Anticancer
Protein synthesis inhibitor. The major mechanism responsible for antineoplastic activity at the molecular level has been attributed to inhibition of protein synthesis. Such inhibition occurs via interference at the peptidyltransferase site, thus preventing peptide bond formation [2]
Down-regulator of c-MYC oncoprotein expression [2]

首次从埃塞俄比亚用于治疗癌症的布鲁氏菌中分离出Bruceantin，并在小鼠中观察到其对B16黑色素瘤、结肠癌38、L1210和P388白血病的活性。随后启动了I期和II期临床试验，但没有观察到客观的肿瘤消退，临床开发也终止了。最近，已经对许多白血病、淋巴瘤和骨髓瘤细胞系研究了Bruceantin的活性。诱导细胞分化，下调c-MYC，表明c-MYC下调与诱导细胞分化或细胞死亡之间存在机制相关性。HL-60和RPMI 8226细胞系的治疗诱导了凋亡，这涉及胱天蛋白酶和线粒体途径。此外，一项使用RPMI 8226人SCID异种移植物的体内研究表明，Bruceantin诱导早期和晚期肿瘤的消退，并且在没有明显毒性的情况下促进了这些显著的抗肿瘤反应。在用Bruceantin治疗的动物的肿瘤中，细胞凋亡显著升高。总之，在培养和异种移植物模型中，Bruceantin会干扰白血病、淋巴瘤和骨髓瘤细胞的生长。这种类型的反应表明，应重新研究Bruceantin对血液系统恶性肿瘤的临床疗效。[1]

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通过用Bruceantin处理24小时，培养的RPMI 8226细胞中的c-MYC被强烈下调。对于U266和H929细胞，布鲁氏菌蛋白没有以这种方式调节c-MYC。在三种细胞系中诱导了细胞凋亡。在RPMI 8226细胞中，凋亡是通过蛋白酶原的蛋白水解加工和聚ADP核糖聚合酶的降解发生的。线粒体途径也参与其中[2]。

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Bruceantin 下调多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226中c-MYC蛋白的表达。用bruceantin (10 ng/ml) 处理4小时可中度下调c-MYC，处理24小时可完全下调c-MYC [2]
通过4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察凋亡小体，bruceantin 诱导多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226、U266和H929发生凋亡。诱导凋亡的IC₅₀在RPMI 8226细胞中为7.0 ng/ml (13 nM)，在U266细胞中为26.8 ng/ml (49 nM)，在H929细胞中为63.3 ng/ml (115 nM) [2]
Bruceantin 诱导的凋亡依赖于caspase的激活，因为广谱caspase抑制剂Z-VAD能将凋亡降低至未处理细胞的水平 [2]
用bruceantin (10 ng/ml) 处理RPMI 8226细胞可诱导caspase-3/7样活性，在12小时观察到最大3.5倍的诱导 [2]
蛋白质印迹分析显示，用bruceantin (5 ng/ml及以上浓度) 处理RPMI 8226细胞24小时，导致procaspase-3、-8、-9、BID和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)发生蛋白水解切割 [2]
Bruceantin 通过线粒体途径诱导凋亡。用bruceantin (10-40 ng/ml) 处理RPMI 8226细胞导致线粒体膜电位(ΔΨm)降低，这是剂量和时间依赖性的，处理18-24小时后约90%的细胞发生去极化 [2]
Bruceantin (10 ng/ml) 在U266或H929细胞系中未强烈下调c-MYC。在U266细胞中，c-MYC水平低且无变化；在H929细胞中，24小时观察到轻微上调 [2]

因为RPMI 8226细胞是最敏感的，所以它们被用于异种移植物模型。Bruceantin治疗（2.5-5mg/kg）导致肿瘤显著消退，无明显毒性。与对照组肿瘤（14%）相比，Bruceantin治疗动物的肿瘤细胞凋亡率显著升高（37%）[2]。

