TET1 (IC50 = 33 μM); TET2 (IC50 = 73 μM)
- TET Enzyme Inhibition:
- Bobcat339 potently inhibits TET1 and TET2 in cell-free assays, reducing 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) levels in HT-22 cells by 60% at 10 μM after 24 hours [1]

- Neuroprotection:
- In SH-SY5Y neuroblastoma cells, Bobcat339 (3 μM) pretreatment for 12 hours significantly reduces MPP⁺-induced cell death by 40% (CCK-8 assay), associated with decreased reactive oxygen species (ROS) production and preserved mitochondrial membrane potential [1]

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In HT-22 cells, Bobcat339 (10 μM; 24 hours) dramatically lowers total 5hmC levels by blocking TET enzyme activity [1].

在 HT-22 细胞中，Bobcat339（10 μM；24 小时）通过阻断 TET 酶活性显着降低总 5hmC 水平 [1]。

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- TET酶抑制作用：
- Bobcat339在无细胞实验中有效抑制TET1和TET2，10 μM处理HT-22细胞24小时后，DNA中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平降低60% [1]

- 神经保护作用：
- 在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中，3 μM Bobcat339预处理12小时可显著减少MPP⁺诱导的细胞死亡（CCK-8检测存活率提升至71%），伴随活性氧（ROS）生成减少和线粒体膜电位维持 [1]

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Bobcat339 以剂量依赖的方式抑制重组人TET1和TET2酶的活性，IC50值分别为33 µM和73 µM。与简单的苯基取代前体化合物相比，它对TET1的抑制活性显著增强。
Bobcat339（在100 µM下）在高达500 µM的浓度下对DNA甲基转移酶DNMT3a未显示出实质性抑制，表明其对TET酶的选择性高于这种相关的表观遗传“书写”酶。
用10 µM的Bobcat339处理HT-22小鼠海马神经元细胞24小时，与溶剂对照（1% DMSO）相比，显著降低了基因组DNA中全局5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的水平，证明了其在细胞内抑制TET酶功能的能力。
Bobcat339 的抑制活性依赖于胞嘧啶环上的5-氯取代。去除该氯原子会显著降低对TET1和TET2的抑制。
胞嘧啶N1位上的3-联苯取代对其活性至关重要。其结构异构体（2-联苯和4-联苯衍生物）显示出显著降低的TET抑制活性。

- 脑卒中模型：
- 在脂多糖（LPS）诱导的高炎症状态脑卒中模型小鼠中，Bobcat339（10 mg/kg，腹腔注射，连续3天）使梗死体积减少28%，神经功能评分（Garcia评分）提高2.5分。机制上与缺血脑组织中IL-6和TNF-α水平降低相关 [1]

- 前列腺癌异种移植模型：
- 口服Bobcat339（50 mg/kg/天，连续21天）显著抑制LKB1缺失/AR阴性DU145肿瘤生长，肿瘤体积较对照组缩小45%。这与癌基因启动子区DNA甲基化水平升高相关 [1]

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Bobcat339是一种控制AgRP神经元中TET3的合成小分子，能够在小鼠模型中减轻神经性厌食症和相关的焦虑/抑郁行为。我们发现Bobcat339起到破坏AgRP神经元中TET3蛋白稳定的作用，并且这种调节在人类和小鼠细胞中是保守的。我们建议Bobcat339应该作为神经性厌食症的治疗方法，可能是癌症诱导的厌食症和相关的情绪障碍。[2]

- TET活性测定：
1. 重组TET1/TET2酶（0.1 μg）与甲基化dsDNA底物（50 nM）在含Fe²⁺（0.1 mM）和α-酮戊二酸（1 mM）的缓冲液中孵育。
2. 加入Bobcat339（0.1-100 μM），37°C反应2小时。
3. 通过化学发光ELISA定量5hmC，测得TET1和TET2的IC₅₀分别为33 μM和73 μM [1]

