5-HT6 Receptor (Ki = 2.04 nM)

为了确定任何其他脱靶活性，Novascreen在其100多个靶位点的商业选择性小组中评估了化合物SUVN-502（5al），这些靶位点包括受体（64）、酶（5）、肽（18）、生长因子（5），离子通道（6）、类固醇、免疫因子、第二信使和前列腺素（支持信息）。1μM的化合物SUVN-502（5al）对所有受试受体的抑制率均小于50%，多巴胺D3、肾上腺素能α2A和2C除外。在一项独立实验中，5al在多巴胺D3和2570 nM肾上腺素能α2A受体上的Ki值为616 nM。在α2C受体上，功能亲和力（Kb）值为619 nM。在阿司咪唑结合试验中测试时，主要候选物5al没有显示出对hERG钾通道的显著结合，在人类1期临床试验中也没有发现QTc间期的变化
在Caco-2肠上皮细胞系中评估了SUVN-502（5al）的渗透性，该细胞系显示出高渗透性（Papp=19.6×10-6cm/s）。外排比[Papp（B-A）/Papp（A-B）]小于2，表明与外排转运蛋白如P-gp的相互作用最小。使用平衡透析法在大鼠、狗和人血浆中测定了5al的蛋白结合程度。发现5al在大鼠、狗和人中的血浆蛋白结合率分别为99.0%、98.6%和98.0%[1]。

在观察到单独治疗后乙酰胆碱水平升高后，评估了治疗剂量（3mg/kg口服）和亚治疗剂量（1mg/kg口服）的Masupidine/SUVN-502（5al）与多奈哌齐（1mg/kg皮下注射）和美金刚胺（1mg/kg静脉注射）联合使用对雄性Wistar大鼠腹侧海马乙酰胆碱调节的影响（图5）。本研究设计的前提是，这种组合可能会提高治疗效果，并提供多种治疗益处，例如减少治疗剂的剂量，这可能会避免与更高剂量给药相关的副作用。如果假设是正确的，与现有批准的治疗方案相比，这些方案可能会提供一种新的机制，提高药物疗效和耐受性。

多奈哌齐（1 mg/kg皮下注射）和美金刚（1 mg/kg静脉注射）联合治疗导致海马乙酰胆碱水平升高，最高达到基础水平的1203±106%。化合物Masupidine/SUVN-502（5al）与多奈哌齐和美金刚联合口服1和3mg/kg后，平均最大增幅分别为1383±194%和2136±288%。Masupidine/SUVN-502（5al）（口服1和3 mg/kg）、多奈哌齐和美金刚联合用药产生的乙酰胆碱增加明显高于多奈哌齐和美金刚联合使用产生的增加。联合治疗组乙酰胆碱的增加没有任何胆碱能副作用。在另一项涉及药代动力学评估的研究中，单独或以三种组合给药时，多奈哌齐、美金刚或Masupidine/SUVN-502（5al）的血浆暴露量没有显著差异，从而排除了药代动力学相互作用介导效应的可能性（存档数据）。上述临床前研究的结果为5-HT6R拮抗剂Masupidine/SUVN-502（5al）与多奈哌齐和美金刚联合治疗认知障碍的潜在治疗效用提供了支持。

在第一阶段人体临床试验研究中，Masupidine/SUVN-502（5al）在健康男性和女性受试者中单次递增剂量和健康老年男性受试者14天的多次递增剂量中显示出良好的安全性和药代动力学特征。性别和食物对Masupidine/SUVN-502（5al）的药代动力学没有显著影响。它在人类中具有良好的耐受性，具有足够的血浆暴露效果和适合每天一次治疗的良好半衰期。正在进行一项2期概念验证研究（ClinicalTrials.gov标识符：NCT02580305），以评估5al在接受稳定剂量多奈哌齐和美金刚胺的中度AD患者中的安全性和有效性。据我们所知，这是第一项临床试验，其中使用三重组合[5-H-6R拮抗剂（5al）+多奈哌齐+美金刚]来评估5-HT6R拮抗剂的疗效[1]。

