EMPA

human OX2 receptor ( Kd = 1.1 nM ); rat OX2 receptor ( Kd = 1.4 nM )
EMPA primarily targets the orexin OX2 receptor (OX2R), a G protein-coupled receptor involved in the regulation of arousal, wakefulness, and appetite. It acts as a high-affinity, reversible, and selective antagonist with a KD of 1.1 nM for human OX2R and 1.4 nM for rat OX2R. The compound shows much lower affinity for OX1R (Ki = 900 nM), demonstrating selectivity. By blocking OX2R, EMPA inhibits orexin-A and orexin-B signaling.

EMPA 竞争性地抑制由食欲素 A 和食欲素 B 诱导的 [³H]肌醇磷酸酯 (IP) 在 hOX² 受体上的积累，其 pA² 值分别为 8.6 和 8.8[1]。
EMPA 可从大鼠和人 OX² 受体细胞膜上去除 [³H]EMPA 的结合，其 K_i 值分别为 1.45±0.13 nM 和 1.10±0.24 nM[1]。
EMPA 与人和小鼠 V_1a 受体结合，其 IC₅₀ 值分别为 5.75 µM、K_i=2.63 µM 和 12.8 µM。 K_i分别为5.8 µM[1]。
EMPA抑制稳定表达hOX2受体的CHO(dHFr^-)细胞中由食欲素A或食欲素B诱发的[Ca²⁺]_i反应，IC₅₀值分别为8.8±1.7 nM和7.9±1.7 nM[1]。
体外实验表明，EMPA是一种选择性、高亲和力且可逆的OX2受体拮抗剂。它与人和大鼠OX2-HEK293细胞膜的结合KD值分别为1.1 nM和1.4 nM。[³H]EMPA用于结合实验。该化合物选择性地阻断食欲素A和食欲素B信号通路。其活性可通过受体结合和功能测定来衡量。

EMPA（1-300 mg/kg；腹腔注射）可剂量依赖性地逆转[Ala¹¹,D-Leu¹⁵]食欲素B诱导的雄性NMRI小鼠的活动过度，且不显著改变其运动活性（LMA）[1]。
EMPA（3-30 mg/kg；腹腔注射）可显著且剂量依赖性地降低雌性和雄性Wistar大鼠的基线LMA。与接受载体处理的动物相比，EMPA（3-30 mg/kg；腹腔注射）可表现出明显的剂量依赖性自发活动抑制[1]。
体内研究已探讨了EMPA对睡眠、觉醒和摄食行为的影响。该化合物通过阻断OX2R来调节食欲素信号通路。它已在失眠、嗜睡症和成瘾的动物模型中进行了研究。体内疗效通过测量睡眠-觉醒模式和行为反应来评估。该化合物对 OX2R 的选择性高于 OX1R，使其成为研究 OX2R 特异性功能的宝贵工具。