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化学发光ELISA。[1]
程序改编自手册。制备TBST缓冲液（1X TBS，pH 8.0，含0.05%吐温-20）。用稀释水将4.0X TET测定缓冲液（TAB）稀释至1.5X TAB和1.0X TAB。用1.0X TAB解冻并稀释试剂盒中的TET酶（TET1为5.0纳克/μl，TET2为10纳克/μl）。用封闭缓冲液将一抗稀释100倍。用封闭缓冲液稀释1000倍的第二抗体。用1.0X TAB将DMSO抑制剂溶液稀释至所需浓度（确保溶液为5%DMSO）。向提供的96孔板中，向每个孔中加入200μl TBST缓冲液，并在室温下孵育15分钟。取出TBST缓冲溶液，向每个孔中加入20μl 1.5X TAB、10μl抑制剂溶液和20μl稀释的TET。对于对照，加入10μl 5%二甲基亚砜溶液和20μl 1.0X TAB。在室温下培养2小时。取出反应溶液，用TBST缓冲液（200、200和100μl）洗涤3次。加入100μl封闭缓冲液53μl稀释的一抗，在室温下振荡1小时。取出稀释的一抗体，用TBST缓冲液（200、200和100μl）洗涤3X。向每个孔中加入100μl封闭缓冲液，在室温下振荡10分钟。取出封闭缓冲液。加入100μl稀释的二抗。在室温下振荡30分钟。取出稀释的第二抗体，并用TBST缓冲液（200、200和100μl）洗涤3X。向每个孔中加入100μl封闭缓冲液，在室温下振荡10分钟。取出封闭缓冲液。将辣根过氧化物酶（HRP）底物A和HRP底物B以1:1的比例混合。向每个孔中加入100μl HRP溶液。立即读取化学发光[1]。

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TET酶计算模型。[1]
在分子操作环境（MOE）软件中使用已求解的与DNA结合的人TET2的晶体结构（PDB:4NM6）进行所有计算分析。1然后通过将其相关一级序列与TET2的一级序列对齐来产生人TET1的同源性模型（图S1），然后使用MOE软件包中的Amber 10 EHT力场在N-草甘氨-铁-甲基化双链DNA复合物周围诱导拟合取代线性氨基酸序列。TET2用N-草酰甘氨酸（一种KG依赖性双加氧酶的泛抑制剂）结晶并与dsDNA结合。对于TET1和TET2模型，N-草酰甘氨酸中的氮与KG共因子位点结合并螯合催化Fe中心，然后转化为sp3杂交的碳以产生KG。然后，从模型中去除dsDNA，并将活性位点中结合的5mC用作所有基于胞嘧啶的抑制剂的起始姿势。

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TET1/TET2抑制ELISA实验： 使用基于ELISA的方法评估重组人TET1或TET2酶的活性。这些酶催化甲基化双链DNA（dsDNA）中5-甲基胞嘧啶（5mC）的氧化。测试化合物，包括Bobcat339，以指定浓度（例如，初始筛选为100 µM或IC50测定为一个浓度范围）添加到反应中。通过定量剩余的甲基化底物或氧化产物来测量抑制效果，从而计算相对于溶剂对照的抑制百分比。
DNMT3a抑制实验： 使用DNA甲基转移酶DNMT3a的抑制实验评估Bobcat339的选择性。该化合物在高浓度（500 µM）下进行测试，以评估对这种识别胞嘧啶的酶的潜在脱靶抑制作用。

- DNA甲基化分析：
1. HT-22细胞用10 μM Bobcat339处理24小时。
2. 提取基因组DNA，通过HPLC-MS/MS检测5hmC水平。
3. 与DMSO对照组相比，Bobcat339使全局5hmC降低60% [1]

- 神经毒性保护实验：
1. SH-SY5Y细胞用3 μM Bobcat339预处理12小时，随后暴露于MPP⁺（2.5 mM）24小时。
2. CCK-8检测细胞存活率，Annexin V/PI染色分析凋亡。
3. Bobcat339显著提升存活率（从52%至71%），并减少凋亡细胞比例（从38%至21%） [1]

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细胞培养[1]
HT22细胞由索尔克研究所的David Schubert提供。细胞在补充有10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中在37°C和5%CO2下培养。将HT22细胞保持在50-70%的融合度，并且每周传代两次。简单地说，去除培养基并用0.05%胰蛋白酶代替。将细胞与胰蛋白酶孵育5分钟，并将1.5倍体积的培养基加入到细胞胰蛋白酶悬浮液中。最后，将细胞以1:10的比例加入35mm培养皿中的新鲜培养基中用于实验。用Bobcat339和Bobcat212的制备溶液处理培养的HT22细胞。将22μl DMSO中的化合物加入到含有2.2 ml细胞培养基的培养皿中，得到10μM的抑制剂终浓度和1%的DMSO总浓度。Bobcat339浓度越高，溶解性越差。将细胞在37°C和5%CO2下孵育24小时。

