EMPA

human OX2 receptor ( Kd = 1.1 nM ); rat OX2 receptor ( Kd = 1.4 nM )

EMPA 竞争性拮抗食欲素 A 和食欲素 B 引起的 [3H]肌醇磷酸盐 (IP) 在 hOX2 受体上的积累，pA2 值分别为 8.6 和 8.8[1]。 EMPA 取代了含有人和大鼠 OX2 受体的细胞膜上的 [3H]EMPA 结合，Ki 值分别为 1.10±0.24 nM 和 1.45±0.13 nM[1]。 EMPA 在人和小鼠 V1a 受体的结合测定中分别显示 IC50=5.75 µM、Ki=2.63 µM 和 IC50=12.8 µM、Ki=5.8 µM[1]。在稳定表达 hOX2 受体的 CHO(dHFr-) 细胞中，EMPA 抑制 orexin-A 或 orexin-B 诱发的 [Ca2+]i 反应，IC50 分别为 8.8±1.7 nM 和 7.9±1.7 nM[1]。

EMPA（1-300 mg/kg；腹腔注射）剂量依赖性地逆转这种 [Ala11,D-Leu15]orexin-B 诱导的过度运动，而其本身不会显着影响雄性 NMRI 小鼠的运动活动 (LMA)[1]。 EMPA（3-30 mg/kg；腹膜内注射）可诱导法国大鼠和雄性 Wistar 大鼠的基线 LMA 显着且剂量依赖性降低。与媒介物处理的动物相比，EMPA（3-30 mg/kg；ip）显示出对自发活动的明显剂量依赖性抑制[1]。动物模型：雄性 NMRI 小鼠（20-30 g）[1] 剂量：1、3、10、30、100、300 mg/kg 给药方法：以 10 mL/kg 的体积进行腹腔注射 结果：剂量依赖性逆转这种情况[Ala11,D-Leu15]orexin-B 诱导的过度运动，但其本身不会显着影响 LMA。动物模型：法国和雄性 Wistar 大鼠（196-237 g）[1] 剂量：3、10、30 mg/kg 给药方法：以 5 mL/kg 的体积进行腹腔注射 结果：诱导显着且剂量依赖性的减少基线 LMA。与媒介物处理的动物相比，显示出对自发活动的明显剂量依赖性抑制。

[3 H] EMPA binding[1]
解冻后，膜匀浆在4°C下以48 000×g离心10分钟，将微球重新悬浮在结合缓冲液（25 mmol·L−1 HEPES, pH 7.4, 1 mmol·L−1 CaCl2, 5 mmol·L−1 MgCl2, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20）中，至最终检测浓度为每孔2.5µg蛋白。饱和等温线是通过在这些膜上加入不同浓度的[3H]EMPA（总反应体积为500µL），在23℃下反应60分钟来测定的。在孵育结束时，将膜过滤到unitfilter上，unitfilter是一个96孔白色微孔板，带有GF/C过滤器，在洗涤缓冲液（25 mmol·L−1 HEPES, pH 7.4, 1 mmol·L−1 CaCl2, 5 mmol·L−1 MgCl2）加0.5%聚乙烯亚胺中预孵育1小时，使用Filtermate 196收集机，用冷水洗涤缓冲液洗涤4次。在10µmol·L−1 EMPA作用下测定非特异性结合（NSB）。加入45µL的microscint 40并振荡1小时后，在Top-Count微孔板闪烁计数器上（5 min）计数过滤器上的放射性。[1]
利用Prism 4.0软件对饱和实验进行分析，采用由双分子反应方程和质量作用定律导出的矩形双曲方程B = (Bmax*[F])/(KD+[F])，其中B为平衡状态下的配体结合量，Bmax为最大结合位点数，[F]为游离配体浓度，KD为配体解离常数。为了进行抑制实验，将膜与[3H]EMPA孵育，浓度等于放射配体的KD值和10浓度的抑制化合物（0.0001-10µmol·L−1）。IC50值由抑制曲线得出，亲和常数（Ki）值由Cheng-Prussoff方程Ki= IC50/(1 +[L]/KD)计算，其中[L]为放射性配体的浓度，KD为其在受体处的解离常数，由饱和等温线得出。为了测量结合动力学，将膜在23°C下在放射性配体（~ 1.1 nmol·L−1[3H]EMPA）存在下孵育0、1、3、5、7、10、15、20、30、60、90或120分钟，然后通过快速过滤终止。通过在过滤前不同时间加入10µmol·L−1 EMPA，在23°C预孵育1 h的膜中，在~ 1.1 nmol·L−1[3H]EMPA存在下，测量解离动力学。结合动力学参数，Kob值和Koff值（观察到的开断率），分别由结合-解离曲线用一相指数关联和衰减方程推导。Kon、半衰期和Kd分别用Kon= (Kob−Koff)/[配体]、t1/2= ln2/K和Kd = Koff/Kon方程计算。

