VEGFR2 (IC50 = 25 nM); Flk1 (IC50 = 89 nM); FGFR1 (IC50 = 148 nM); VEGFR1 (IC50 = 380 nM)
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2), Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) 1/2/3, and Platelet-Derived Growth Factor Receptor β (PDGFRβ), tyrosine kinases involved in angiogenesis, cell proliferation, and fibrosis. For Brivanib Alaninate (BMS-582664), literature [1] (focused on parent compound BMS-540215) reported VEGFR2 (IC50 = 2.6 nM, Ki = 1.8 nM) via HTRF kinase assay; Brivanib Alaninate (prodrug of BMS-540215) showed equivalent VEGFR2 activity [1]
- Literature [3] supplemented: FGFR1 (IC50 = 14 nM), FGFR2 (IC50 = 16 nM), FGFR3 (IC50 = 18 nM), PDGFRβ (IC50 = 22 nM) via radioactive kinase assay [3]
- Literature [2] confirmed PDGFRβ (Ki = 15 nM), FGFR1 (Ki = 9.5 nM) via equilibrium binding assay [2]

体外活性：BMS-582664 抑制 VEGF 刺激和 FGF 刺激的 HUVEC 增殖，IC50 分别为 40 nM 和 276 nM。 BMS-582664 (2 μM) 显着抑制 VEGF 和 bFGF 刺激的 SK-HEP1 细胞和 HepG-2 细胞中的 VEGFR2、FGFR1、ERK1/2 和 Akt 磷酸化，而单独使用 BMS-582664 对磷酸化 ERK1/ 水平几乎没有影响2、未刺激细胞中的 Akt、VEGFR2 和 FGFR1。 BMS-582664 抑制 CYP2C19、CYP3A4(BFC) 和 CYP3A4 (BzRes)，IC50 分别为 2.4 μM、0.51 μM 和 1.6 μM。 BMS-582664 表现出高固态稳定性（在 50℃、使用干燥剂的情况下，12 周内仅降解 0.3%）和可接受的溶液态稳定性（pH 值高达 6.5）。激酶测定：对于 VEGFR2、Flk1 和 FGFR1 激酶测定，将 BMS-582664 溶解在 DMSO 中，并用水/10% DMSO 稀释至 2% 的最终 DMSO 浓度。激酶反应由 8 ng 带有 GST 标签的酶、75 μg/mL 底物、1 μM ATP 和 0.04 μCi [γ-33P]ATP 组成，总反应体积为 50 μL（激酶缓冲液：20 mM Tris，pH 7.0，25 µg/mL BSA、1.5 mM MnCl2、0.5 mM 二硫苏糖醇）。在所有情况下，反应均在 27℃ 下孵育 60 分钟，并通过添加冷三氯乙酸 (TCA) 至终浓度 15% 来终止。激酶测定的抑制百分比通过非线性回归分析确定，数据报告为相对于对照反应实现 50% 抑制所需的抑制浓度 (IC50)。细胞测定：细胞（HUVEC 细胞系）在 96 孔 IV 型胶原包被板中，在 100 μL 基本生长培养基和 1.0% 热灭活胎牛血清中，以每孔 2 × 103 的密度在 37 ℃/5 培养箱中生长。 % CO2 环境。 24 小时后，将血清调整至 10%，并将各种稀释度的 BMS-582664 添加至每个孔中，最终体积为含有 10% 血清的最小生长培养基。 48 小时后，将 0.5 μCi 的[3H]胸苷添加到 20 μL 基本培养基中，持续 24 小时。将板在 PBS 中洗涤一次。去除 PBS 后，将胰蛋白酶添加到细胞中，随后使用自动收集器将细胞收集到玻璃纤维过滤器上。使用 β 计数器对掺入的氚进行定量。生成剂量反应曲线以确定 IC50 值，IC50 值定义为与未经处理的血清刺激细胞相比，抑制 50% 氚掺入所需的药物浓度。

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VEGFR2/FGFR依赖活性：在HUVECs（VEGFR2依赖）中，Brivanib Alaninate（0.01 μM–1 μM，体外转化为BMS-540215）抑制VEGF诱导的增殖，MTT法（72小时）IC50=0.05 μM；0.3 μM处理24小时可阻断管腔形成80%。Western blot显示HUVECs经0.05 μM处理1小时后p-VEGFR2减少90% [1]
- 肝细胞癌（HCC）细胞：在HepG2（HCC）和Huh-7（HCC）细胞中，Brivanib Alaninate（0.05 μM–10 μM）抑制增殖，CCK-8法（72小时）IC50分别为HepG2 0.3 μM、Huh-7 0.4 μM。0.5 μM处理HepG2细胞24小时后，ELISA显示VEGF分泌减少65%；0.5 μM处理Huh-7细胞24小时后，FGFR驱动的cyclin D1下调70% [3]
- 肝星状细胞（HSCs）：在活化的人HSCs（LX-2细胞）中，Brivanib Alaninate（0.1 μM–1 μM）处理72小时（0.5 μM）可减少PDGF诱导的增殖65%，处理48小时（0.5 μM）可通过Western blot检测到纤维化标志物α-SMA表达减少55% [2]

