CWHM-12

αvβ8 (IC50 = 0.2 nM); αvβ3 (IC50 = 0.8 nM); αvβ6 (IC50 = 1.5 nM); αvβ1 (IC50 = 1.8 nM); αvβ5 (IC50 = 61 nM)
The therapeutic target is αv-containing integrins (αv integrin), specifically the αv integrin subtypes that bind to the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence [1]
The therapeutic target is a subset of RGD-binding integrins [2]

此外，αvβ5 (IC50=61 nM) 和 αIIbβ3/α2β1/α10β1 (IC50>5000 nM) 被 CWHM-12 (CWHM 12) 弱抑制。在体外配体结合测定中，CWHM-12 对所有五个潜在 β 亚基结合伴侣（αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6 和 αvβ8）表现出强大的效力，与其他 αv 整合体相比，对 αvβ5 的效力略低。蛋白质的效率[1]。

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CWHM‐12抑制RGD整合素介导的细胞-配体相互作用。CWHM‐12可减弱多种促纤维化途径，增强修复过程。[2]
小分子RGD拟肽化合物CWHM-12先前已被证明可以抑制由αvβ3、αvβ5和αvβ6介导的细胞-配体相互作用，以及生化纯化的整合素αvβ1和αvμ8与其各自配体的相互作用（Henderson等人，2013）。我们现在已经完全使用基于细胞的检测方法确定了该化合物对这些和其他RGD结合整合素的效力（表1）。这些结果表明，αvβ1、αvβ3和αvβ6的效力特别强（<1 nM），而其他测试的RGD结合整合素的活性则不同。如前所述，CWHM‐12对血小板聚集所必需的整合素αIIbβ3没有显著活性（>5μM），也不影响非RGD结合整合素的配体结合（Henderson等人，2013）。

经过三周的 CCl4 治疗以建立纤维化疾病后，在最后三周的 CCl4 治疗中，对小鼠给予 CWHM-12 (CWHM 12) 或载体。即使纤维化疾病已得到证实，CWHM-12 仍可显着减少肝纤维化。数字图像定量显示，CWHM-12 治疗的小鼠表现出对 CCl4 诱导的肝纤维化的保护，至少部分是因为 αv 整联蛋白对 TGF-β 的激活较少，与对照组相比，这显着减少了治疗小鼠肝脏中的 p-SMAD3 信号传导来控制。此外，CWHM-12 给药显着减缓了肺纤维化进展[1]。

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连续皮下注射RGD整合素拮抗剂CWHM-12 28天，通过血清肌酐测量，肾功能得到改善。CWHM-12显著降低了肾脏中胶原蛋白1（Col1a1）mRNA的表达和瘢痕胶原蛋白的沉积。活化的肌成纤维细胞是肾纤维化细胞外基质沉积的主要来源，其蛋白质和基因表达标志物因治疗而减少。RNA测序显示，RGD整合素的抑制影响了决定损伤反应和修复过程结果的多种途径。第二种RGD整合素拮抗剂CWHM-680每天口服一次，也能有效改善纤维化。我们得出结论，用这种小分子拮抗剂靶向RGD整合素是治疗纤维化肾病的一种有前景的方法[2]。