放射配体结合分析法测定5-羟色胺6受体Ki：[1]
之前已经描述了所使用的程序。简而言之，使用的受体源和放射性配体分别是HEK-293细胞和[3H]赖氨酸二乙胺（LSD）中表达的人重组受体。最终配体浓度为1.5 nM，非特异性决定簇为甲磺酸甲氧基肝素[0.1µM]。甲磺酸甲氧基肝素用作阳性对照。反应在含有10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA的50 mM Tris-HCl（pH 7.4）中在37°C下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤终止反应。测定过滤器上捕获的放射性，并将其与对照值进行比较，以确定受试化合物与克隆的5-羟色胺5-HT6结合位点的任何相互作用，并报告为Ki值。进行了这些研究，并使用如上所述的标准放射性配体结合技术对数据进行了分析。在这些测试的测定条件下，甲磺酸甲氧苄啶（参考化合物）的Ki值为0.5±0.04 nM。

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5-HT6受体Kb的测定：[1]
之前已经描述了所使用的程序。表达重组人5-HT6受体和pCRE-Luc报告系统的稳定CHO细胞系用于基于细胞的检测。该测定提供了一种非放射性的方法来确定化合物与GPCR的结合。在该特定测定中，测量由受体的激活或抑制调节的细胞内环AMP的水平。重组细胞在cAMP反应元件的控制下携带萤光素酶报告基因。使用含有10%胎牛血清（FBS）的Hams F12培养基，将上述细胞以5 x 104个细胞/孔的密度铺在96孔透明底部白色板上，在37℃和5%CO2下孵育S4过夜，然后血清饥饿18-20小时。向细胞中加入越来越高浓度的测试化合物以及OptiMEM中的10µM血清素。在37℃的CO2培养箱中继续孵育4小时。4小时后，使用裂解缓冲液裂解细胞，向每个孔中加入萤光素酶测定缓冲液，并使用发光计数器记录每秒计数。根据获得的每秒计数（CPS），以10µM 5-HT为100%结合，以载体为0%结合，计算每个孔的结合百分比。将百分比界限值与化合物浓度作图，并使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序对数据进行分析。Kb和IC50值是使用该测定中使用的激动剂浓度及其在同一软件中的EC50值计算的。在这些测试的测定条件下，甲磺酸甲氧苄啶（参考化合物）的Kb值为0.7±0.05 nM。

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5-HT1A结合实验程序：[1]
之前已经描述了所使用的程序。从重组人5-HT1A细胞系和放射性配体8-羟基-DPAT[丙基2,3--ring-1,2,3-3H]制备的膜是商业上购买的。缓冲液制备中使用的所有其他试剂都是商业上购买的。最终配体浓度为1.75nM；非特异性决定因素是5-HT[10µM]和5-HT1A膜蛋白（16µg/孔）。血清素被用作阳性对照。反应在含有0.5 mM EDTA、10 mM MgSO4和0.1%抗坏血酸缓冲液的50 mM Tris pH 7.4中在25℃下进行120分钟。通过快速过滤停止反应，然后使用预涂有0.33%聚乙烯亚胺的96孔收获板对结合混合物进行六次洗涤。将板干燥，使用MicroBeta-TriLux通过闪烁计数测定过滤器上收集的结合放射性。在S5存在非标记化合物的情况下，放射性配体结合以总结合的百分比表示，并与化合物的对数浓度作图。Ki值使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序确定（表1）。在这些测试的测定条件下，血清素（参考化合物）的Ki值为0.2±0.03 nM。

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5-HT2A结合实验程序：[1]
使用的程序如前所述，由重组人5-HT2A细胞系制备膜，放射性配体盐酸氯胺酮[Ethylene-3H]-（R-41468）购自Perkin-Elmer。缓冲液制备中使用的所有其他试剂均购自Sigma。最终配体浓度为1.75nM；非特异性决定簇为1-NP[10µM]和5-HT2A膜蛋白（5µg/孔）。1-NP用作阳性对照。反应在含有0.5 mM EDTA缓冲液的67 mM Tris pH 7.6中在25℃下进行60分钟。通过快速过滤停止反应，然后使用预涂有0.33%聚乙烯亚胺的96孔收获板对结合混合物进行六次洗涤。将板干燥，使用MicroBeta-TriLux通过闪烁计数测定过滤器上收集的结合放射性。未标记化合物存在下的放射性配体结合以总结合的百分比表示，并与化合物的对数浓度作图。Ki值使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序确定（表1）。在这些测试的测定条件下，1-（1-萘基）哌嗪盐酸盐（参考化合物）的Ki值为15.4±0.7 nM。

