EC144

EC144 targets Heat Shock Protein 90 (Hsp90), a ubiquitous molecular chaperone that plays a central role in the conformational maturation, stability, and function of a wide array of client proteins, many of which are oncogenic kinases and transcription factors. By binding to the ATP-binding pocket of Hsp90, EC144 inhibits its chaperone activity, leading to the destabilization and subsequent proteasomal degradation of these client proteins. The compound exhibits a Ki of 0.2 nM and an IC50 of 1.1 nM for Hsp90α, indicating exceptionally high affinity and potency. EC144 demonstrates significant selectivity for Hsp90 over other related chaperones such as Grp94 and TRAP1, with Ki values of 61 nM and 255 nM, respectively. This selectivity is crucial for minimizing off-target effects and enhancing the therapeutic window. Moreover, EC144 has no effect (IC50 >10 μM) against a panel of 285 kinases, further confirming its specificity for Hsp90. The primary mechanism of action involves the disruption of Hsp90's chaperone function, which in turn leads to the degradation of critical client proteins like Her-2, a key driver in breast cancer, with an EC50 of 14 nM in MCF-7 cells. This degradation of oncogenic clients results in the inhibition of tumor growth and the induction of partial tumor regression in various cancer models. Beyond its direct anti-cancer effects, EC144 also modulates immune responses by inhibiting LPS-induced TLR4 signaling through the suppression of ERK1/2, MEK1/2, JNK, and p38 MAPK activation, without affecting NF-κB. This suggests that EC144's impact on Hsp90 can have broader implications for inflammatory and autoimmune conditions. The compound's ability to inhibit CD4(+) T cell proliferation in MLRs further highlights its immunomodulatory potential. EC144 is orally available and brain penetrant, which expands its potential therapeutic applications to include cancers and diseases affecting the central nervous system. The combination of high potency, exceptional selectivity, and favorable pharmacokinetic properties makes Hsp90 a key target for EC144's diverse biological activities.

EC144 在多种细胞和生化实验中均表现出强效的体外活性。作为一种 Hsp90 抑制剂，它对 Hsp90α 的 IC50 值为 1.1 nM，Ki 值为 0.2 nM，表明其具有高亲和力结合。在基于细胞的实验中，EC144 能有效降解 MCF-7 乳腺癌细胞中的 Hsp90 底物蛋白 Her-2，EC50 值为 14 nM。这种降解是 Hsp90 抑制的直接结果，导致底物蛋白不稳定。除了抗癌活性外，EC144 还能调节免疫细胞中的炎症信号通路。它通过抑制 ERK1/2、MEK1/2、JNK 和 p38 MAPK 的激活来阻断 RAW 264.7 巨噬细胞中 LPS 诱导的 TLR4 信号通路，但不影响 NF-κB 通路。 EC144 与其他 Hsp90 抑制剂的区别在于其对 MAPK 通路的选择性抑制，这提示了一种独特的免疫调节机制。此外，EC144 可抑制小鼠和人混合淋巴细胞反应 (MLR) 中的 CD4⁺ T 细胞增殖，表明其具有抑制适应性免疫反应的能力。该化合物对 285 种激酶均无活性（IC₅₀ > 10 μM），进一步凸显了其选择性，证实其作用主要通过抑制 Hsp90 介导。EC144 对 Hsp90 的选择性也高于 Grp94 和 TRAP1，其 Ki 值分别为 61 nM 和 255 nM。这种选择性对于降低潜在的脱靶毒性至关重要。该化合物在 DMSO 中的溶解度为 50 mg/mL (120.8 mM)，便于用于各种体外实验。这些体外研究结果表明 EC144 是一种高效且选择性强的 Hsp90 抑制剂，具有显著的抗癌和免疫调节特性，使其成为研究 Hsp90 生物学的宝贵工具，也是治疗开发的一个有希望的先导化合物。