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### 肝脏纤维化模型（四氯化碳诱导）
1. 预防性给药：给予CWHM-12的小鼠经四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化后，肝组织天狼星红染色显示胶原沉积量显著降低，羟脯氨酸检测结果也证实胶原含量减少，α平滑肌肌动蛋白（αSMA）免疫组化结果显示活化肌成纤维细胞数量减少，表明CWHM-12可显著减轻肝纤维化程度[1]
2. 治疗性给药：先给予小鼠3周CCl₄诱导肝纤维化，再给予CWHM-12治疗3周（持续CCl₄给药），肝组织天狼星红染色的胶原沉积量化分析显示胶原面积占比显著降低，羟脯氨酸水平下降，αSMA阳性区域面积减少，证实CWHM-12对已形成的肝纤维化具有治疗作用[1]
### 肺纤维化模型（博来霉素诱导）
治疗性给药：小鼠经博来霉素诱导肺纤维化14天后，给予CWHM-12治疗至第28天，肺组织天狼星红染色显示胶原沉积减少，羟脯氨酸分析证实肺组织胶原含量显著降低，表明CWHM-12可改善肺纤维化[1]
### 肾纤维化模型（马兜铃酸诱导）
1. 肾功能改善：CWHM-12以100 mg·kg⁻¹·d⁻¹的剂量持续皮下给药28天，马兜铃酸致肾损伤小鼠的血清肌酐水平显著降低，提示肾功能得到改善[2]
2. 纤维化标志物抑制：CWHM-12处理后，肾组织中Ⅰ型胶原（Col1a1）mRNA表达水平从vehicle组的32倍升高降至9倍升高，Ⅰ型胶原蛋白表达量降低3倍（光密度定量：0.719 ± 0.13 vs 2.14 ± 0.39 任意单位，p=0.00345）；天狼星红染色显示肾组织胶原沉积面积减少68%（p<0.0001）；Masson三色染色也证实胶原沉积减少[2]
3. 肌成纤维细胞活化抑制：CWHM-12处理后，肾组织中PDGFR-β和α-SMA免疫染色阳性面积分别减少44%（p=0.008）和45%（p=9.8×10⁻⁷）；RNA测序显示肌成纤维细胞活化标志物（Pdgfrb、Foxd1、Gli1、Crfl1等）的基因表达水平显著下调[2]
4. 通路调控：CWHM-12可下调肾组织中促纤维化的TGF-β、Wnt通路相关基因表达，同时上调与组织修复相关的通路基因表达[2]

体外整合素功能测定[1]
如前所述，对CWHM-12和CWHM96对αvβ3、αvβ5、αvα6和α5β1介导的细胞粘附的影响进行了测量，并进行了小幅修改5,51。简而言之，将稳定转染的过表达人αvβ3或αvβ5的人293细胞在含有200μM MnCl2的HBSS缓冲液中在37°C下用3倍稀释的化合物预孵育30分钟。然后将每个样品加入96孔板的三个孔中，该板在4°C下用预定最佳浓度的纯化玻连蛋白涂覆过夜，洗涤，用BSA孵育1小时封闭，然后再次洗涤。允许细胞在37°C下附着30分钟，并通过洗涤去除非粘附细胞。使用对硝基苯磷酸盐通过内源性碱性磷酸酶活性测量剩余的附着细胞，并在405nm下读取吸光度信号。使用相同的程序测量表达αvβ6的人HT-29细胞与纯化的人潜伏期相关肽的粘附力，以及表达α5β1的人K562细胞与人血浆纤维连接蛋白的粘附力。在所有基于细胞的检测中，通过测试相应同种型匹配的阳性（功能阻断）和阴性对照抗体的活性来验证预期整合素的结合。使用纯化的重组人整合素，通过无细胞受体-配体相互作用测定法测量整合素αvβ1、αvβ8、α2β1和α10β1的功能。使用的配体是αvβ1的人纤维连接蛋白、αvβ8的人LAP、α2β1的牛II型胶原和α10β1的鼠层粘连蛋白I。将96孔板涂上预定最佳浓度的配体过夜，用TBS+++（25 mM Tris pH7.4，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1 mM MgCl2，1 mM MnCl2，1mM CaCl2）洗涤3次，并用TBS+++/1%BSA封闭。纯化的整联蛋白在TBS+++/0.1%BSA中稀释，有或没有化合物，溶液根据标准模板加入洗涤过的配体涂层板的空孔中，每个样品重复三次。在室温下孵育2小时后，用TBS+++洗涤板3次。将针对αv亚基（αvβ1、αvβ8测定）或β1亚基（β2β1、β10β1测定）的生物素标记抗体应用1小时。用TBS/0.1%BSA洗涤平板3次。将链霉抗生物素蛋白偶联的辣根过氧化物酶加入孔中，在室温下孵育平板20分钟。经过3X TBS+++洗涤后，使用链霉抗生物素蛋白偶联的辣根过氧化物酶和TMB底物检测结合的整合素，在650nm处测量吸光度。为了测定αIIbβ3（IIbIIIa）的功能，用纯化的人整合素包被平板过夜，用TBS+++洗涤3次，并用TBS+++/1%BSA封闭。Alexa Fluor647标记的纯化人纤维蛋白原在含有或不含有化合物的TBS+++/0.1%BSA中稀释，然后将溶液加入到包被整合素的平板中。孵育2小时后，用TBS+++洗涤平板3次，通过在640/668nm处测量的吸光度检测结合的配体。