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5-HT2C结合实验程序：[1]
S6使用的程序已在前面描述过。简而言之，重组人5-HT2C细胞系的膜制剂，放射性配体Mesulergine，[NMethyl3H]购自Perkin-Elmer。缓冲液制备中使用的所有其他试剂均购自Sigma。最终配体浓度为1.25nM；非特异性决定因素是棉子丝氨酸[10µM]、5-HT2C膜蛋白（30µg/孔）和Ysi聚赖氨酸SPA珠，1.0 mg/孔。米安丝氨酸用作阳性对照。反应在含有10.8 mM MgCl 2、0.54 mM EDTA、10.8µM Pargyline、0.108%抗坏血酸、pH 7.4的54 mM Tris（pH 7.4）缓冲液中在25°C下进行180分钟。该板在MicroBeta TriLux中读取。未标记化合物存在下的放射性配体结合以总结合的百分比表示，并与化合物的对数浓度作图。Ki值使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序确定（表1）。在这些测试的测定条件下，米安色林（参考化合物）的Ki值为2.8±0.3 nM。

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5-HT4B结合实验程序：[1]
7简而言之，从重组人5-HT4B细胞系制备的膜是商业上购买的，放射性配体GR113808，[N-甲基3H]是商业上购得的。缓冲液制备中使用的所有其他试剂均购自Sigma。最终配体浓度为0.5nM；非特异性决定簇为GR113808[10µM]和5-HT4B膜蛋白（5µg/孔）。GR113808用作阳性对照。反应在25 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲液中在25°C下进行120分钟。通过快速过滤停止反应，然后使用预涂有0.33%聚乙烯亚胺的96孔收获板对结合混合物进行六次洗涤。S7干燥该板，使用MicroBeta-TriLux通过闪烁计数测定过滤器上收集的结合放射性。未标记化合物存在下的放射性配体结合以总结合的百分比表示，并与化合物的对数浓度作图。Ki值使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序确定（表1）。在这些测试的测定条件下，GR113808（参考化合物）的Ki值为16.2±0.8 nM。

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大鼠5-HT7受体IC50值的测定：[1]
之前已经描述了所使用的程序。8表达重组大鼠5-HT7受体和pCRE-Luc报告系统的稳定CHO细胞系用于基于细胞的测定。该测定提供了一种非放射性的方法来确定化合物与GPCR的结合。在该特定测定中，测量由受体的激活或抑制调节的细胞内环AMP的水平。重组细胞在cAMP反应元件的控制下携带萤光素酶报告基因。使用含有10%胎牛血清（FBS）的Hams F12培养基，将上述细胞以5 x 104个细胞/孔的密度铺在96孔透明底部白色板上，在37℃和5%CO2下孵育过夜，然后血清饥饿18-20小时。向细胞中加入越来越高浓度的测试化合物以及OptiMEM中的10µM血清素。在37℃的CO2培养箱中继续孵育4小时。4小时后，使用裂解缓冲液裂解细胞，向每个孔中加入萤光素酶测定缓冲液，并使用发光计数器记录每秒计数。根据获得的CPS，以10µM血清素为100%结合，载体为0%结合，计算每个孔的结合百分比。将百分比界限值与化合物浓度作图，并使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序对数据进行分析。IC50 S8值是使用该测定中使用的激动剂的浓度及其在同一软件中的EC50值计算的（表1）。在这些测试的测定条件下，甲磺酸甲氧苄啶（参考化合物）的Kb值为0.6±0.04 nM（IC50=117±6.6 nM）。

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蛋白质结合方案：[1]
使用快速平衡透析法测定血浆中Masupidine/SUVN-502（5al）的未结合部分。透析液室装有750µL 100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4），一式三份。基质室装有500µL血浆，血浆中掺有终浓度为1µM的Masupidine/SUVN-502（5al）。0小时时，从两个腔室中取出50µL样品。密封S19板，在37°C下以100 rpm孵育6小时。6小时后，从两个腔室中取出50µL样品。将等体积的缓冲液或血浆分别添加到血浆/微粒体和缓冲液样品中，以创建相同的样品基质进行分析。用150µL含乙腈的内标沉淀样品。所有样品在4°C下以10000 rpm离心10分钟。将上清液转移到小瓶中，并通过LC-MS/MS进行分析。