EC144在多个临床前模型中展现出显著的体内活性，证实了其作为治疗药物的潜力。在N87胃癌小鼠模型中，EC144可抑制肿瘤生长并诱导部分肿瘤消退，凸显了其强大的抗癌功效。该化合物可口服，这对于长期给药方案而言是一项关键优势，并且它还能穿透血脑屏障，提示其在治疗脑肿瘤或中枢神经系统疾病方面具有潜在应用价值。除肿瘤治疗外，EC144在体内还表现出显著的抗炎和免疫抑制作用。在LPS休克小鼠模型中，EC144可抑制LPS诱导的TNFα释放，表明其具有抑制全身炎症的能力。机制研究表明，在接受EC144治疗的小鼠中，腹腔CD11b(+)渗出细胞在LPS刺激后TPL2、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平降低，这与对LPS诱导的全身炎症的抵抗力相关。这表明EC144对MAPK通路具有体内功能性抑制作用。在胶原诱导性关节炎大鼠模型中，EC144可抑制疾病进展。这种抑制作用与抗原特异性抗体生成减少和抗原特异性CD4⁺ T细胞活化受损有关，凸显了其免疫调节机制。值得注意的是，EC144在小鼠体内的疗效不到第一代Hsp90抑制剂BIIB021的20倍，表明其具有更优的药理学特性和潜在的更高治疗指数。该化合物通常配制成用于体内给药的溶剂，溶剂组成为10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80和45%生理盐水。这些体内实验结果共同表明，EC144是一种高效、口服生物利用度高的Hsp90抑制剂，具有显著的抗肿瘤、抗炎和免疫抑制活性，支持其在癌症和自身免疫性疾病治疗中的进一步开发。

EC144 的体外酶/受体结合（非细胞）测定通常涉及评估其与 Hsp90 蛋白的亲和力。虽然提供的参考文献中没有详细说明 EC144 的具体实验方案，但可以使用标准的放射性配体结合测定法。在该测定中，将纯化的 Hsp90 蛋白与荧光标记或放射性标记的配体孵育，该配体与 EC144 竞争 ATP 结合口袋。该测定通过测量 EC144 对示踪配体的置换来确定其结合亲和力 (Ki)。对于 EC144，该方法已用于测定其对 Hsp90α 的 Ki 值为 0.2 nM。此外，还使用类似的竞争性结合测定法，分别以纯化的 Hsp90 蛋白和 Grp94 及 TRAP1 蛋白（Ki 值分别为 61 nM 和 255 nM）来评估 EC144 对 Hsp90 相对于 Grp94 和 TRAP1 的选择性。为了验证其特异性，我们还使用激酶活性测定法对包含 285 种激酶的广泛激酶库进行了 EC144 的筛选，结果显示其无活性（IC50 > 10 μM）。这些测定对于表征化合物的结合亲和力、选择性和潜在的脱靶相互作用至关重要。此类体外结合研究的结果为理解 EC144 的作用机制及其下游细胞效应提供了生化基础。

EC144 的体外细胞实验通常包括评估其对癌细胞系和免疫细胞的影响。一项关键实验检测了 MCF-7 乳腺癌细胞中 Hsp90 客户蛋白 Her-2 的降解情况。在该实验中，细胞用不同浓度的 EC144 处理，并通过蛋白质印迹法定量 Her-2 蛋白水平，从而确定其降解的半数有效浓度 (EC50)，EC144 的 EC50 为 14 nM。该实验直接证明了该化合物在细胞环境中的靶向活性。另一项重要的细胞实验研究了 EC144 对炎症信号通路的影响。在 EC144 存在的情况下，用脂多糖 (LPS) 刺激 RAW 264.7 巨噬细胞，并使用磷酸化特异性抗体通过蛋白质印迹法评估下游信号分子（如 ERK1/2、MEK1/2、JNK 和 p38 MAPK）的激活情况。该检测表明，EC144抑制这些激酶的磷酸化，提示其阻断了TLR4信号通路。此外，还利用混合淋巴细胞反应（MLR）评估了EC144对适应性免疫的影响，结果显示其抑制CD4⁺ T细胞增殖。这些细胞实验对于将生化结合数据转化为功能性细胞结果至关重要，有助于全面了解EC144的药理学特性。

