平。药代动力学分析 [3] 使用 Phoenix 6.3.0.395 软件，通过非房室模型分析血浆浓度-时间数据来确定药代动力学参数。采用线性对数梯形法计算从零时点到最后一次采样时间的曲线下面积 (AUC0-T) 和从零时点到无穷大的曲线下面积 (AUC0-∞)。静脉给药后估算总血浆清除率 (CLTp)、稳态分布容积 (Vss) 和表观消除半衰期 (t1/2)。 t1/2 估算值在 ≥ 3 个时间点计算。总血药清除率 (CLTb) 计算为 CLTp 除以血浆/血药浓度比值。绝对口服生物利用度 (F) 估算为口服和静脉给药后剂量标准化 AUC 的比值。

林罗司他体内药代动力学特征[3]
为了扩展这些SKOV3异种移植研究，我们评估了林罗司他在包括大鼠、犬和猴在内的高等动物中静脉注射和口服的药代动力学参数（表1）。静脉注射后，林罗司他的肝血流量（CLTp）在不同物种间具有可比性，大鼠、犬和猴的CLTp分别为27、25和19 mL/min/kg。CLTp≤相应报道的肝血流量的48%，表明林罗司他的全身清除率较低至中等。静脉注射后，大鼠、犬和猴的稳态分布容积（Vss）值分别为3.8、5.7和4.1 L/kg，表明其分布于血管外。林罗司他在大鼠、犬和猴中的半衰期（t1/2）分别为3.9、4.7和6.6小时。口服给药后，大鼠、犬和猴的达峰时间（Tmax）为0.5至1.7小时。以溶液形式给药的林罗司他，在大鼠、犬和猴中的绝对口服生物利用度分别为64%、39%和10%。大鼠肝细胞对林罗司他的代谢速率高于犬、猴和人。基于动物体内肝细胞清除率的体外-体内相关性，预计人体清除率为中等。这些数据表明，预计人体半衰期（t1/2）为23小时，支持临床上每日一次给药。
为了扩展这些临床前体内药效学/药代动力学（PD/PK）研究，我们评估了晚期癌症患者接受林罗司他联合纳武利尤单抗治疗后犬尿氨酸的药效学。在所有评估的林罗司他剂量下，均检测到平均血清犬尿氨酸水平显著降低，其中每日一次服用100 mg和200 mg剂量时，血清犬尿氨酸水平降低约60%（图5A和B）。此外，来自13例患者的治疗前和治疗期间肿瘤样本显示，即使在治疗前犬尿氨酸水平相对较高的情况下，治疗后所有剂量组的肿瘤内犬尿氨酸水平均有所降低（图5C）。这些结果表明，林罗司他联合纳武利尤单抗可显著降低血清和肿瘤内犬尿氨酸水平。

[1]. Cell based functional assays for IDO1 inhibitor screening and characterization. Oncotarget. 2018 Jul 20;9(56):30814-30820.

[2]. Abstract CT116: BMS-986205, an optimized indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) inhibitor, is well tolerated with potent pharmacodynamic (PD) activity, alone and in combination with nivolumab (nivo) in advanced cancers in a phase 1/2a trial. AACR; Cancer Res. 2017; 77 (13 Suppl): Abstract nr CT116.

[3]. Preclinical Characterization of Linrodostat Mesylate, a Novel, Potent, and Selective Oral Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 Inhibitor. Mol Cancer Ther. 2021 Mar;20(3):467-476.