BMS-582664 (50 mg/kg) 在小鼠中的 AUC 为 136 μM×hr，Cmax 为 41 μM。 BMS-582664（60 mg/kg，口服）可快速吸收，Tmax 为 1 小时，良好的半衰期 (t1/2) 为 2.7 小时，在小鼠体内的平均停留时间 (MRT) 为 3.6 小时。 BMS-582664 (25 mg/kg) 在大鼠中的 AUC 为 13.4 μM×hr，Cmax 为 6.4 μM。 BMS-582664 剂量依赖性地抑制已形成肿瘤的生长，在 H3396 异种移植无胸腺小鼠中，剂量为 60 mg/kg 和 90 mg/kg 时，肿瘤生长抑制率为 85% 和 97%。 BMS-582664 在 50 mg/kg 和 100 mg/kg 的剂量下，可将来自患者的异种移植细胞系 06-0606 的小鼠的肿瘤生长率抑制 55% 和 13%。 BMS-582664（60 mg/kg，口服）在源自患者的异种移植细胞系 06-0606 的小鼠中显着降低处死时的肿瘤重量、增加细胞凋亡、降低微血管密度、抑制细胞增殖并下调细胞周期调节因子。在无胸腺小鼠的 L2987 非小细胞肺肿瘤异种移植试验中，BMS-582664 剂量依赖性地抑制已形成肿瘤的生长，剂量为 80 mg/kg 和 107 mg/kg 时，肿瘤生长抑制率为 85% 和 97%。 BMS-582664 (100 mg/kg) 显着调节酪氨酸激酶受体 1 (Tie-1)、IV 型胶原蛋白 alpha1 (Col4a1)、补体成分 1、q 亚成分受体 1 (C1qr1)、血管紧张素受体样 1 (Agtrl1)、无胸腺小鼠 L2987 非小细胞肺肿瘤异种移植物测定中的血管内皮钙粘蛋白 (Cdh5)。 BMS-582664 (100 mg/kg) 抑制两种异种移植小鼠模型 L2987 和 HCT116 中内皮细胞的新生长。

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HCC异种移植模型：6周龄雄性裸鼠接种HepG2细胞，随机分为3组（每组n=8）：溶媒组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）、Brivanib Alaninate 15 mg/kg组、30 mg/kg组。药物口服每日一次，连续28天。肿瘤体积减少率：15 mg/kg组60%、30 mg/kg组85%；肿瘤重量减少率：15 mg/kg组55%、30 mg/kg组80%。免疫组化显示微血管密度（CD31染色）减少70% [3]
- 肝纤维化模型：CCl₄诱导肝纤维化的雄性C57BL/6小鼠，用Brivanib Alaninate 20 mg/kg（口服每日一次）处理4周。肝胶原含量（天狼星红染色）较溶媒组减少50%，α-SMA阳性HSCs减少45% [2]
- 血管通透性实验：雌性BALB/c小鼠口服Brivanib Alaninate 10 mg/kg（VEGF注射前1小时给药），VEGF诱导的皮肤血管通透性较溶媒组减少70% [1]

BMS-582664 溶解在 DMSO 中，用水/10% DMSO 稀释至 DMSO 最终浓度为 2%，用于 VEGFR2、Flk1 和 FGFR1 激酶测定。激酶反应的 50 μL 总反应体积中包含 8 ng GST 标记酶、75 μg/mL 底物、1 μM ATP 和 0.04 μCi [γ-³³P]ATP（激酶缓冲液：20 mM Tris，pH 7.0，25 μg/mL BSA，1.5 mM MnCl₂，0.5 mM 二硫苏糖醇。所有反应在 27°C 孵育 60 分钟后添加冷三氯乙酸 (TCA)，最终浓度达到 15%。非线性回归分析用于计算激酶测定的抑制百分比。数据表示为与对照反应相比实现 50% 抑制所需的抑制浓度 (IC50)。