[3H]EMPA结合[1]
解冻后，将膜匀浆在4°C下以48000×g离心10分钟，沉淀物用结合缓冲液（25 mmol·L−1 HEPES，pH 7.4，1 mmol·L−1 CaCl2，5 mmol·L−1 MgCl2，0.5% BSA，0.05% Tween 20）重悬，使每孔最终蛋白浓度为2.5 µg。通过向这些膜中加入不同浓度的[3H]EMPA（总反应体积为500 µL），在23°C下反应60分钟，测定饱和等温线。孵育结束后，将膜过滤到预先在洗涤缓冲液（25 mmol·L−1 HEPES，pH 7.4，1 mmol·L−1 CaCl2，5 mmol·L−1 MgCl2）和 0.5% 聚乙烯亚胺中孵育 1 小时的 96 孔白色微孔板（带有键合 GF/C 滤膜）上，使用 Filtermate 196 收集器进行过滤，并用冰冷的洗涤缓冲液洗涤 4 次。在 10 µmol·L−1 EMPA 存在下测定非特异性结合 (NSB)。在加入 45 µL 微量闪烁液 40 并振荡 1 小时后，使用 Top-Count 微孔板闪烁计数器对滤膜上的放射性进行计数（5 分钟），并进行猝灭校正。[1]
饱和实验采用 Prism 4.0 软件进行分析，使用由双分子反应方程和质量作用定律推导出的矩形双曲线方程：B = (Bmax*[F])/(KD+[F])，其中 B 为平衡时配体的结合量，Bmax 为最大结合位点数，[F] 为游离配体的浓度，KD 为配体解离常数。在抑制实验中，将膜与浓度等于放射性配体 KD 值的 [3H]EMPA 和 10 个不同浓度的抑制化合物（0.0001–10 µmol·L−1）一起孵育。 IC50 值由抑制曲线得出，亲和常数 (Ki) 值则使用 Cheng-Prussoff 方程 Ki = IC50/(1 + [L]/KD) 计算，其中 [L] 为放射性配体的浓度，KD 为其在受体处的解离常数，由饱和等温线得出。为测定结合动力学，将膜在 23°C 下与放射性配体（约 1.1 nmol·L⁻¹ [³H]EMPA）孵育 0、1、3、5、7、10、15、20、30、60、90 或 120 分钟，然后通过快速过滤终止反应。通过在过滤前不同时间点向预先在 23°C 下孵育 1 小时的膜中加入 10 µmol·L⁻¹ 的 EMPA，并加入约 1.1 nmol·L⁻¹ 的 [³H]EMPA，来测定解离动力学。结合动力学参数 Kob 和 Koff 值（观察到的结合速率和解离速率）分别使用单相指数结合和衰减方程从结合-解离曲线导出。Kon、半衰期和 Kd 分别使用以下方程计算：Kon = (Kob − Koff)/[配体]、t₁/₂ = ln₂/K 和 KD = Koff/Kon。
EMPA 的无细胞测定包括评估其与 OX2 和 OX1 受体的结合亲和力。放射性配体结合测定使用表达重组人或大鼠 OX2R 或 OX1R 的细胞膜制备物进行。[³H]EMPA 用作放射性配体。竞争性结合实验测定KD或Ki值。通过比较OX2R和OX1R的结合亲和力来评估选择性。

利用离体[3H]EMPA放射自显影法测定OX2受体占有率[1]
雄性CD Sprague-Dawley大鼠分别腹腔注射赋形剂（1% Tween-80生理盐水）或almorexant（3、10或30 mg·kg−1）（每组n=2）。给药30分钟后，断头处死动物；迅速解剖脑组织并立即置于干冰中冷冻。按照上述方法处理冰冻切片冠状切片，进行[3H]EMPA受体放射自显影。
对于体外细胞实验，EMPA通常溶解于DMSO中，并用细胞培养基稀释。用不同浓度的EMPA处理表达OX2R或OX1R的细胞。采用钙离子流测定法测量食欲素诱导的信号传导。评估该化合物阻断食欲素A和食欲素B反应的能力。效价（pA2）通过Schild分析确定。

雄性NMRI小鼠（20-30 g）
1、3、10、30、100、300 mg/kg
腹腔注射，注射体积为10 mL/kg

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小鼠和大鼠体内EMPA的药代动力学[1]
在雄性NMRI小鼠和Wistar大鼠中进行了药代动力学实验。小鼠分别通过静脉注射（尾静脉）或灌胃（微量混悬液）给药。在设定的时间点，收集终末血浆和脑组织。每组两只小鼠分别于静脉注射10.77 mg·kg⁻¹ EMPA后0.083、0.333、1、2、4和7小时，或口服18.04 mg·kg⁻¹ EMPA后0.25、0.5、1、2、4和7小时处死。大鼠单次口服（19.71 mg·kg⁻¹，微量混悬液，灌胃）或静脉注射（11.79 mg·kg⁻¹，经颈静脉）给药。每组两只大鼠分别于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4和8小时（静脉注射）或0.25、0.5、1和2小时（口服）处死，并采集血浆和脑组织样本。采用定量液相色谱/质谱/质谱联用（LC/MS/MS）法测定EMPA的浓度。使用WinNonlin 4.1版软件，通过非房室模型分析血浆浓度-时间曲线计算药代动力学参数。

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EMPA的体内评价[1]
动物和药物处理
使用雄性NMRI小鼠（20-30 g）和雄性Wistar大鼠（196-237 g）。EMPA在使用前用0.3% (w/v) Tween-80的生理盐水（0.9% NaCl）配制，小鼠腹腔注射剂量为10 mL·kg−1体重，大鼠腹腔注射剂量为5 mL·kg−1体重。所有剂量均以基础剂量表示。