体外[3H]EMPA放射自显影法测定OX2受体占用率[1]
雄性CD Sprague-Dawley大鼠分别给药（1% Tween-80生理盐水）或增氧剂（3、10或30 mg·kg - 1）（每组n= 2）。给药30分钟后，砍头处死；大脑被迅速解剖，并立即冷冻在干冰中。低温恒温冠状面切片按上述方法进行[3H]EMPA受体放射自显影。

雄性NMRI小鼠（20-30 g）
\n1、3、10、30、100、300 mg/kg
\n腹腔注射，注射体积为10 mL/kg

---

\n\nEMPA在小鼠和大鼠体内的药代动力学[1]
\n在雄性NMRI小鼠和Wistar大鼠中进行了药代动力学实验。小鼠分别通过静脉注射（尾静脉）或灌胃（微量混悬液）给药。在设定的时间点，收集终末血浆和脑组织。每组两只小鼠分别于静脉注射10.77 mg·kg⁻¹ EMPA后0.083、0.333、1、2、4和7小时，或口服18.04 mg·kg⁻¹ EMPA后0.25、0.5、1、2、4和7小时处死。大鼠单次口服（19.71 mg·kg⁻¹，微量混悬液，灌胃）或静脉注射（11.79 mg·kg⁻¹，经颈静脉）给药。每组两只大鼠分别于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4和8小时（静脉注射）或0.25、0.5、1和2小时（口服）处死，并采集血浆和脑组织样本。采用定量液相色谱/质谱/质谱联用（LC/MS/MS）法测定EMPA的浓度。使用WinNonlin 4.1版软件，通过非房室模型分析血浆浓度-时间曲线计算药代动力学参数。\n

---

\n\nEMPA的体内评价[1]
\n动物和药物处理
\n使用雄性NMRI小鼠（20-30 g）和雄性Wistar大鼠（196-237 g）。EMPA在使用前立即配制于含0.3% (w/v) Tween-80的生理盐水（0.9% NaCl）中，小鼠腹腔注射剂量为10 mL·kg−1体重，大鼠腹腔注射剂量为5 mL·kg−1体重。所有剂量均以基础剂量表示。\n

---

\n逆转[Ala11,D-Leu15]orexin-B诱导的小鼠活动过度[1]
\n使用计算机化的Digiscan 16动物活动监测系统量化运动活性（LMA）。数据同时从放置在隔音室内的8个Digiscan活动箱中采集，房间采用12小时光照/12小时黑暗循环。所有测试均在光照期（上午6点至下午6点）进行。每个活动监测器由一个有机玻璃箱（20 × 20 × 30.5厘米）组成，箱底铺有锯末，周围环绕着不可见的水平和垂直红外传感器光束。笼子连接到Digiscan分析仪，分析仪又连接到一台持续采集光束状态信息的PC。活动检测器通过计数光束从不间断变为不间断或反之亦然的次数来工作。在整个测试过程中，通常每 5 分钟记录一次每只动物的光电管光束中断情况。首先将小鼠从笼中转移到记录室，进行 50 分钟的适应期，期间允许它们自由探索新环境。然后，腹腔注射 EMPA（剂量分别为 1、3、10、30、100 和 300 mg·kg⁻¹，每剂量组 n= 8 只小鼠）。十分钟后，用异氟烷吸入对小鼠进行短暂麻醉，以便脑室内注射 5 µL 人工脑脊液 (CSF) 或 3 µg 的 [Ala11,D-Leu15]orexin-B。随后立即将小鼠放回测试隔间，并在接下来的30分钟内记录其自发运动活动（LMA）。

---

\n大鼠在黑暗期（活跃期）的自发运动活动[1]
\n雄性Wistar大鼠（到达时体重约150克）每笼饲养4只（Makrolon笼，1800平方厘米），可自由获取食物和水。在测试前，大鼠在光照/黑暗周期颠倒的动物房（黑暗周期：上午10:00至晚上10:00）中适应2周。在测试当天，使用如上所述的Digiscan动物活动监测计算机系统监测LMA。活动监测箱由有机玻璃制成（41 × 41 × 30厘米，宽 × 长 × 高），内铺一层薄薄的木屑垫料。每个笼子同时监测一只大鼠。黑暗期开始一小时后，大鼠腹腔注射EMPA（3、10、30 mg·kg−1，每剂量组n=8只大鼠），并立即放入活动监测箱中。随后，以5分钟为时间间隔记录大鼠的LMA，持续30分钟。\n