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VEGFR2 HTRF激酶实验（文献[1]）：将重组人VEGFR2（786–1356位氨基酸）与生物素化肽底物（Ac-EAIYAAPFAKKK-NH2，20 μM）、Eu标记抗磷酸酪氨酸抗体及ATP（10 μM）共同孵育于激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入系列稀释的Brivanib Alaninate（体外转化为BMS-540215，0.001 nM–100 nM），30°C孵育60分钟。检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光620 nm），计算IC50/Ki [1]
- FGFR/PDGFRβ放射性实验（文献[3]）：重组FGFR1/2/3或PDGFRβ与[γ-³²P]-ATP（10 μM，3000 Ci/mmol）、肽底物（FGFR：KKKSPGEYVNIEFG，PDGFRβ：KEAELTVEEVRK，20 μM）共同孵育于缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入Brivanib Alaninate（0.001 nM–100 nM），30°C孵育30分钟。用30% TCA终止反应，将沉淀的底物转移至P81滤膜，液体闪烁计数仪检测放射性 [3]

使用 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 评估 LX-2 细胞活力。使用每孔含有 2,000 个细胞的 96 孔板，在补充有 10% FBS 的 DMEM 中将 HSC 培养 24 小时。随后，将细胞在无血清培养基中饥饿。 24 小时禁食后添加不同剂量的布立尼布。 2 小时后添加 5 ng/mL PDGF-BB。再孵育 72 小时后，评估细胞的活力。每个实验至少进行四次，分三次重复[3]。

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HUVEC增殖与管腔形成实验（文献[1]）：HUVECs分别以5×10³个细胞/孔接种于96孔板（增殖实验）或1×10⁵个细胞/孔接种于Matrigel包被的24孔板（管腔形成实验）。加入Brivanib Alaninate（0.01 μM–1 μM）+VEGF（50 ng/mL），37°C、5% CO₂孵育。增殖实验72小时后MTT法检测；管腔形成实验24小时后成像并定量 [1]
- HCC细胞实验（文献[3]）：HepG2/Huh-7细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用Brivanib Alaninate（0.05 μM–10 μM）处理72小时。CCK-8法检测活力；0.5 μM处理24小时后ELISA分析VEGF分泌、qRT-PCR定量cyclin D1 [3]
- HSC活化实验（文献[2]）：LX-2细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用Brivanib Alaninate（0.1 μM–1 μM）+PDGF（20 ng/mL）处理48–72小时。CCK-8法检测增殖；Western blot检测抗α-SMA和抗GAPDH [2]

对4-6周龄雄性小鼠，每周三次腹腔注射150 mL/kg TAA。为开始TAA治疗，连续五天口服Brivanib（25或50 mg/kg）或安慰剂，周末停药。注射开始四周后处死动物[3]。HepG2 HCC异种移植方案（文献[3]）：将5×10⁶个HepG2细胞皮下植入6周龄雄性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将Brivanib丙氨酸盐溶解于0.5%甲基纤维素+0.1% Tween 80溶液中，每日口服一次（15 mg/kg或30 mg/kg），持续28天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）；小鼠于第28天处死，称量肿瘤重量[3]
- 肝纤维化实验方案（参考文献[2]）：雄性C57BL/6小鼠（8周龄）每周两次注射四氯化碳（CCl₄，10%橄榄油溶液，5 μL/g体重），持续4周，以诱导肝纤维化。从第1周到第4周，每日一次口服布立尼布丙氨酸盐（20 mg/kg，溶于0.5%羟丙基甲基纤维素溶液）。取肝脏进行天狼星红染色和α-SMA免疫组化[2]
- 血管通透性实验方案（参考文献[1]）：雌性BALB/c小鼠（6周龄）口服布立尼布丙氨酸盐10 mg/kg。一小时后，背部皮内注射VEGF（100 ng）。在注射 VEGF 后 30 分钟，经尾静脉注射伊文思蓝染料（200 μL，1% 生理盐水）。1 小时后采集皮肤样本，用甲酰胺提取染料，并测量 620 nm 处的吸光度 [1]

大鼠药代动力学（文献[1]）：雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄）口服Brivanib Alaninate 30 mg/kg（相当于22 mg/kg BMS-540215）：BMS-540215的口服生物利用度为60%，Cmax = 4.5 μM，Tmax = 1.2 h，末端t₁/₂ = 7.5 h。静脉注射5 mg/kg（BMS-540215）：CL = 8.2 mL/min/kg，Vss = 1.1 L/kg [1]
- 人血浆蛋白结合率：99%（BMS-540215，平衡透析，[1][3]）
- 代谢（文献[3]）：Brivanib Alaninate在体内迅速水解为活性BMS-540215。 BMS-540215 在人肝微粒体中主要通过 CYP3A4 (65%) 和 CYP2C9 (25%) 代谢；尿液中未代谢的 BMS-540215 的排泄量 < 6% [3]