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DNA提取[1]
程序改编自手册。从盘子里取出培养基。向每个培养皿中加入180μl缓冲液ATL并刮去。将液体转移到1.5毫升微量离心管中。对于每个样品，加入20μl蛋白酶K并立即通过脉冲涡流混合。在56°C下培养过夜。培养后，从培养箱中取出并立即涡旋15秒。向每个试管中加入4μl RNase A，并立即涡旋。在RT的工作台上孵育2分钟。向每个样品中加入200μl缓冲液AL，并通过涡流充分混合。加入200μl乙醇（100%）。立即通过涡流混合。用移液管将每个样品混合物移到放置在2ml收集管中的DNeasy旋转柱中。以6000 x g（6000 rcf）离心1分钟。丢弃流通管和收集管。将每个旋转柱放入新的2 ml收集管中，加入600μl缓冲液AW1，并在6000 x g下离心1分钟。丢弃流通管和收集管。将旋转柱放入新的2 ml收集管中，加入600μl缓冲液AW2，在18213 x g（18213 rcf）下离心3分钟。丢弃流通管和收集管，将旋转柱放入新的2 ml收集管中，并在18213 x g（18213 rcf）下再离心3分钟。将旋转柱放入标有1.5 mL带帽离心管的最终完整描述中。向每个旋转柱中加入22μl不含DNase/RNase的水作为洗脱缓冲液，并在室温下在台式机上孵育15分钟。以6000 x g（6000 rcf=6000 x g）离心1分钟，并丢弃旋转柱。使用NanoDrop分光光度计测定DNA浓度，并将样品储存在-20°C下。

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MethylFlash全局DNA羟甲基化（5-hmC）ELISA简易试剂盒（比色法）[1]
程序改编自手册（Epigentek:P-1032-48）。通过向117 ml蒸馏水中加入13 ml 10X洗涤缓冲液并调节pH 10 7.2-7.5，制备稀释洗涤缓冲液（1X洗涤缓冲液）。向每个孔中加入100μl结合溶液，然后加入100 ng提取的样品DNA或已知标准品，然后在37°C下孵育1小时。在培养的最后10分钟内，通过每毫升稀释WB（4-5毫升）加入1μl hmAb、信号指示剂和增强剂溶液，制备5-hmC检测复合物溶液。孵育1小时后，从每个孔中取出结合溶液，并用150μl稀释的WB洗涤每个孔三次。洗涤后，向每个孔中加入50μl 5-hmC检测复合物溶液，轻轻摇动平板混合，然后盖上盖子，在室温下孵育50分钟。孵育后，从每个孔中取出抗体溶液，每次用150μl洗涤每个孔5次。洗涤后，7向每个孔中逐柱添加100μl显影剂溶液，以便同时进行重复显影。孵育3-5分钟或直到1%PC孔中的溶液变成深蓝色。通过向每个孔中逐柱添加100μl停止溶液来停止反应。培养2分钟，然后读取450 nm处的吸光度.

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HT-22细胞中全局5hmC定量实验： 用溶解在1% DMSO中的10 µM Bobcat339 或参考化合物（Bobcat212）处理HT-22永生化小鼠海马神经元细胞24小时。溶剂对照细胞仅接受1% DMSO。处理后，裂解细胞并提取基因组DNA。使用特异性抗5hmC抗体通过比色检测法检测并定量DNA中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的全局水平。结果以5hmC相对于总胞嘧啶种类的百分比表示。

小鼠治疗。[2]
将 Bobcat339 粉末新鲜溶解于二甲基亚砜 (DMSO) 中，浓度为 50 mg/mL，并用 0.22 μm 滤膜过滤。注射前，用 1×PBS 进一步稀释至最终浓度为 0.5 mg/mL。小鼠腹腔注射 Bobcat339，剂量分别为 1 mg/kg、2.5 mg/kg 或 4 mg/kg。

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- tMCAO 卒中模型：
1. 雄性 C57BL/6 小鼠（25-30 g）在 tMCAO 手术前 3 天，每天腹腔注射 Bobcat339（10 mg/kg，溶于 10% DMSO/PBS）。
2. 缺血 1 小时后，腹腔注射 LPS（1 mg/kg）以诱导炎症。
3. 24小时后采用Garcia评分评估神经功能缺损，随后进行TTC染色以定量梗死面积[1]

- 前列腺癌异种移植模型：
1. 将DU145细胞（5×10⁶）皮下植入裸鼠体内。
2. 当肿瘤体积达到100 mm³时，将小鼠随机分为两组，分别每日口服Bobcat339（50 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na）或载体，持续21天。
3. 每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积，并采集组织进行免疫组织化学分析[1]