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如前所述，测量了化合物阻断整合素αvβ3、αvβ5和αvβ6介导的细胞附着的效力（Henderson等人，2013）。使用对该方法的修改来测量阻断整合素αvβ1、αvβ8和α8β1介导的细胞附着的能力，简要总结如下：为了评估CWHM-12和CWHM⁰680对细胞αvβ2功能的影响，我们在一项测量天然表达这种整联蛋白的HEK‌293细胞与涂有纯化重组人TGFβ1潜伏相关肽的96孔板表面结合的测定中改变了其浓度（Nagarajan等人，2007）。为了评估对细胞αvβ8功能的影响，我们使用相同的LAP配体，但使用已稳定转染以过表达该整联蛋白的HEK‐293细胞进行了检测。为了评估对α8β1功能的作用，我们使用已稳定转导以过表达此整联蛋白并使用纯化的重组小鼠肾连接蛋白作为固定配体的HEK？293细胞进行检测。为了评估对细胞α5β1功能的影响，我们使用天然表达这种整合素的K562细胞进行了检测，并使用纯化的人血浆纤维连接蛋白作为固定配体。对于除α8β1外的所有检测，最佳配体浓度被定义为在存在同种型匹配的阴性对照抗体的情况下，通过已知的特异性功能中和抗体最大限度地抑制相关细胞结合，同时保持强结合。由于市场上没有经过验证的α8特异性中和抗体，因此通过比较α8β1过表达细胞与亲本未转染细胞的附着情况来优化配体涂层[2]。

粘附试验[1]
控制和itgavflox/flox；Pdgfrb-Cre HSC培养5天，然后接种到预涂有纤维连接蛋白、I型胶原、IV型胶原、层粘连蛋白和纤维蛋白原的48孔组织培养板或BSA处理的对照中（CytoSelect 48孔粘附试验，ECM阵列）。让细胞粘附90分钟，用PBS洗涤×3，按照制造商的说明染色和洗脱。粘附力表示为粘附在1%聚-L-赖氨酸上的未清洗细胞的百分比。

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迁移分析[1]
控制和itgavflox/flox；Pdgfrb-Cre HSC培养5天，然后按照制造商的说明（CytoSelect 24孔细胞迁移测定）接种到8μm孔径改良的Boyden室的上部室中。将胎牛血清（10%）加入下腔室，让细胞在37°C下迁移6小时。用棉签擦拭上腔中剩余的细胞，并按照制造商的说明固定、染色和洗脱附着在膜下侧的细胞。趋化性表示为无意识控制的百分比。

溶于 50% DMSO（无菌水中）；100 mg/kg/天；皮下注射
\n使用 mTmG (Td tomato/EGFP) 和 Ai14 (Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE) 小鼠，并与 Pdgfrb-Cre 小鼠杂交。使用野生型 C57/BL6 小鼠、Itgavflox/flox 小鼠和 itgb8flox/flox 小鼠。\n体内 CWHM-12 和 CWHM 96 研究 [1]
\n所有研究中，CWHM-12 和 CWHM 96 均溶于 50% DMSO（无菌水中），剂量为 100 mg/kg/天。药物或溶剂（50% DMSO）通过植入式 ALZET 渗透泵给药。对于 CCl4 诱导的纤维化，在首次给予 CCl4 之前（预防性）或治疗 3 周后（治疗性）皮下植入泵，并在 6 周后采集肝脏。对于博来霉素诱导的纤维化，在博来霉素或生理盐水治疗 14 天后植入泵，并在 28 天后采集肺脏（仅治疗性）。