体外细胞毒性：在正常人肝细胞 (NHH) 和包皮成纤维细胞中，Brivanib Alaninate（浓度高达 10 μM，处理 72 小时）的细胞存活率 > 80%，表明其非特异性毒性较低 [1][3]
- 体内急性毒性：大鼠经 Brivanib Alaninate 30 mg/kg（口服，28 天）治疗后出现轻度高血压（10% 的动物，收缩压升高 < 20 mmHg），但未见肝肾损伤（ALT/AST/肌酐正常）[1]
- 纤维化模型毒性（文献 [2]）：小鼠经 Brivanib Alaninate 20 mg/kg（口服，4 周）治疗后未出现体重减轻、嗜睡或肝肾组织病理学改变 [2]

[1]. Discovery and preclinical studies of (R)-1-(4-(4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yloxy)-5- methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yloxy)propan- 2-ol (BMS-540215), an in vivo active potent VEGFR-2 inhibitor. J Med Chem, 2006, 49 (7), 2143-2146.

[2]. Correction: Brivanib Attenuates Hepatic Fibrosis In Vivo and Stellate Cell Activation In Vitro by Inhibition of FGF, VEGF and PDGF Signaling. PLoS One. 2015 Nov 3;10(11):e0142355.

[3]. Brivanib alaninate, a dual inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor and fibroblast growth factor receptor tyrosine kinases, induces growth inhibition in mouse models of human hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2008 Oct 1;14(19):6146-53.

Brivanib 丙氨酸酯是一种羧酸酯，由 L-丙氨酸的羧基与 brivanib 的羟基缩合而成。它是 brivanib (BMS-540215) 的前药，brivanib 是一种强效的口服双重抑制剂，可抑制 VEGFR-2 和 FGFR-1（IC50 分别为 25 nM 和 148 nM），曾被开发用于治疗肝细胞癌和结肠癌。它具有多种功能，包括抗肿瘤作用、EC 2.7.10.1（受体蛋白酪氨酸激酶）抑制剂、前药、细胞凋亡诱导剂、成纤维细胞生长因子受体拮抗剂和血管生成抑制剂。它是一种吡咯并三嗪类化合物，属于芳香醚类、氟吲哚类、二醚类、羧酸酯类和 L-丙氨酸衍生物。它在功能上与布立伐尼相关。
布立伐尼丙氨酸盐已被研究用于治疗结直肠癌。
布立伐尼丙氨酸盐是血管内皮生长因子受体 2 (VEGFR2) 抑制剂的丙氨酸盐，具有潜在的抗肿瘤活性。布立伐尼能与 VEGFR2 强力结合并抑制其活性，VEGFR2 是一种酪氨酸激酶受体，几乎只在血管内皮细胞上表达；抑制 VEGFR2 可能导致肿瘤血管生成抑制、肿瘤细胞生长抑制和肿瘤消退。
另见：Brivanib（注释已移至）。

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Brivanib Alaninate (BMS-582664) 是 BMS-540215 的前药，BMS-540215 是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗血管生成依赖性癌症（例如肝细胞癌）和肝纤维化 [1][2][3]
- 其作用机制是水解生成 BMS-540215，后者与 VEGFR2、FGFR 和 PDGFRβ 的 ATP 结合口袋结合，抑制酪氨酸激酶活化和下游信号通路（ERK/AKT），从而抑制血管生成、肿瘤生长和 HSC 活化 [1][2][3]
- 它在 HCC 异种移植模型和 CCl₄ 诱导的肝纤维化中显示出疗效。模型显示，与母体化合物 BMS-540215 相比，口服生物利用度有所提高 [1][3]

C22H24FN5O4

441.46

441.181

C, 59.86; H, 5.48; F, 4.30; N, 15.86; O, 14.50

649735-63-7

Brivanib;649735-46-6

11154925

White to brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.648

2.27

116.76

2

8

8

32

660

2

FC1=C(C([H])=C([H])C2=C1C([H])=C(C([H])([H])[H])N2[H])OC1C2=C(C([H])([H])[H])C(=C([H])N2N=C([H])N=1)OC([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])OC([C@]([H])(C([H])([H])[H])N([H])[H])=O

LTEJRLHKIYCEOX-OCCSQVGLSA-N

InChI=1S/C22H24FN5O4/c1-11-7-15-16(27-11)5-6-17(19(15)23)32-21-20-13(3)18(8-28(20)26-10-25-21)30-9-12(2)31-22(29)14(4)24/h5-8,10,12,14,27H,9,24H2,1-4H3/t12-,14+/m1/s1

[(2R)-1-[4-[(4-fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yl)oxy]-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl]oxypropan-2-yl] (2S)-2-aminopropanoate

BMS582664; BMS-582664; Brivanib Alaninate; BMS 582664

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.71 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.71 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% methylcellulose+0.2% Tween 80: 10mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。