Linrodostat 正在临床试验 NCT03247283（健康男性受试者的药代动力学和代谢研究）中进行研究。
Linrodostat 是一种口服的吲哚胺 2,3-双加氧酶 1 (IDO1) 抑制剂，具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。给药后，linrodostat 可特异性靶向并结合 IDO1，IDO1 是一种胞质酶，负责将氨基酸色氨酸氧化为具有免疫抑制作用的代谢物犬尿氨酸。通过抑制 IDO1 并降低肿瘤细胞中的犬尿氨酸水平，BMS-986205 可恢复并促进多种免疫细胞（包括树突状细胞 (DC)、自然杀伤 (NK) 细胞和 T 淋巴细胞）的增殖和活化，并减少肿瘤相关调节性 T 细胞 (Treg)。许多癌症中免疫系统受到抑制，而激活免疫系统可能诱导针对表达IDO1的肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，从而抑制表达IDO1的肿瘤细胞的生长。IDO1在多种肿瘤细胞类型中过表达，在免疫抑制中发挥重要作用。色氨酸耗竭会抑制T淋巴细胞的增殖和活化，进而抑制免疫系统。吲哚胺2,3-双加氧酶1 (IDO1) 是一种新的肿瘤免疫靶点，其抑制剂在临床上显示出良好的应用前景，尤其是在与其他免疫刺激剂联合使用时。本文介绍了两种用于筛选IDO1抑制剂的稳健的基于细胞的检测方法。这两种检测方法易于大多数实验室采用，并可用于IDO1抑制剂的筛选。在癌细胞系中，使用干扰素γ诱导内源性IDO1的表达，并通过测量分泌到培养基中的犬尿氨酸来评估其活性。本研究采用Jurkat T细胞系，通过共培养实验评估了癌细胞IDO1诱导和抑制对T细胞活化的影响。同时，还采用了评估细胞活力的指标，以便早期检测IDO1抑制剂的假阳性结果和毒性化合物。临床候选药物epacadostat和BMS-986205作为对照化合物参与了实验。epacadostat能够完全抑制IDO1活性，而BMS-986205的最大抑制效果有限（在本实验系统中约为80%），这与它们与IDO1相互作用的差异相符。纳摩尔浓度的两种化合物均能逆转IDO1介导的T细胞活化抑制。然而，微摩尔浓度的BMS-986205处理可阻断Jurkat T细胞活化，并在长时间孵育后诱导细胞死亡。[1]

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背景：IDO1在多种癌症中高表达，其产生的代谢物可抑制T细胞功能，从而可能成为肿瘤免疫逃逸的机制。纳武利尤单抗（Nivo）是一种靶向PD-1的单克隆抗体，可上调IDO1表达，这为将其与IDO1抑制剂联合用药提供了理论依据。我们的临床前研究旨在筛选出具有良好药代动力学（PK）特征的最佳IDO1抑制剂（Hunt J等人，AACR 2017 [摘要6774]）。本文介绍BMS-986205，一种选择性IDO1抑制剂，已在一项新的1/2a期临床试验中得到验证，该试验分别评估了BMS-986205单药治疗以及与纳武利尤单抗联合用药的疗效。方法：在剂量递增阶段，晚期癌症患者按剂量递增分组，首先每日口服一次BMS-986205（25-200 mg，截至2017年1月5日），持续2周，随后每2周静脉注射一次BMS-986205联合纳武利尤单抗240 mg。主要研究目标包括安全性、药代动力学和药效学。临床前分析包括对过表达人IDO1或色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）的HEK293细胞以及IFNγ刺激的HeLa细胞进行酶抑制测定。结果：为支持临床试验，对BMS-986205进行了临床前评估。体外特性包括：强效抑制IDO1-HEK293细胞中犬尿氨酸（kyn）的生成（IC50 = 1.1 nM），但对TDO-HEK293细胞无抑制作用；在洗脱后，基于IDO1细胞的检测中仍能持续抑制；以及在人耐受性混合淋巴细胞反应（MLR）检测中具有个位数纳摩尔级的效力。基于临床前数据，预计每日一次150 mg的人体剂量可最大程度地抑制IDO1。在正在进行的临床研究中，已有42名患者接受了治疗。除3例3级毒性反应（自身免疫性肝炎[剂量限制性；BMS-986205 100 mg/nivo 240 mg]、皮疹和无症状性低磷血症）外，所有治疗相关不良事件均为1/2级。从25 mg QD剂量开始，第14天个体谷浓度开始超过人全血IC50值；从50 mg QD剂量开始，谷浓度开始超过IC90值；所有接受200 mg QD治疗的患者谷浓度均超过IC90值。所有剂量组的血清犬尿氨酸水平均显著降低（各剂量组平均降低>45%），其中100 mg和200 mg QD剂量组平均降低>60%。重要的是，在可评估的配对治疗前和治疗期间样本中，肿瘤内犬尿氨酸水平降低了高达90%。结论：BMS-986205 是一种优化的、每日一次的、选择性强且高效的口服 IDO1 抑制剂，在临床相关浓度下具有良好的疗效。在本项新型试验中，BMS-986205 与纳武利尤单抗联合用药，耐受性良好，剂量至少可达 200 mg。即使每日一次 25 mg 的剂量也能观察到血清犬尿氨酸 (kyn) 水平显著降低；每日一次 100 mg 和 200 mg 剂量下的抑制效果似乎优于其他同类化合物。此外，我们首次证实了 IDO1 抑制剂能够降低肿瘤内犬尿氨酸水平。这些数据表明 BMS-986205 具有优异的药效学特性，是一种具有潜力的 IDO1 抑制剂，并支持进一步评估其与纳武利尤单抗联合用药的效果。[2]

