The target of Compound E is γ-secretase, a multi-subunit membrane protease complex (composed of presenilin, nicastrin, Aph-1, and Pen-2) involved in the cleavage of type I transmembrane proteins. For human γ-secretase, the half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) in vitro enzyme activity assay is 1.3 nM [1]
; the IC₅₀ values for inhibiting amyloid-β (Aβ)₄₀ and Aβ₄₂ production in HEK293 cells overexpressing APP are 3.1 nM and 2.9 nM, respectively [1]
. It exhibits high selectivity for γ-secretase, with no significant inhibition of other proteases (e.g., α-secretase, β-secretase, caspases) at concentrations up to 10 μM [1]

化合物 E 在 50 μM 剂量下可抑制 T47D 和 MCF-7 细胞系增殖不到 50% [1]。

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1. 抑制γ-分泌酶活性及Aβ生成：
- Compound E以浓度依赖方式抑制从HEK293细胞纯化的人类γ-分泌酶的催化活性，IC₅₀为1.3 nM（荧光肽切割实验）。10 nM浓度时，对γ-分泌酶介导的肽底物切割抑制率>90% [1]
- 在稳定表达人类APP（瑞典突变型，K670N/M671L）的HEK293细胞中，0.1–100 nM Compound E剂量依赖性减少Aβ₄₀和Aβ₄₂的分泌（ELISA检测）：3.1 nM抑制50% Aβ₄₀生成，2.9 nM抑制50% Aβ₄₂生成；10 nM浓度时，Aβ₄₀和Aβ₄₂水平分别降低85%和88% [1]
2. 下调早老素1（PS1）异二聚体：
- 在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和HEK293细胞中，1–10 μM Compound E处理24–48小时，剂量依赖性降低PS1异二聚体（γ-分泌酶复合物中PS1的活性形式）水平40–70%（Western blot），未观察到未成熟PS1单体水平的显著变化 [1]
3. 乳腺癌细胞的抗增殖及促凋亡活性：
- Compound E对乳腺癌细胞系呈浓度依赖性抗增殖作用，IC₅₀分别为：MCF-7（1.2 μM）、T47D（1.5 μM）、MDA-MB-231（3.8 μM）（MTT实验） [2]
- 诱导MCF-7细胞G2/M期阻滞：1 μM处理24小时后，G2/M期细胞比例从溶媒组的12%升至35%（流式细胞术）。Western blot显示G2/M转换关键调控因子Cyclin B1（2.3倍）和磷酸化Cdc2（Tyr15位点，3.1倍）表达上调 [2]
- 2 μM Compound E诱导MCF-7细胞凋亡：早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）从溶媒组的5%升至28%，晚期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁺）从3%升至22%（流式细胞术）。剪切型caspase-3（2.8倍）和剪切型PARP（2.5倍）表达上调（Western blot） [2]

1. 基于荧光肽的γ-分泌酶活性实验：
- 从过表达人类早老素1（PS1）、尼卡斯特林、Aph-1和Pen-2（γ-分泌酶复合物核心亚基）的HEK293细胞中制备γ-分泌酶 [1]
- 实验在反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 6.8、5 mM EDTA、0.25% CHAPSO、1 mM DTT）中进行。系列浓度的Compound E（0.01–100 nM）或溶媒与γ-分泌酶（10 μg蛋白）在室温下预孵育15分钟 [1]
- 加入荧光肽底物（源自APP C端片段，C端标记7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）），终浓度20 μM，启动反应 [1]
- 反应混合物在37°C孵育2小时，用酶标仪检测荧光强度（激发光355 nm，发射光460 nm），AMC的释放表明γ-分泌酶介导的肽切割 [1]
- 计算相对于溶媒对照组的γ-分泌酶活性抑制百分比，从剂量-反应曲线推导IC₅₀值 [1]