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CYP抑制：[1]
如别处所述，使用人肝微粒体中CYP酶的标记探针底物反应来确定受试化合物的抑制谱。17最终的孵育混合物由磷酸盐缓冲液（100 mM，pH 7.4）、每种酶特异性的标记探针底物和人肝微粒体组成。通过加入NADPH（1 mM）至最终体积为200µL来引发反应。在为每种CYP亚型指定孵育时间后，用240µL含乙腈的内标终止120µL的孵育混合物。样品在4°C下以2500xg离心10分钟。

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CYP诱导：[1]
将来自三个供体的人冷冻肝细胞解冻，在通用冷冻恢复培养基中回收，并在100 g下离心10分钟。通过台盼蓝染料排除评估存活率。肝细胞被铺在胶原涂层的96孔板上，每孔约有65000个细胞，并在37°C、5%二氧化碳和95%空气的加湿环境中培养。将肝细胞培养1 S21天，然后用试验化合物和阳性对照诱导剂（1A2:50μM奥美拉唑；2B6:1000μM苯巴比妥；3A4:20μM利福平）处理。研究中使用了来自3个不同供体的人肝细胞。治疗又进行了3天。在3天的处理期后，将培养基换成含有特定P450底物的HIM，并将细胞孵育30分钟。孵育期结束时，将培养基收至96孔板中，并在-80°C下储存直至分析。使用四唑啉盐WST-1通过WST细胞活力测定法测定肝细胞的细胞活力。将肝细胞与含HIM的WST-1试剂以1:10的稀释度孵育2小时，然后使用紫外平板读数器在450nm处定量吸光度。根据制造商提供的分离说明，使用RNeasy 96试剂盒从肝细胞中分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒用100ng分离的RNA进行逆转录。使用7500快速实时PCR测量基因表达。使用Taqman通用混合物和特定引物组对RT反应进行定量。将靶基因的相对数量与通过ΔΔCT方法测定的内源性控制管家基因表达（GAPDH）的相对数量进行比较。

渗透性研究：[1]
Caco-2细胞中的跨上皮转运在瑞士RCC Gen biotec GmbH（RCCGBT）按照其标准操作程序进行。细胞在添加了10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%庆大霉素的DMEM培养基中维持。使用Caco-2培养基将细胞以约300000个细胞/cm2的密度接种在12孔聚酯（PET）透孔培养皿中。细胞在37°C/5%CO2的加湿培养箱中培养。培养基每2-3天更新一次。在培养约10天后，每三天测定一次TEER，直至其达到平稳状态。试验中使用了TEER大于280Ωcm 2的Transwell腔。对于经上皮转运研究，在试验开始前测量TEER S18，取出培养基，用预热（37℃）的Hank's缓冲液洗涤细胞两次，以去除微量培养基。通过向顶腔或基底外侧腔中加入溶解的试验化合物，使其终浓度达到10µM，从而开始试验。在不同时间点（20、40、60、80、100和120分钟）采集100µl的样品。通过添加100µL Hank's缓冲液来替换去除的体积，并在评估结果时考虑浓度的降低。使用LCMS/MS分析对样品进行分析。[1]

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放射配体结合分析法测定肾上腺素能α2A受体Ki：[1]
简言之；使用的受体源和放射配体分别是HT29细胞和[3H]MK-912。最终配体浓度为0.75 nM，非特异性决定簇为L（-）-去甲肾上腺素-[100µM]。盐酸羟甲唑啉用作阳性对照。在含有1 mM EDTA、140 mM NaCl和100µM Gpp（NH）p（鸟苷-5'-酰亚胺二磷酸盐）的33 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，于25°C下反应60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤终止反应。测定过滤器上捕获的放射性，并将其与对照值进行比较，以确定受试化合物与人肾上腺素能α2A结合位点的任何相互作用，并报告为Ki值。进行了这些研究，并使用如上所述的标准放射性配体结合技术对数据进行了分析。在这些测试的测定条件下，盐酸羟甲唑啉（参考化合物）的Ki值为1.3±0.06 nM。