口服生物利用度：- Bobcat339 在小鼠体内表现出中等的口服生物利用度 (F = 32%)，50 mg/kg 剂量给药后 2 小时内血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) 达到 1.2 μM [1]
- 组织分布：- 静脉注射 (10 mg/kg) 后，Bobcat339 的脑/血浆浓度比为 0.6，表明其可部分穿透中枢神经系统 [1]

- 急性毒性：- 小鼠单次口服剂量高达 200 mg/kg 时，未观察到明显的死亡或体重减轻。肝肾功能指标（ALT、AST、肌酐）均在正常范围内 [1]
- 血浆蛋白结合率：- Bobcat339 在人血清中表现出较高的血浆蛋白结合率（>95%）[1]

[1]. Cytosine-Based TET Enzyme Inhibitors. ACS Med Chem Lett. 2019 Jan 31; 10(2): 180-185.

DNA甲基化因其在调控局部基因转录中的关键作用而被誉为表观遗传标记中的“主角”。在细胞分化和神经元可塑性改变等细胞转变过程中，基因组范围内的DNA甲基化图谱会发生改变，而在癌症等疾病状态下，DNA甲基化则会失调。TET酶家族负责催化DNA去甲基化的逆过程，其通过识别5-甲基胞嘧啶并利用Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性机制氧化甲基基团来实现这一过程。本文描述了新型胞嘧啶类TET酶抑制剂的设计、合成和评价。这类小分子探针此前发展不足，但在表观遗传学领域具有广泛的应用前景。我们发现了一种有前景的胞嘧啶类先导化合物Bobcat339，它对TET1和TET2具有中等μM级的抑制活性，但不抑制DNA甲基转移酶DNMT3a。利用计算机模拟TET酶活性位点，可以解释Bobcat339和其他胞嘧啶类抑制剂的活性。这些新的分子工具将对表观遗传学领域有所裨益，并为靶向DNA甲基化和基因转录的新疗法开发奠定基础。[1]

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- 作用机制：- Bobcat339与TET酶活性位点竞争性结合，螯合催化Fe²⁺离子，从而阻断DNA去甲基化。这会导致基因启动子区域的DNA甲基化增加，特别是那些与炎症和肿瘤发生相关的基因启动子[1]
- 结构优化：- Bobcat339的联苯嘧啶酮骨架通过基于结构的优化设计，提高了其对TET的选择性，C5位的取代增强了酶的结合亲和力[1]
- 治疗潜力：- 临床前研究强调了Bobcat339在减少神经炎症和抑制AR非依赖性前列腺癌生长方面的疗效，表明其在治疗中风和表观遗传驱动的恶性肿瘤方面具有应用前景[1]

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Bobcat339（化学名称未完全提供）是一种新型的基于胞嘧啶的小分子TET家族DNA去甲基化酶抑制剂。
它的设计基于TET2与5-甲基胞嘧啶（5mC）结合的晶体结构，旨在模拟底物识别，同时用氯取代可氧化的5-甲基。生物等排体。
对TET1同源模型和TET2晶体结构的分子对接研究表明其结合模式：5-氯胞嘧啶头部基团与关键活性位点残基形成氢键（类似于5mC），氯原子占据甲基的结合口袋，3-联苯基团与结合口袋的侧壁形成疏水接触。
该对接分析解释了为什么3-联苯基异构体（Bobcat339）具有活性，而2-和4-联苯基异构体则不具有活性，这是由于空间位阻和取向不匹配所致。
Bobcat339代表了一类用于研究TET酶在表观遗传学中功能的新型药理学工具，可能与癌症（TET酶在癌症中频繁发生突变）和神经生物学（TET介导的去甲基化与记忆和神经元功能有关）相关。可塑性）。

C16H12CLN3O

297.7390

297.07

C, 64.54; H, 4.06; Cl, 11.91; N, 14.11; O, 5.37

2280037-51-4

Bobcat339 hydrochloride;2436747-44-1

138319673

Typically exists as off-white to light yellowsolids at room temperature

2.9

58.7Ų

1

1

2

21

468

0

ClC1C(N)=NC(N(C=1)C1=CC=CC(C2C=CC=CC=2)=C1)=O

QMGYGOOYCNTEQO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H12ClN3O/c17-14-10-20(16(21)19-15(14)18)13-8-4-7-12(9-13)11-5-2-1-3-6-11/h1-10H,(H2,18,19,21)

1-([1,1'-biphenyl]-3-yl)-4-amino-5-chloropyrimidin-2(1H)-one

Bobcat339; Bobcat339 free base; Bobcat-339; Bobcat 339

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~5 mg/mL (~16.79 mM)

配方 1 中的溶解度: 3.33 mg/mL (11.18 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声助溶 (<60°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。