1. APP过表达HEK293细胞的Aβ生成抑制实验：
- 稳定表达人类APP（瑞典突变型，K670N/M671L）的HEK293细胞以5×10⁴个/孔接种于24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培养基孵育过夜 [1]
- 加入系列浓度的Compound E（0.1–100 nM）或溶媒，细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时 [1]
- 收集培养上清液，使用Aβ₄₀和Aβ₄₂特异性夹心ELISA试剂盒检测其浓度 [1]
- 计算相对于溶媒对照组的Aβ生成抑制百分比，确定IC₅₀值 [1]
2. PS1异二聚体Western blot分析：
- SH-SY5Y或HEK293细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，孵育过夜后，用1–10 μM Compound E处理24–48小时 [1]
- 用预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，取等量蛋白（每泳道30 μg）进行10% SDS-PAGE电泳（非还原条件，不加β-巯基乙醇），随后转移至PVDF膜 [1]
- 膜与抗PS1 N端的一抗孵育，再加入HRP标记二抗。通过化学发光显影PS1异二聚体（≈50 kDa）和单体（≈30 kDa）条带，密度测定法定量条带强度 [1]
3. 乳腺癌细胞增殖（MTT）实验：
- 乳腺癌细胞系（MCF-7、T47D、MDA-MB-231）以5×10³个/孔接种于96孔板，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基孵育过夜 [2]
- 加入系列浓度的Compound E（0.1–20 μM），细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育72小时 [2]
- 每孔加入MTT溶液（5 mg/mL），孵育4小时后，DMSO溶解甲瓒晶体，570 nm处测定吸光度，从剂量-反应曲线计算IC₅₀值 [2]
4. 细胞周期及凋亡分析（流式细胞术）：
- MCF-7细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，用1–2 μM Compound E处理24小时 [2]
- 细胞周期分析：收集细胞，70%乙醇-20°C固定过夜，用含RNase A的碘化丙啶（PI）染色，流式细胞术分析G0/G1、S、G2/M期细胞比例 [2]
- 凋亡分析：收集细胞，冷PBS洗涤，避光条件下用Annexin V-FITC和PI染色30分钟，流式细胞术定量早期和晚期凋亡细胞 [2]
5. 细胞周期及凋亡标志物Western blot分析（乳腺癌细胞）：
- MCF-7细胞用1–2 μM Compound E处理24小时后，用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解 [2]
- 取等量蛋白（每泳道30 μg）进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜后，加入抗Cyclin B1、磷酸化Cdc2（Tyr15）、剪切型caspase-3、剪切型PARP及β-肌动蛋白（内参）一抗 [2]
- 加入HRP标记二抗，化学发光显影蛋白条带，密度测定法定量条带强度 [2]

[1]. Pharmacological knock-down of the presenilin 1 heterodimer by a novel gamma -secretase inhibitor: implications for presenilin biology. J Biol Chem. 2001 Nov 30;276(48):45394-402.

[2]. Inhibition of gamma-secretase induces G2/M arrest and triggers apoptosis in breast cancer cells. Br J Cancer. 2009 Jun 16;100(12):1879-88.

Compound E is an L-alanine derivative that is the amide obtained by formal condensation of the carboxy group of N-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanine with the amino group of (3S)-3-amino-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4-benzodiazepin-2-one. An inhibitor of memapsin 2 (gamma-secretase). It has a role as an EC 3.4.23.46 (memapsin 2) inhibitor. It is a 1,4-benzodiazepinone, a L-alanine derivative and a difluorobenzene.

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1. Compound E is a potent, selective small-molecule inhibitor of γ-secretase, developed as a pharmacological research tool to study γ-secretase biology and its role in diseases [1]
2. Mechanism of action: Compound E binds to the active site of the γ-secretase complex, inhibiting its proteolytic activity. This blocks the cleavage of APP (amyloid precursor protein) into amyloid-β (Aβ) peptides (key mediators of Alzheimer’s disease pathogenesis) and downregulates the active PS1 heterodimer. In breast cancer cells, it induces G2/M phase arrest by upregulating Cyclin B1 and phosphorylated Cdc2 (Tyr15), and triggers apoptosis via activation of the caspase cascade [1,2]
3. Research applications:
- Widely used to investigate the role of γ-secretase and Aβ in Alzheimer’s disease [1]
- Utilized as a tool compound to study the biological functions of presenilin (PS1/PS2) and γ-secretase substrates (e.g., Notch, APP) [1]
- Applied in preclinical research to explore γ-secretase inhibition as a potential therapeutic strategy for breast cancer and other malignancies [2]
4. Chemical feature: It belongs to the peptidomimetic chemical class, with a structure optimized for high affinity and selectivity for γ-secretase [1]

C27H24F2N4O3

490.5013

490.181

209986-17-4

(1R,3S)-Compound E;504428-17-5

11306390

White to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

778.6±60.0 °C at 760 mmHg

424.7±32.9 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.624

3.22

90.87

2

6

6

36

837

2

C[C@@H](C(=O)N[C@@H]1C(=O)N(C2=CC=CC=C2C(=N1)C3=CC=CC=C3)C)NC(=O)CC4=CC(=CC(=C4)F)F

JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N

InChI=1S/C27H24F2N4O3/c1-16(30-23(34)14-17-12-19(28)15-20(29)13-17)26(35)32-25-27(36)33(2)22-11-7-6-10-21(22)24(31-25)18-8-4-3-5-9-18/h3-13,15-16,25H,14H2,1-2H3,(H,30,34)(H,32,35)/t16-,25+/m0/s1

(S,S)-2-[2-(3,5-Difluorophenyl)-acetylamino]-N-(1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-yl)-propionamide

Compound E (secretase inhibitor); GSI XXI; DuPont E; Compound E; GSI-XXI; ɣ-secretase inhibitor XXI; GSIXXI;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~203.87 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.88 mg/mL (5.87 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 28.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.10 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.10 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。