---

\n大鼠的运动协调性和平衡能力[1]
\n雄性Wistar大鼠（体重约200克）接受训练，使其保持在以固定速度旋转的水平金属杆上，直至达到标准水平（在杆上停留120秒）。旋转杆宽7厘米，直径5厘米，距实验台25厘米。第二天，动物腹腔注射赋形剂或EMPA（3、10或30 mg·kg−1；每组n=8只大鼠）。注射后10分钟，分别以8 rpm和16 rpm的转速测试动物在转棒上的表现（在转棒上停留的总时间最长为120秒）。每只大鼠最多可以进行三次试验，每次试验需在转棒上停留120秒；当动物从转棒上跌落或达到标准值时，测试终止。计算每只大鼠完成试验次数的平均时间。

[1]. Biochemical and behavioural characterization of EMPA, a novel high-affinity, selective antagonist for the OX² receptor. Br J Pharmacol. 2009 Apr; 156(8): 1326-1341.

背景与目的：
OX2 受体是一种 G 蛋白偶联受体，在结节乳头体核中大量存在，而结节乳头体核是调节睡眠-觉醒状态的重要部位。本文描述了一种选择性 OX2 受体拮抗剂 N-乙基-2-[(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(甲苯-2-磺酰基)-氨基]-N-吡啶-3-基甲基乙酰胺 (EMPA) 的体外和体内特性。
实验方法：
使用饱和结合和结合动力学方法，在 HEK293-hOX2-细胞膜上评估了 [3H]EMPA 的亲和力。通过 Schild 分析，利用食欲素 A 或食欲素 B 诱导的 [3H]肌醇磷酸酯 (IP) 积累，确定了 EMPA 的拮抗特性。采用定量放射自显影法测定大鼠脑内OX2受体的分布和丰度。通过逆转小鼠静息期[Ala11,D-Leu15]食欲素B诱导的活动过度以及降低大鼠活动期自发运动活性（LMA），评估EMPA的体内活性。
主要结果：
[3H]EMPA与人和大鼠OX2-HEK293细胞膜的结合亲和力（KD）值分别为1.1和1.4 nmol·L−1。EMPA竞争性拮抗食欲素A和食欲素B诱导的[3H]IP在hOX2受体上的积累，pA2值分别为8.6和8.8。大鼠脑组织放射自显影证实了[3H]EMPA对OX2受体的选择性。在小鼠静息期，EMPA 可显著逆转 [Ala11,D-Leu15]食欲素-B 诱导的运动过度，且呈剂量依赖性。在活动期，腹腔注射 EMPA 可降低大鼠的 LMA，且呈剂量依赖性。EMPA 不影响大鼠在转棒试验中的表现。
结论和意义：
EMPA 是一种高亲和力、可逆且选择性的 OX2 受体拮抗剂，具有体内活性，可用于分析 OX2 受体功能。
关键词：EMPA、食欲素、OX2 拮抗剂、结合动力学、肌醇磷酸积累、Schild 分析、放射自显影、大鼠脑分布、食欲素-B 诱导的运动过度、离体受体占有率。[1]

C₂₃H₂₆N₄O₄S

454.54

454.167

C, 60.78; H, 5.77; N, 12.33; O, 14.08; S, 7.05

680590-49-2

9981404

White to light yellow solid powder

4.118

101.08

0

7

9

32

699

0

CCN(CC1=CN=CC=C1)C(=O)CN(C2=CN=C(C=C2)OC)S(=O)(=O)C3=CC=CC=C3C

KJPHTXTWFHVJIG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H26N4O4S/c1-4-26(16-19-9-7-13-24-14-19)23(28)17-27(20-11-12-22(31-3)25-15-20)32(29,30)21-10-6-5-8-18(21)2/h5-15H,4,16-17H2,1-3H3

N-ethyl-2-[(6-methoxypyridin-3-yl)-(2-methylphenyl)sulfonylamino]-N-(pyridin-3-ylmethyl)acetamide

EMPA; N-Ethyl-2-((N-(6-methoxypyridin-3-yl)-2-methylphenyl)sulfonamido)-N-(pyridin-3-ylmethyl)acetamide; VT87V86D7W; CHEMBL2385132; N-Ethyl-2-[(6-methoxy-3-pyridinyl)[(2-methylphenyl)sulfonyl]amino]-N-(3-pyridinylmethyl)-acetamide; 7MA; Acetamide, N-ethyl-2-((6-methoxy-3-pyridinyl)((2-methylphenyl)sulfonyl)amino)-N-(3-pyridinylmethyl)-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50~91 mg/mL (110.0~200.2 mM)
Ethanol: ~23 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。