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肾上腺素能α2C受体Kb值的测定：[1]
表达重组人肾上腺素能α2C受体和pCRE-Luc报告系统的稳定CHO细胞系用于基于细胞的检测。该测定提供了一种非放射性的方法来确定化合物与GPCR的结合。在该特定测定中，测量由受体的激活或抑制调节的细胞内环AMP的水平。重组细胞在cAMP反应元件的控制下携带萤光素酶报告基因。使用含有10%胎牛血清（FBS）的Hams F12培养基，将上述细胞以5 x 104个细胞/孔的密度铺在96孔透明底部白色板上，在37℃和5%CO2下孵育过夜，然后血清饥饿18-20小时。向细胞中加入越来越高浓度的试验化合物以及MEM Opti中的1µM肾上腺素和1µM福司克林。在37℃的CO2培养箱中继续孵育4小时。4小时后，使用裂解缓冲液裂解细胞，向每个孔中加入萤光素酶测定缓冲液，并使用发光计数器记录每秒计数。根据获得的CPS，以10µM肾上腺素为100%结合，以载体为0%结合，计算每个孔的结合百分比。将百分比界限值与化合物浓度作图，并使用Graph pad Prism 4软件的非线性迭代曲线拟合计算机程序对数据进行分析。Kb和IC50值是使用该测定中使用的激动剂浓度及其在同一软件中的EC50值计算的。在这些测试的测定条件下，螺酯碱（参考化合物）的Kb值为3.6±0.3 nM。

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放射性配体结合分析法测定多巴胺D3受体Ki：[1]
简言之；使用的受体源和放射性配体分别是CHO细胞和[3H]7-OH DPAT中表达的大鼠重组受体。最终配体浓度为0.8 nM，非特异性决定簇为多巴胺–[1µM]。（±）-7-OH-DPAT-HBr作为阳性对照。反应在含有120 mM NaCl的50 mM Tris-HCl（pH 7.4）中在25°C下进行60分钟。通过在玻璃纤维过滤器上快速真空过滤终止反应。测定过滤器上捕获的放射性，并将其与对照值进行比较，以确定测试化合物与克隆的多巴胺D3结合位点的任何相互作用，并报告为Ki值。进行了这些研究，并使用如上所述的标准放射性配体结合技术对数据进行了分析。在这些测试的测定条件下，（±）-7-OH-DPAT HBr（参考化合物）的Ki值为0.4±0.02 nM。

体内脑微透析[1]
\n雄性Wistar大鼠（体重240-300 g）在异氟烷麻醉下，立体定位植入微透析引导套管至腹侧海马（AP：-5.2 mm，ML：+5.0 mm，DV：-3.8 mm）。坐标系参照大鼠脑图谱，以颅骨前囟为参考点，垂直于颅骨为参考点。术后，大鼠单独置于圆底有机玻璃碗中恢复4天，可自由摄取食物和水。术后恢复4-5天后，将雄性Wistar大鼠连接至双石英衬里双通道液体旋转装置，该装置位于平衡杆上，允许动物自由活动。实验开始前16小时，将预平衡的微透析探针（4 mm透析膜）通过引导套管插入腹侧海马。在研究当日，以1.5 μL/min的流速，用人工脑脊液（aCSF；NaCl 147 mM、KCl 3 mM、MgCl2 1 mM、CaCl2·2H2O 1.3 mM、NaH2PO4·2H2O 0.2 mM和Na2HPO4·7H2O 1 mM，pH 7.2）灌注探针，并维持2小时的稳定期。在给予化合物Masupirdine/SUVN-502 (5al)（1或3 mg/kg，口服）或赋形剂之前，每隔20分钟采集5个基线样本。对于联合用药的研究，在给予Masupirdine/SUVN-502 (5al) 30分钟后，分别给予多奈哌齐（1 mg/kg，皮下注射）和美金刚（1 mg/kg，皮下注射）。在接受马苏吡啶/SUVN-502 (5al)治疗后，额外收集6小时的透析液（联合用药研究中为4小时），并将透析液储存在-50 °C以下，直至使用LC-MS/MS法定量乙酰胆碱。乙酰胆碱浓度以相对于平均基础乙酰胆碱浓度的百分比变化表示，100%定义为给药前5个值的平均值。乙酰胆碱水平的百分比变化与溶媒组进行比较。在联合用药研究中，使用双因素方差分析（时间和治疗）比较马苏吡啶/SUVN-502 (5al)、多奈哌齐和美金刚联合用药后乙酰胆碱水平的百分比变化与多奈哌齐和美金刚联合用药后的百分比变化，随后进行Bonferroni事后检验。统计学显著性定义为p值小于0.05。探针放置不当被视为拒绝动物数据的标准。\n