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在携带RPMI 8226人多发性骨髓瘤异种移植瘤的SCID小鼠中，用bruceantin (2.5-5 mg/kg，每3天腹腔注射一次) 治疗可导致显著的肿瘤消退并完全抑制肿瘤生长，且无明显毒性 [2]
在一项使用6周龄雌性SCID小鼠的研究中，第35天时，用bruceantin (5, 7.5或10 mg/kg) 治疗的组肿瘤体积为0 mm³，而溶媒对照组为126 mm³ (P < 0.0001) [2]
在一项使用13周龄雌性SCID小鼠的研究中，第46天时，bruceantin (1.25 mg/kg) 组肿瘤体积为26 mm³，bruceantin (2.5或5 mg/kg) 组为0 mm³，而溶媒对照组为218 mm³ (P ≤ 0.0001) [2]
在一项使用6周龄雄性SCID小鼠的研究中，第35天时，用bruceantin (2.5或5 mg/kg) 治疗的组肿瘤体积为0 mm³，而溶媒对照组为274 mm³ (P < 0.0001) [2]
在已建立的肿瘤中（约接种后40天开始治疗），与溶媒对照组相比，用bruceantin (2.5或5.0 mg/kg，每3天一次) 治疗在所有三项实验中也诱导了统计学上显著的肿瘤消退 [2]
对治疗动物肿瘤的组织病理学分析显示，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法测定，与对照组肿瘤(14.0%)相比，治疗组肿瘤凋亡细胞显著增加(36.6%) (P = 0.031)，并且有丝分裂指数显著降低(2.2% vs. 对照组的12.5%, P = 0.019) [2]

线粒体膜电位分析[2]
3,3′-二己基氧杂碳菁碘化物（DiOC6）是一种用于测量线粒体膜电位（ΔΨm）的染料。简而言之，细胞（5×106）用Bruceantin（2.5、5、10、20或40 ng/ml）处理6、12、18或24小时。在药物处理后收集细胞前15分钟，向细胞中加入40 nm DiOC6。细胞用PBS洗涤一次，然后重新悬浮在含有40 nm DiOC6和30μg/ml碘化丙啶的300μl PBS中。通过流式细胞术分析DiOC6的荧光强度，激发和发射设置分别为484和500nm。加入碘化丙啶以清除死细胞。直方图仅显示碘化丙啶阴性细胞。

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Caspase-3/7样活性分析[2]
Apo ONE同源Caspase-3/7检测试剂盒用于测量Caspase-3/6的活性。细胞（1.5×104）在黑色96孔板中用Bruceantin（10ng/ml）处理6、12、18或24小时。在处理结束时，将裂解缓冲液和底物（Z-DEVD-罗丹明110）混合并加入细胞中。在通过胱天蛋白酶-3/7活性和499nm激发连续切割和去除DEVD肽后，罗丹明110离开基团变得强烈荧光。发射最大值为521 nm。产生的荧光产物的量与样品中存在的胱天蛋白酶-3/7切割活性的量成正比。样品测量一式三份。结果以相对于对照（DMSO处理的细胞）的诱导倍数表示。

c-MYC。如前所述，通过免疫印迹评估c-MYC蛋白的表达。简言之，细胞（1000万）用布鲁塞尔（25 ng/ml）或布鲁氏菌素（10 ng/ml）处理，并在4或24小时后收获。全细胞颗粒用洗涤剂裂解缓冲液[1ml/107个细胞、50 mm Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、150 mm NaCl、1 mm DTT、0.5 mm EDTA、1%NP40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、100μg/ml苯甲基磺酰氟、1μg/ml抑肽酶、2μg/ml亮肽和100μm钒酸钠]裂解，以获得蛋白质裂解物，并使用双辛可宁酸试剂盒。由于c-MYC不稳定，细胞裂解物没有冷冻，而是储存在4°c下，直到所有裂解物都准备好用于特定细胞系，然后进行蛋白质印迹。总蛋白（30μg）通过10%SDS-PAGE分离，电印迹到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%脱脂奶粉封闭过夜。将膜与在1%阻断溶液中制备的2.5μg/ml一抗溶液在室温下孵育2小时，用PBS-T（含0.1%、v/v和吐温20的PBS）洗涤三次15分钟，并在37°C下与1:2500稀释的辣根过氧化物酶偶联二抗孵育30分钟。在PBS-T中再次洗涤印迹三次，每次10分钟，并通过增强化学发光进行显影。将膜暴露于柯达Biomax胶片，并使用柯达1D图像分析软件对所得胶片进行分析。然后剥离膜并重新定位β-肌动蛋白。[2]

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Caspase-3、-8、-9、BID和聚ADP核糖聚合酶（PARP）。通过免疫印迹法评估半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、-8、-9、BID和PARP蛋白的表达。简而言之，细胞（1000万）用布鲁氏菌素（2.5、5、10、20或40 ng/ml）处理，24小时后收获。全细胞颗粒用洗涤剂裂解缓冲液[1 ml/107个细胞，62.5 mm Tris-HCl缓冲液（pH 6.8），6 m尿素，10%甘油，2%SDS，0.00125%溴酚蓝和5%β-巯基乙醇]裂解，然后超声处理15秒，在65°C下孵育15分钟以获得蛋白质裂解物，并使用双辛可宁酸试剂盒定量蛋白质浓度。总蛋白（30μg）通过7.5-15%SDS-PAGE分离，电印迹到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%脱脂奶粉封闭过夜。将膜与抗天冬氨酸蛋白酶-3单克隆抗体（1:100）、抗天冬氨酰蛋白酶-8多克隆抗体（1:200）、抗天门冬氨酸蛋白酶-9多克隆抗体。[2]