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逆转[Ala11,D-Leu15]食欲素B诱导的小鼠活动过度[1]
使用计算机化的Digiscan 16动物活动监测系统量化运动活性（LMA）。数据同时从放置在隔音室内的8个Digiscan活动箱中采集，房间采用12小时光照/12小时黑暗循环。所有测试均在光照期（上午6点至下午6点）进行。每个活动监测器由一个有机玻璃箱（20 × 20 × 30.5厘米）组成，箱底铺有锯末，周围环绕着不可见的水平和垂直红外传感器光束。笼子连接到Digiscan分析仪，分析仪与一台持续采集光束状态信息的PC相连。活动检测器通过计数光束从连续到中断或反之亦然的次数来工作。在整个测试过程中，通常每 5 分钟记录一次每只动物的光电管光束中断情况。首先将小鼠从笼中转移到记录室，进行 50 分钟的适应期，期间允许它们自由探索新环境。然后，腹腔注射 EMPA（剂量分别为 1、3、10、30、100 和 300 mg·kg⁻¹，每剂量组 n= 8 只小鼠）。十分钟后，用异氟烷吸入对小鼠进行短暂麻醉，以便脑室内注射 5 µL 人工脑脊液 (CSF) 或 3 µg 的 [Ala11,D-Leu15]orexin-B。随后立即将小鼠放回测试隔间，并在接下来的30分钟内记录其自发运动活动（LMA）。

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大鼠在黑暗（活跃）期的自发运动活动[1]
雄性Wistar大鼠（到达时体重约150克）每笼饲养4只（Makrolon笼，1800平方厘米），可自由获取食物和水。在测试前，大鼠在光照/黑暗周期颠倒的动物房（黑暗周期：上午10:00至晚上10:00）中适应2周。在测试当天，使用如上所述的Digiscan计算机化动物活动监测系统监测LMA。活动监测箱由有机玻璃制成（41 × 41 × 30厘米，宽 × 长 × 高），内铺一层薄薄的木屑垫料。每个笼子同时监测一只大鼠。黑暗期开始一小时后，大鼠腹腔注射EMPA（3、10、30 mg·kg−1，每剂量组n=8只大鼠），并立即放入活动监测箱中。随后，以5分钟为时间间隔记录大鼠的LMA，持续30分钟。

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大鼠的运动协调性和平衡能力[1]
雄性Wistar大鼠（体重约200克）接受训练，使其保持在以固定速度旋转的水平金属杆上，直至达到标准水平（在杆上停留120秒）。旋转杆宽7厘米，直径5厘米，距实验台25厘米。第二天，动物腹腔注射赋形剂或EMPA（3、10或30 mg·kg−1；每组n=8只大鼠）。注射后10分钟，分别以8 rpm和16 rpm的转速测试动物在转棒上的表现（在转棒上停留的总时间最长为120秒）。每只大鼠最多可以进行三次试验，每次试验需在转棒上停留120秒；当动物从转棒上跌落或达到标准水平时，测试终止。计算每只大鼠完成试验次数的平均时间。
EMPA的体内动物研究在小鼠或大鼠模型中进行。该化合物可通过多种途径给药，包括灌胃、腹腔注射或皮下注射。使用脑电图/肌电图记录监测睡眠-觉醒模式。进行包括运动活性和摄食行为在内的行为学分析。通过测量食欲素信号生物标志物来评估药效学效应。

EMPA的药代动力学性质包括分子量为454.54 g/mol，分子式为C23H26N4O4S。该化合物纯度≥98%。作为一种小分子拮抗剂，预计其具有良好的口服生物利用度和脑渗透性。详细的ADME参数，例如半衰期、Cmax和AUC，可从已发表的研究中获取。该化合物作为研究试剂，在适宜条件下储存。

EMPA的毒性特征已在临床前研究中得到表征。作为一种OX2受体拮抗剂，其潜在毒性可能包括对睡眠-觉醒调节的影响。标准毒理学研究包括急性毒性和亚慢性毒性评估。该化合物仅供研究使用，不得用于人体治疗。处理该化合物时应遵循标准安全预防措施。

[1]. Biochemical and behavioural characterization of EMPA, a novel high-affinity, selective antagonist for the OX² receptor. Br J Pharmacol. 2009 Apr; 156(8): 1326-1341.