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\n肾损伤模型 [2]
\n在诱导肾损伤前一天，将 Alzet 渗透微型泵皮下植入 8 至 10 周龄的野生型雄性 ICR 近交系小鼠（Envigo）体内，以输送载体（DMSO/H2O 1:1）或 CWHM-12，剂量为 100 mg/kg/天。为诱导肾损伤，小鼠腹腔注射单剂量5 mg/kg的马兜铃酸I钠盐（溶于PBS），随后每日监测小鼠27天。对照组（未损伤）小鼠注射等体积的PBS。分别于第0、5天（损伤高峰期）和第28天（研究终点）通过上颌静脉穿刺采集血液样本。为测试CWHM-680，在注射马兜铃酸I钠盐前一天开始灌胃给予CWHM-680（100 mg/kg/天），并持续每日一次直至研究终点。分别于第0、7和23天（研究终点）采集血液样本。未存活至研究结束的动物不纳入血清肌酐分析。血清肌酐由阿拉巴马大学奥布莱恩生物分析中心采用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法测定。采用液相色谱-串联质谱法 (LC/MS/MS) 测定血浆样本中 CWHM-12 和 CWHM-680 的浓度，以加入对照血浆中的化合物作为标准品。

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\n1. 预防性实验：雌性小鼠通过 Alzet 渗透泵给予 CWHM-12 或载体，随后每周两次腹腔注射 CCl₄，持续 6 周；实验结束时，收集肝组织进行 Picrosirius 红染色、羟脯氨酸分析和 αSMA 免疫组织化学染色[1]
\n2.治疗性实验：首先对雌性小鼠进行腹腔注射，每周两次，持续3周，以诱导肝纤维化；然后植入含有CWHM-12或载体的Alzet渗透泵，并继续每周两次注射CCl₄，持续3周；在实验终点，收集肝组织，并用与预防性实验相同的指标进行检测[1]
\n### 肺纤维化模型（博来霉素诱导）
\n对雌性小鼠进行气管内灌注博来霉素以诱导肺纤维化，14天后，植入含有CWHM-12或载体的Alzet渗透泵，持续给药至第28天；在实验终点，收集肺组织进行Picrosirius红染色和羟脯氨酸分析[1]
\n### 肾纤维化模型（马兜铃酸诱导）
\n1. 实验动物：雄性ICR近交系小鼠；给药方案：在造模前1天（第-1天）植入Alzet渗透泵，并以100 mg·kg⁻¹·d⁻¹的剂量持续皮下注射CWHM-12或载体。于第0天给予马兜铃酸（AA）以诱导肾损伤，并持续给药至第27天；在实验终点，检测血清肌酐、肾组织Col1a1 mRNA/蛋白表达、Picrosirius红染色、Masson三色染色、PDGFR-β/α-SMA免疫染色和RNA测序[2]

在马兜铃酸诱导的肾损伤模型中，未受损（PBS处理）小鼠的血清肌酐水平在给予CWHM-12后未发生异常变化，表明CWHM-12在实验剂量下无明显的肾毒性；其他信息，如半数致死剂量、肝肾毒性、药物相互作用和血浆蛋白结合率等，均未提及[2]

[1]. Targeting of αv integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nat Med. 2013 Dec;19(12):1617-24.

[2]. Basta J, Robbins L, Stout L, Prinsen MJ, Griggs DW, Rauchman M. Pharmacologic inhibition of RGD-binding integrins ameliorates fibrosis and improves function following kidney injury. Physiol Rep. 2020;8(7):e14329.