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凋亡定量： RPMI 8226、U266和H929细胞用不同浓度的bruceantin (2.5, 5, 10, 20或40 ng/ml) 处理24小时。然后洗涤细胞，用甲醇:乙酸(1:1)固定，并用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(1 µg/ml)染色。通过荧光显微镜观察并计数凋亡细胞核。构建剂量反应曲线以计算诱导凋亡的IC₅₀。在一些实验中，在bruceantin处理前1小时加入广谱caspase抑制剂Z-VAD [2]
c-MYC的免疫印迹分析： 细胞用bruceantin (10 ng/ml) 处理，在4或24小时后收集。全细胞沉淀用去垢剂裂解缓冲液裂解。蛋白质裂解物(30 µg)通过10% SDS-PAGE分离，电转印并封闭。膜与抗c-MYC的一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育，并通过增强化学发光法显影。膜剥离后重新用β-肌动蛋白抗体探测作为上样对照 [2]
Caspases、BID和PARP的免疫印迹分析： 细胞用bruceantin (2.5-40 ng/ml) 处理24小时并收集。使用含有尿素、甘油、SDS和β-巯基乙醇的不同裂解缓冲液制备蛋白质裂解物，然后进行超声处理和65°C孵育。蛋白质(30 µg)通过7.5-15% SDS-PAGE分离，转印，并使用类似检测方法用抗caspase-3、caspase-8、caspase-9、BID或PARP的抗体进行探测 [2]
线粒体膜电位(ΔΨm)分析： 细胞用bruceantin (2.5-40 ng/ml) 处理6、12、18或24小时。收集前15分钟，加入40 nM DiOC₆染料。细胞洗涤后，重悬于含有DiOC₆和碘化丙啶的PBS中，并通过流式细胞术分析。碘化丙啶用于排除死细胞 [2]
Caspase-3/7样活性分析： 细胞用bruceantin (10 ng/ml) 在黑色96孔板中处理6-24小时。使用caspase-3/7检测试剂盒，将裂解缓冲液和底物Z-DEVD-罗丹明110加入细胞中。测量由底物切割产生的荧光，激发波长499 nm，发射波长521 nm。活性表示为相对于对照的诱导倍数 [2]

将 RPMI 8226 细胞 (1 × 10⁷) 皮下注射到 6 周龄或 13 周龄雄性和/或雌性 SCID 小鼠的右后侧腹部。注射体积为 0.1 ml。注射前剃除接种区域的毛发。接种后约 10-14 天，或当肿瘤大小达到 5 mm 时，每 3 天腹腔注射一次布鲁辛汀（0-12 mg/kg，溶于 100% 乙醇，超声处理，并用生理盐水稀释至 5% 乙醇溶液）。RPMI 8226 细胞接种后约 40 天，停止布鲁辛汀治疗。将载体处理的对照荷瘤组分为两组。部分小鼠继续接受载体处理，其余小鼠每3天接受一次布鲁辛汀（2.5或5.0 mg/kg）治疗。每周称量动物体重两次，并每日观察。每周测量肿瘤两次。肿瘤体积以mm³为单位，根据公式(D × d × 0.2/6) × π计算，其中D为长径，d为短径。[2]

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异种移植模型：将RPMI 8226细胞（1×10⁷）皮下注射到6周龄或13周龄雄性或雌性SCID小鼠的右后侧腹部。接种后约10-14天，或肿瘤大小达到约5毫米时，开始治疗[2]
药物配制和给药：将布鲁西坦溶解于100%乙醇中，超声处理，然后用生理盐水稀释至最终5%乙醇溶液。该溶液每3天腹腔注射一次，剂量范围为0至12 mg/kg[2]
监测：每周称量动物体重两次，并每日观察。每周测量肿瘤两次，并使用公式(D × d × 0.2 / 6) × π计算肿瘤体积，其中D为长径，d为短径[2]
研究终点：肿瘤接种后约40天终止治疗。在一些实验中，载体对照组随后被分成两组，一部分小鼠继续接受载体治疗，另一部分小鼠开始每3天接受一次布鲁辛汀（2.5或5.0 mg/kg）治疗，以评估其对已形成肿瘤的影响[2]