背景与目的：
OX2 受体是一种 G 蛋白偶联受体，在结节乳头核中含量丰富，而结节乳头核是调节睡眠-觉醒状态的关键部位。本文描述了一种选择性 OX2 受体拮抗剂 N-乙基-2-[(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(甲苯-2-磺酰基)-氨基]-N-吡啶-3-基甲基乙酰胺 (EMPA) 的体外和体内特性。
实验方法：
采用饱和结合法和结合动力学法评估了 [3H]EMPA 与 HEK293-hOX2- 细胞膜的亲和力。通过 Schild 分析，利用食欲素 A 或食欲素 B 诱导的 [3H]肌醇磷酸酯 (IP) 积累来确定 EMPA 的拮抗特性。采用定量放射自显影法测定了大鼠脑内 OX2 受体的分布和丰度。本研究通过逆转小鼠静息期[Ala11,D-Leu15]食欲素B诱导的过度活动以及降低大鼠活动期自发运动活性（LMA）来评估EMPA的体内活性。
主要结果：
[3H]EMPA与人源和鼠源OX2-HEK293细胞膜的结合亲和力（KD）分别为1.1和1.4 nmol·L−1。EMPA竞争性拮抗食欲素A和食欲素B诱导的[3H]IP在hOX2受体上的积累，pA2值分别为8.6和8.8。大鼠脑组织放射自显影证实了[3H]EMPA对OX2受体的选择性。在小鼠静息期，EMPA以剂量依赖的方式显著逆转了[Ala11,D-Leu15]食欲素B诱导的过度运动。在活动期，腹腔注射EMPA可剂量依赖性地降低大鼠的LMA。EMPA不影响大鼠在转棒试验中的表现。结论和意义：EMPA是一种高亲和力、可逆且选择性的OX2受体拮抗剂，具有体内活性，可用于分析OX2受体功能。关键词：EMPA，食欲素，OX2拮抗剂，结合动力学，肌醇磷酸积累，Schild分析，放射自显影，大鼠脑分布，食欲素B诱导的运动亢进，体外受体占有率。[1]
EMPA是一种高亲和力、可逆且选择性的食欲素OX2受体拮抗剂，其KD值分别为1.1 nM（人）和1.4 nM（大鼠）。它对OX2R的选择性高于OX1R（Ki = 900 nM）。 EMPA 能竞争性阻断食欲素 A 和食欲素 B 的信号传导，pA2 值分别为 8.6 和 8.8。该化合物是一种用于研究食欲素信号传导和睡眠-觉醒调节的科研工具。EMPA 尚未进入临床试验阶段，仅用于科研用途。

C₂₃H₂₆N₄O₄S

454.54

454.167

C, 60.78; H, 5.77; N, 12.33; O, 14.08; S, 7.05

680590-49-2

9981404

White to light yellow solid powder

4.118

101.08

0

7

9

32

699

0

CCN(CC1=CN=CC=C1)C(=O)CN(C2=CN=C(C=C2)OC)S(=O)(=O)C3=CC=CC=C3C

KJPHTXTWFHVJIG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H26N4O4S/c1-4-26(16-19-9-7-13-24-14-19)23(28)17-27(20-11-12-22(31-3)25-15-20)32(29,30)21-10-6-5-8-18(21)2/h5-15H,4,16-17H2,1-3H3

N-ethyl-2-[(6-methoxypyridin-3-yl)-(2-methylphenyl)sulfonylamino]-N-(pyridin-3-ylmethyl)acetamide

EMPA; N-Ethyl-2-((N-(6-methoxypyridin-3-yl)-2-methylphenyl)sulfonamido)-N-(pyridin-3-ylmethyl)acetamide; VT87V86D7W; CHEMBL2385132; N-Ethyl-2-[(6-methoxy-3-pyridinyl)[(2-methylphenyl)sulfonyl]amino]-N-(3-pyridinylmethyl)-acetamide; 7MA; Acetamide, N-ethyl-2-((6-methoxy-3-pyridinyl)((2-methylphenyl)sulfonyl)amino)-N-(3-pyridinylmethyl)-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50~91 mg/mL (110.0~200.2 mM)
Ethanol: ~23 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。