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\n\n大鼠药代动力学研究：[1]
\n实验动物为雄性Wistar大鼠（225 ± 25 g）。每笼饲养三只动物。给药前两天，雄性Wistar大鼠（225-250 g）用异氟烷麻醉，进行颈静脉插管手术。口服给药（po）前，动物禁食过夜；给药后2小时给予饲料颗粒；静脉给药时，动物可自由摄取食物和水。分别对三只大鼠进行口服（10 mg/kg）和静脉注射（10 mg/kg）给药。口服给药剂量为10 mL/kg，静脉注射给药剂量为2 mL/kg，以水为溶剂配制制剂。在每个时间点，通过颈静脉采集血液，并立即用等体积的生理盐水补充自由活动的大鼠。采集的血液转移至含有10 µL肝素抗凝剂的标记小瓶中。血液样本采集时间点如下：给药前、给药后0.08小时（仅限静脉注射）、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时（n=3）。血液以4000 rpm离心10分钟。制备血浆并储存于-70 °C直至分析。采用合适的提取技术，通过合格的LC-MS/MS方法定量血浆中化合物的浓度。化合物在血浆中的定量范围约为2-2000 ng/mL。研究样本的分析采用了批次内的校准样本和分布于整个批次中的质量控制样本。药代动力学参数Cmax、AUC0-t、t1/2和生物利用度采用非房室模型，并使用WinNonLin 5.0.1版本软件包进行计算。我们评估了已报道的参考5-HT6受体拮抗剂（SAM-531）在与先导化合物相似的实验条件下（表2）在大鼠体内的药代动力学特征。所报告的值与已发表的报道一致。\n

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\n\n啮齿动物脑渗透性研究：[1]
\n实验动物为雄性Wistar大鼠（225 ± 25 g）。每笼饲养三只动物。实验期间，动物可自由摄取水和食物，并维持在12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环中。雄性Wistar大鼠禁食过夜后，以10 mg/kg的剂量（n = 3）经口（po；给药体积2.5 mL/kg）给予化合物。分别于给药前0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24和32小时（每个时间点n=3）通过心脏穿刺采集血液，立即分离脑组织并丢弃尸体。将脑组织用4倍体积的冰水匀浆。将血浆和脑匀浆（20%）冷冻保存于-20 °C直至分析。采用固相萃取技术，通过经验证的LC-MS/MS方法测定血浆和脑组织中化合物的浓度，在2-2000 ng/mL的校准范围内进行定量。使用经验证的WinNonlin 4.1版软件进行药代动力学评价。在Tmax时计算脑血浆比值（Cb/Cp）。\n

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\n\n物体识别测试方案：[1]
\n物体识别测试采用10-12周龄的雄性Wistar大鼠。测试场地尺寸为50 x 50 x 50厘米，由丙烯酸树脂制成。第1天，大鼠在无任何物体的独立测试场地中适应20分钟。第2天（适应24小时后），大鼠进入熟悉阶段（T1）。将大鼠单独放入包含两个相同物体（a1和a2）的开放场地中3分钟。在T1测试24小时后进行识别测试（T2）。允许大鼠在开放场地中探索3分钟，场地内放置一个熟悉的物体（a3）和一个新物体（b）。记录大鼠在熟悉阶段和识别阶段对物体的探索行为。我们评估了一种已报道的参考5-HT6受体拮抗剂（SAM-531）在物体识别任务模型中的疗效，实验条件与本研究相似，但给药途径不同。SAM-531在1和3 mg/kg剂量下均显示出疗效，如下图所示（图1）。\n