EC144 的体内动物实验方案通常采用小鼠和大鼠模型来评估其抗肿瘤、抗炎和免疫抑制作用。在抗肿瘤疗效方面，将 EC144 口服给予携带 N87 胃癌异种移植瘤的小鼠。定期测量肿瘤体积以评估肿瘤生长抑制和消退情况。在抗炎作用研究方面，采用 LPS 休克模型，即在 LPS 攻击前用 EC144 处理小鼠，并检测血清中 TNFα 水平以评估全身炎症的抑制情况。在胶原诱导性关节炎模型中，将 EC144 给予大鼠，并通过关节炎症的临床评分和组织病理学分析来监测疾病进展。为了研究其作用机制，在 LPS 攻击后从经处理的小鼠中分离腹腔 CD11b(+) 渗出细胞，并通过 Western blot 分析 TPL2、MEK1/2 和 ERK1/2 的磷酸化水平。 EC144通常配制成含有10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80和45%生理盐水的溶剂，用于体内给药。这些体内模型对于验证该化合物的治疗潜力以及了解其在复杂生物系统中的作用机制至关重要。

EC144 的特点是口服有效且能穿透血脑屏障。虽然提供的参考文献并未详细说明其药代动力学 (PK) 参数，例如半衰期、清除率、分布容积或最大浓度 (Cmax)，但其口服有效表明其具有足够的吸收和代谢稳定性，口服给药后可进入全身循环。其穿透血脑屏障的特性表明它可以穿过血脑屏障，这对于靶向治疗中枢神经系统癌症和疾病而言是一个显著优势。该化合物的配方适用于体内给药，推荐的赋形剂为 10% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80 和 45% 生理盐水。EC144 粉末制剂在 -20°C 下可稳定保存长达 3 年，溶液在 -80°C 下可稳定保存 1 年。这些特性支持其用于长期临床前研究。尽管目前文献中没有具体的 PK 数据，但口服生物利用度和脑渗透性是 EC144 成为进一步药物开发有希望的候选药物的关键特征。

目前文献中尚未报道EC144的具体毒性（毒理学）数据。然而，该化合物对Hsp90相对于其他蛋白（包括285种激酶）的高选择性（IC50 > 10 μM）表明其可能具有良好的安全性，从而最大限度地减少脱靶效应。其对Grp94和TRAP1的选择性（Ki值分别为61 nM和255 nM）也可能有助于降低毒性，因为这些分子伴侣在细胞应激反应中具有不同的功能。在小鼠和大鼠模型中进行的体内研究表明，EC144具有疗效，且未提及明显的不良反应，表明在测试剂量下其耐受性良好。然而，为了全面评估EC144在临床开发中的安全性，仍需进行全面的毒理学评估，包括急性和慢性毒性研究、遗传毒性和致癌性研究。

[1]. EC144 is a potent inhibitor of the heat shock protein 90. J Med Chem. 2012;55(17):7786-7795.

EC144 是一种第二代 Hsp90 抑制剂，与 BIIB021 等第一代化合物相比，其疗效更优，在小鼠体内的疗效提高了 20 倍以上。EC144 是一种合成化合物，化学名称为 5-[2-氨基-4-氯-7-[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基]-2-甲基-4-戊炔-2-醇。该化合物的分子量为 413.9，纯度 ≥98%（HPLC）。EC144 可作为研究 Hsp90 生物学和临床前药物开发的科研工具。其作用机制是抑制 Hsp90 分子伴侣活性，从而导致底物蛋白降解，并最终发挥抗癌和免疫调节作用。该化合物抑制LPS诱导的TLR4信号通路和T细胞增殖的能力凸显了其在治疗炎症性和自身免疫性疾病方面的潜力。目前的研究可能侧重于进一步阐明其作用机制、优化其制剂以及在其他临床前模型中评估其疗效。

C21H24CLN5O2

413.9

413.162

911397-80-3

11517212

Light brown to brown solid powder

1.29±0.1 g/cm3(20 °C , 760mmHg)

674.1±65.0 °C (760 mmHg)

3.829

99.08

2

6

5

29

635

0

VOASEWXFCTZRDF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H24ClN5O2/c1-12-9-24-15(13(2)17(12)29-5)11-27-10-14(7-6-8-21(3,4)28)16-18(22)25-20(23)26-19(16)27/h9-10,28H,8,11H2,1-5H3,(H2,23,25,26)

5-[2-amino-4-chloro-7-[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl]-2-methylpent-4-yn-2-ol

EC 144; EC-144; EC144

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~66.67 mg/mL (~161.08 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.04 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。