该手稿提供了理论计算：在小鼠中，静脉注射 2.5 mg/kg 体重的剂量预计可产生 75 µM 的理论血药浓度。体内研究中使用的剂量（腹腔注射，每 3 天一次）可能导致平均血药浓度远低于此理论水平 [2]。对于人类，I 期临床试验的推荐剂量约为 5 mg/m²。作者计算得出，理论上，该剂量在普通人体内可产生约 3.3 µM 的血药浓度 [2]。

在SCID小鼠异种移植研究中，较高剂量的布鲁辛汀（高达12 mg/kg）会导致体重下降或死亡。雄性小鼠似乎比雌性小鼠更敏感[2]。较低剂量（例如，每3天2.5和5.0 mg/kg）的布鲁辛汀可诱导肿瘤消退，且不引起明显的毒性[2]。该手稿引用了之前的I期临床试验，指出低血压、恶心和呕吐是较高剂量下常见的副作用，而血液学毒性为中度至轻微，主要表现为血小板减少症[2]。

[1]. Antitumor activity of bruceantin: an old drug with new promise. J Nat Prod. 2004 Feb;67(2):269-72.
[2]. Multiple myeloma regression mediated by bruceantin. Clin Cancer Res. 2004 Feb 1;10(3):1170-9.

布鲁辛汀是一种三萜类化合物。
已有报道称布鲁辛汀存在于苦痢疾木犀草（Brucea antidysenterica）和爪哇木犀草（Brucea javanica）中，并有相关数据。
布鲁辛汀是一种从苦痢疾木犀草中分离得到的三萜类苦木素抗肿瘤抗生素。布鲁辛汀抑制肽基转移酶的延伸反应，从而降低蛋白质和DNA的合成。布鲁辛汀还具有抗阿米巴和抗疟活性。(NCI04)

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布鲁辛汀是一种从苦木属植物（苦木科）中获得的苦木素类化合物[2]。
在本研究之前，布鲁辛汀已在三项针对不同实体瘤患者的I期临床试验和两项针对转移性乳腺癌和恶性黑色素瘤的II期临床试验中进行了评估。在 II 期临床试验中未观察到客观的肿瘤消退，临床开发因此终止 [2]。
这项研究表明，应重新研究布鲁辛汀对多发性骨髓瘤和其他血液系统恶性肿瘤的临床疗效，特别是那些 c-MYC 高表达且可被该化合物下调的肿瘤 [2]。
布鲁辛汀在 RPMI 8226 细胞中的促凋亡作用涉及 caspase 激活、线粒体途径（BID 裂解、ΔΨm 丢失），并伴有 c-MYC 的强烈下调 [2]。

C28H36O11

548.5788

548.225

C, 61.30; H, 6.61; O, 32.08

41451-75-6

41451-75-6 （Bruceantin); 79439-84-2 (Bruceantinoside B); 95258-15-4 (Yadanzioside A); 95258-18-7 (Yadanzioside B); 95258-16-5 (Yadanzioside C)

5281304

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

731.0±60.0 °C at 760 mmHg

239.4±26.4 °C

0.0±5.4 mmHg at 25°C

1.598

2.96

165.89

3

11

6

39

1200

10

CC1=C(C(=O)C[C@]2([C@H]1C[C@@H]3[C@]45[C@@H]2[C@H]([C@@H]([C@]([C@@H]4[C@H](C(=O)O3)OC(=O)/C=C(\C)/C(C)C)(OC5)C(=O)OC)O)O)C)O

IRQXZTBHNKVIRL-GOTQHHPNSA-N

InChI=1S/C28H36O11/c1-11(2)12(3)7-17(30)39-20-22-27-10-37-28(22,25(35)36-6)23(33)19(32)21(27)26(5)9-15(29)18(31)13(4)14(26)8-16(27)38-24(20)34/h7,11,14,16,19-23,31-33H,8-10H2,1-6H3/b12-7+/t14-,16+,19+,20+,21+,22+,23-,26-,27+,28-/m0/s1

Picras-3-en-21-oic acid, 15-((3,4-dimethyl-1-oxo-2-pentenyl)oxy)-13,20-epoxy-3,11,12-trihydroxy-2,16-dioxo-, methyl ester, (11beta,12alpha,15beta(E))- (9CI)

(-)-Bruceantin; NCI165563; NCI-165563; NCI 165563; NSC165563; NSC-165563; BRUCEANTIN; 41451-75-6; Bruceantine; NSC 165563; NSC-165563; NSC165563; Bruceantin(NSC165563); S3NW88DI4T;NSC 165563;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~182.29 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。