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\n\n犬药代动力学研究：[1]
\n在第8天，对禁食的比格犬（每剂量组n=3）口服10 mg/kg的马苏吡啶/SUVN-502 (5al)；在第1天，对非禁食的犬静脉注射3.0 mg/kg的马苏吡啶/SUVN-502 (5al)。口服给药时，将化合物直接称重装入明胶胶囊。静脉注射时，使用注射用水作为溶剂，给药体积为1 mL/kg。在研究的第1天和第8天，分别采集受试者口服（胶囊）和静脉注射（推注）给药后的血样，用于测定血浆药物浓度。口服给药后，分别于15分钟、30分钟、45分钟以及1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48和72小时采集血样。静脉注射给药后，分别于5分钟、10分钟、20分钟、30分钟以及1、2、4、6、8、12、24、48和72小时采集血样。每次采集时，均从颈静脉抽取约3毫升血液，并收集于含肝素锂的采血管中。血液样本在4℃下以4000转/分钟离心10分钟。将血浆转移至塑料（聚丙烯）管中，并置于干冰上保存。样品储存在 -80 ± 10 °C 直至分析。\n

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\n恐惧条件反射模型实验方案：[1]
\n实验持续两天。第一天，将大鼠放入操作行为箱中，使其适应 2 分钟。大鼠接受条件刺激 (CS)（持续 10 秒的音调），随后接受不可避免的足底电击（非条件刺激 (US)：持续 3 秒的 0.5 - 0.7 mA 电击）。每次刺激间隔 1 分钟，重复音调和电击，共进行三次 CS-US 配对。大鼠接受 马舒匹啶/SUVN-502 (5al) （1 小时）。训练结束后 120 分钟，皮下注射东莨菪碱 (0.3 mg/kg)。第二天，将大鼠放入操作行为箱中，记录 5 分钟内的总冻结时间。

在非啮齿类动物比格犬中进行了SUVN-502 (5al) 的药代动力学研究（口服剂量为10 mg/kg，静脉注射剂量为3 mg/kg）。该药物能被良好吸收进入体循环，口服暴露量高（AUC_0-t为1356 ± 1067 ng·h/mL），末端半衰期为3.5 h，静脉清除率高（46.4 ± 10.9 mL/min/kg）。分布容积为7.5 L/kg，表明5al广泛分布于组织中。绝对口服生物利用度为35%。使用另一种探针底物睾酮评估了化合物5al对CYP3A4的抑制作用。结果表明，5al能抑制睾酮的羟基化，IC₅₀值为2.64 μM。化合物 5al 还利用特异性 CYP 同工酶标志物活性，在混合人肝微粒体中评估了其对其他 CYP 同工酶（CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19 和 2E1）的抑制潜力。结果显示，化合物 5al 对美芬妥英羟基化（2C19）具有中等程度的抑制作用，IC50 值为 5.7 μM，但对其他 CYP450 酶的抑制作用不显著（IC50 > 10 μM）。此外，还利用 mRNA 表达和酶活性作为终点指标，在人可铺板肝细胞中评估了化合物 5al 的 CYP 诱导潜力。结果表明，在 0.01、0.1 和 1.0 μM 的测试浓度下，化合物 5al 均未诱导 CYP1A2、CYP2B6 和 CYP3A4 的表达。化合物 5al 还在其他认知和神经化学动物模型中进行了评估。在情境恐惧条件反射任务中，以 1、3 和 10 mg/kg 的口服剂量，东莨菪碱可逆转东莨菪碱引起的记忆缺陷（图 3）。[1]

[1]. Discovery and Development of 1-[(2-Bromophenyl)sulfonyl]-5-methoxy-3-[(4-methyl-1-piperazinyl)methyl]-1H-indole Dimesylate Monohydrate (SUVN-502): A Novel, Potent, Selective and Orally Active Serotonin 6 (5-HT6) Receptor Antagonist for Potential Treatment of Alzheimer's Disease. J Med Chem.2017 Mar 9;60(5):1843-1859.