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肿瘤可以利用吲哚胺 2,3-双加氧酶 1 (IDO1) 通路来构建免疫抑制性微环境。活化的IDO1将色氨酸代谢为具有免疫抑制作用的犬尿氨酸，导致效应T细胞（Teff）增殖受抑制，从而使肿瘤逃避免疫监视。IDO1抑制剂能够对抗这种免疫抑制性肿瘤微环境，并可能改善癌症预后，尤其是在与其他免疫疗法联合使用时。林罗司他甲磺酸盐（linrodostat）是一种强效、选择性的口服IDO1抑制剂，它通过占据血红素辅因子结合位点来阻止IDO1的进一步活化，目前正在进行多项临床试验，用于治疗晚期癌症患者。本文评估了林罗司他的体外效力、体内药效学（PD）活性和临床前药代动力学（PK）。林罗司他表现出强效的细胞活性，可抑制过表达人IDO1的HEK293细胞和IFNγ刺激的HeLa细胞中犬尿氨酸的生成，且未检测到对色氨酸2,3-双加氧酶或鼠吲哚胺2,3-双加氧酶2的活性。林罗司他可恢复T细胞与表达IDO1的同种异体树突状细胞混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖。体内实验表明，林罗司他可降低人肿瘤异种移植模型中的犬尿氨酸水平，并表现出显著的药效学活性。林罗司他在异种移植模型、临床前动物模型和晚期癌症患者样本中均表现出药代动力学/药效学关系，在临床前动物模型中具有较高的口服生物利用度，且全身清除率较低至中等。我们的数据表明，linrodostat 能有效且特异性地抑制 IDO1，从而阻断一种免疫抑制机制，该机制可能是肿瘤逃避宿主免疫监视的原因，并且具有良好的 PK/PD 特性，支持临床开发。[3]

C24H24CLFN2O

410.9116

410.156

C, 70.15; H, 5.89; Cl, 8.63; F, 4.62; N, 6.82; O, 3.89

1923833-60-6

1923833-60-6;2221034-29-1 (mesylate);1791396-46-7 (dimesylate );

121328278

White to off-white solid powder

6.5

42

1

3

4

29

545

1

ClC1C=CC(=CC=1)NC([C@H](C)C1CCC(C2C=CN=C3C=CC(=CC=23)F)CC1)=O

KRTIYQIPSAGSBP-KLAILNCOSA-N

InChI=1S/C24H24ClFN2O/c1-15(24(29)28-20-9-6-18(25)7-10-20)16-2-4-17(5-3-16)21-12-13-27-23-11-8-19(26)14-22(21)23/h6-17H,2-5H2,1H3,(H,28,29)/t15-,16?,17?/m1/s1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.08 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.08 mM) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 2.08 mg/mL (5.06 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 20.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。