肌成纤维细胞是组织纤维化过程中细胞外基质成分的主要来源，而肝星状细胞（HSCs）被认为是肝脏中肌成纤维细胞的主要来源。迄今为止，尚未开发出能够有效操控这些细胞的基因系统。我们发现，在Pdgfrb启动子控制下的Cre重组酶（Pdgfrb-Cre）能够高效地使小鼠HSCs中loxP侧翼序列的基因失活。我们利用该系统敲除了编码α(v)整合素亚基的基因，因为已有研究表明多种含α(v)亚基的整合素是多个器官纤维化过程中的关键介质。这种α(v)整合素的缺失能够保护小鼠免受四氯化碳诱导的肝纤维化，而HSCs中β₃、β₅或β₆整合素的全身性缺失，或β₈整合素的条件性缺失则不具备这种保护作用。我们还发现，Pdgfrb-Cre 能有效靶向多个器官中的肌成纤维细胞，并且利用该系统敲低 α(v) 整合素亚基在其他器官纤维化模型（包括肺纤维化和肾纤维化）中具有保护作用。使用小分子（CWHM 12）对含 α(v) 整合素进行药理学阻断，可减轻肝脏和肺部纤维化，甚至达到治疗效果。这些数据揭示了一条调控纤维化的核心通路，并提示靶向所有 α(v) 整合素的药理学策略可能对治疗多种纤维化疾病具有临床应用价值。[1]纤维化是许多进行性慢性肾脏病 (CKD) 病因的最终共同通路。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD) 结合整合素是促纤维化反应的重要介质，它们通过激活损伤部位的潜在 TGF-β 以及向肌成纤维细胞提供细胞外基质的组成和硬度信息来发挥作用。因此，阻断 RGD 结合整合素可能具有治疗慢性肾脏病 (CKD) 的潜力。为了验证这一想法，我们使用小分子肽模拟物，在小鼠肾纤维化模型中有效抑制了部分 RGD 结合整合素。通过给予马兜铃酸诱导急性肾损伤并导致纤维化。连续皮下注射 RGD 整合素拮抗剂 CWHM-12 28 天后，血清肌酐水平显著降低，肾功能得到改善。CWHM-12 显著降低了肾脏中 I 型胶原 (Col1a1) mRNA 的表达和瘢痕胶原沉积。肾纤维化中细胞外基质沉积的主要来源——活化肌成纤维细胞的蛋白质和基因表达标志物在治疗后减少。RNA测序显示，RGD整合素的抑制影响了决定损伤反应和修复过程结果的多个通路。另一种RGD整合素拮抗剂CWHM-680，每日一次经口灌胃给药，也有效改善了纤维化。我们得出结论，使用此类小分子拮抗剂靶向RGD整合素是治疗肾纤维化疾病的一种有前景的治疗方法。[2]

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1. 药物类别：CWHM-12是一种小分子整合素拮抗剂，具体而言是一种RGD整合素拮抗剂/肽模拟物[1][2]
2.作用机制：CWHM-12阻断含αv亚基的整合素（RGD结合型），抑制转化生长因子-β（TGF-β）的活化，减少肌成纤维细胞的活化以及细胞外基质（例如胶原蛋白）的合成和沉积，从而抑制纤维化过程；它还可以调节损伤修复相关通路，改善器官功能[1][2]
3. 疗效和适应症潜力：CWHM-12对包括肝脏、肺脏和肾脏在内的多个器官的纤维化具有改善作用，兼具预防和治疗作用，并且可以改善肾损伤后的肾功能，使其成为治疗纤维化疾病（例如慢性肾脏病、肝纤维化、肺纤维化）的潜在药物[1][2]
4.给药途径拓展：另一种RGD整合素拮抗剂CWHM-680（口服）也能改善肾纤维化，表明RGD整合素拮抗剂具有开发不同给药途径的潜力[2]

C26H32BRN5O6

590.47

589.153

C, 52.89; H, 5.46; Br, 13.53; N, 11.86; O, 16.26

1564286-55-0

72949858

White to light brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.658

2.06

172.38

7

7

10

38

881

1

CC(C)(C)C1=CC(=CC(=C1)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CNC(=O)C2=CC(=CC(=C2)O)NC3=NCC(CN3)O)Br

YDHAGPCZRFQPOI-NRFANRHFSA-N

InChI=1S/C26H32BrN5O6/c1-26(2,3)16-4-14(5-17(27)8-16)21(10-23(36)37)32-22(35)13-28-24(38)15-6-18(9-19(33)7-15)31-25-29-11-20(34)12-30-25/h4-9,20-21,33-34H,10-13H2,1-3H3,(H,28,38)(H,32,35)(H,36,37)(H2,29,30,31)/t21-/m0/s1

(3S)-3-(3-bromo-5-tert-butylphenyl)-3-[[2-[[3-hydroxy-5-[(5-hydroxy-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl)amino]benzoyl]amino]acetyl]amino]propanoic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。