对一系列新型3-(哌嗪基甲基)吲哚衍生物作为5-羟色胺-6受体(5-HT6R)拮抗剂进行优化，最终鉴定出1-[(2-溴苯基)磺酰基]-5-甲氧基-3-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-1H-吲哚二甲磺酸盐一水合物（马苏吡啶/SUVN-502 (5al)），该化合物有望成为治疗认知障碍的临床候选药物。它对人5-HT6R具有高亲和力（Ki = 2.04 nM），并对包括受体、酶、肽、生长因子、离子通道、类固醇、免疫因子、第二信使和前列腺素在内的100多个靶点具有选择性。此外，它对5-HT2A受体也具有高选择性。该化合物口服生物利用度高，能穿透血脑屏障，并具有显著的临床前疗效。 5al、多奈哌齐和美金刚的组合（三联疗法）可对腹侧海马的细胞外乙酰胆碱水平产生协同效应。三联疗法的临床前疗效以及对5-HT2A受体的高选择性是5al被选中进行进一步开发的关键因素。目前已完成I期安全性和药代动力学评估，可以启动II期概念验证研究。[1] 总之，围绕3-(哌嗪甲基)吲哚骨架的构效关系研究发现，中心吲哚核心对5-HT6R具有最佳亲和力。用4-氮杂吲哚、7-氮杂吲哚或吲唑取代该核心可得到效力中等的化合物。较小的卤素和烷氧基取代基也具有良好的耐受性，尤其是在吲哚的C5位。 3-(哌嗪甲基)吲哚具有最佳亲和力。进一步延长链，例如3-(哌嗪乙基)吲哚，则不耐受。N-芳基磺酰胺对亲和力至关重要；用苄基和苯甲酰基取代它会导致化合物活性降低。卤素和低级烷氧基是N-芳基磺酰胺环上优选取代基。体外亲和力、选择性、理化性质、体内疗效和安全性评价最终确定了Masupirdine/SUVN-502 (5al)为候选药物。5al是一种结晶的二甲磺酸盐一水合物，具有极高的水溶性和渗透性。它对重组细胞色素P450 3A4有弱抑制作用，但不抑制CYP 2D6。化合物 5al 是一种口服生物利用度高且能穿透血脑屏障的 5-HT6R 拮抗剂，在 ORT 和情境恐惧条件反射等认知模型中均显示出显著疗效。5al、多奈哌齐和美金刚的三联用可显著提高腹侧海马细胞外乙酰胆碱水平，且无胆碱能副作用，从而为在各种行为模型中观察到的促认知活性提供了神经化学基础。该化合物的显著特点在于其三联用药的临床前疗效以及对 5-HT2A 受体的选择性。化合物 5al 不具有致突变性和致染色体断裂性。评估其安全性和药代动力学的单次和多次递增剂量研究的临床部分已完成，从而可以启动 II 期概念验证研究。关于 5al 的完整生物学特性，包括其在 II 期概念验证试验中使用三联用药的详细理论依据，将在即将发表的生物学论文中进行报道。[1]

C22H28BRN3O6S2

574.508222579956

669.048

C, 41.19; H, 4.81; Br, 11.92; N, 6.27; O, 21.47; S, 14.34

1791396-46-7

Masupirdine free base;701205-60-9

118142730

Pale purple to purple solid powder

189

2

11

5

39

743

0

CN1CCN(CC1)CC2=CN(C3=C2C=C(C=C3)OC)S(=O)(=O)C4=CC=CC=C4Br.CS(=O)(=O)O.CS(=O)(=O)O

LOZVXBFXRPRECW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H24BrN3O3S.2CH4O3S/c1-23-9-11-24(12-10-23)14-16-15-25(20-8-7-17(28-2)13-18(16)20)29(26,27)21-6-4-3-5-19(21)22;2*1-5(2,3)4/h3-8,13,15H,9-12,14H2,1-2H3;2*1H3,(H,2,3,4)

1-(2-bromophenyl)sulfonyl-5-methoxy-3-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]indole;methanesulfonic acid

SUVN-502 dimesylate; 1791396-46-7; Masupirdine mesylate; Masupirdine (mesylate); Masupirdine dimesylate; BFE1VOB95D; 1-(2-bromophenyl)sulfonyl-5-methoxy-3-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]indole;methanesulfonic acid; SUVN502 mesylate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~37.28 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。