EN6

Autophagy; ATP6V1A subunit of the lysosomal v-ATPase
Time- and dose-dependent LC3 production is triggered and LC3BII levels are increased in HEK293A cells by EN6 (50 μM; 1, 4, 8 h) [1]. In HEK293A cells, EN6 (25 μM; 1 h) inhibits mTORC1 lysosomal localization and activation, leading to autophagosomes and autophagy [1]. In the GFP-TDP43 U2OS osteosarcoma cell line model, EN6 (50 μM; 4 h) stimulates v-EN6 (25 μM; 7 h) in HEK293A cells to support IPTG-induced autophagic clearance of protein aggregates [1].Cell

EN6（50 μM；1、4、8 小时）会触发 HEK293A 细胞中时间和剂量依赖性 LC3 的产生，并增加 LC3BII 水平 [1]。在 HEK293A 细胞中，EN6（25 μM；1 小时）抑制 mTORC1 溶酶体定位和激活，导致自噬体和自噬 [1]。在 GFP-TDP43 U2OS 骨肉瘤细胞系模型中，EN6（50 μM；4 小时）刺激 HEK293A 细胞中的 v-EN6（25 μM；7 小时），以支持 IPTG 诱导的蛋白质聚集体自噬清除 [1]。

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用EN6（50 µM）处理HEK293A细胞，增加了LC3BII的加工水平，并以时间和剂量依赖性的方式触发了LC3斑点的形成，效果与mTORC1抑制剂Torin1相当。[1]
在HEK293A细胞中，EN6处理通过透射电子显微镜观察，导致自噬体和自溶酶体数量显著增加。[1]
在HEK293A细胞中，EN6处理（25 µM，1小时）完全抑制了mTORC1信号传导，表现为经典底物S6激酶1（S6K1）、4EBP1和ULK1的磷酸化水平以剂量响应和时间依赖性的方式降低。与ATP竞争性mTOR抑制剂Torin1不同，EN6对mTORC2依赖的AKT磷酸化没有影响。[1]
EN6对mTORC1信号的抑制和自噬的激活（LC3BII积累、p62降解）严格依赖于对ATP6V1A C277的共价修饰，这一点在使用 rescued 了不可修饰的C277A或C277S突变体的ATP6V1A敲低细胞中得到了证实。[1]
EN6处理（25 µM，1小时）消除了HEK293T细胞中氨基酸诱导的mTORC1向LAMP2阳性溶酶体的募集。这种效应可以通过表达组成型活性、GTP锁定的RagB突变体（RagB^Q99L）来阻止。[1]
如免疫共沉淀实验所示，EN6降低了v-ATP酶与Ragulator复合物之间的整体结合，并使这种相互作用对氨基酸水平不敏感。[1]
在HEK293A细胞中，EN6处理（25 µM，4小时）诱导了TFEB的核转位，并显著增加了多个TFEB靶向的溶酶体基因的mRNA水平。[1]
EN6处理（50 µM，4小时）显著增加了HEK293A细胞中的溶酶体酸化，这是通过比率计量型pH敏感染料LysoSensor DND-160染色测量的。这种酸化可被v-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素A1（BafA1）阻断。[1]
在使用加载了FITC-葡聚糖的分离溶酶体的体外实验中，EN6（25 µM）增加了v-ATP酶的催化活性，加速了溶酶体再酸化，而BafA1则抑制了该活性。[1]
在具有IPTG诱导型GFP-TDP-43聚集体的U2OS细胞模型中，与EN6（25 µM）共同处理7小时可将TDP-43聚集体形成减少75%。这种清除是溶酶体和v-ATP酶依赖性的，因为与BafA1共同处理可阻止该清除。在EN6处理4小时内也观察到了对预先形成的聚集体的清除。[1]
EN6在表达组成型活性RagB^Q99L突变体的细胞或敲除了GATOR1复合物蛋白NPRL3的细胞中无法有效阻断mTORC1信号传导。[1]
EN6的半胱氨酸非反应性类似物CC2-49在HEK293A细胞中不抑制mTORC1信号传导或提高LC3BII水平。[1]

在体内，EN6（50 mg/kg；腹腔注射；单次）抑制 mTORC1 并促进自噬 [1]。

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向C57BL/6小鼠腹腔注射（i.p.）单剂量EN6（50 mg/kg）4小时后，能显著抑制骨骼肌和心脏组织中的mTORC1信号传导，表现为S6、4EBP1和ULK1的磷酸化水平降低。自噬被强烈激活，表现为LC3BII水平增加和p62水平降低。[1]
在小鼠心脏和骨骼肌中，EN6在抑制4EBP1和ULK1磷酸化、以及诱导LC3B切割和p62降解方面比雷帕霉素（10 mg/kg，i.p.）更有效。[1]
EN6处理不抑制小鼠心脏或骨骼肌中mTORC2依赖的AKT磷酸化。[1]

体外v-ATP酶测定[1]
简言之，将两个15cm汇合的HEK293T细胞与30μg/ml与Oregon Green 514（Dx-OG514，Invitrogen）缀合的70 kDa葡聚糖孵育过夜。第二天，洗涤细胞并在无血清DMEM中追逐2小时，以允许Dx-OG514的溶酶体积累。裂解前15分钟，加入1μM FCCP以消散溶酶体pH梯度。然后收获细胞，并使用23G针在部分缓冲液中机械破碎：140mM KCl、1mM EGTA、20mM HEPES、50mM蔗糖（pH 7.4），补充有5mM葡萄糖、蛋白酶抑制剂和1μM FCCP。将溶解的细胞在4°C下以1700rpm离心10分钟，并收集上清液。将得到的核后上清液（PNS）在4°C下以最大速度旋转，得到含有器官部分的沉淀。将每个级分重悬于180μl不含FCCP的分馏缓冲液中，并转移到96多孔（黑色）中。在SpectraMax i3中以30秒的间隔在490nm激发后，在530nm处收集基线荧光，持续5分钟。将各种化合物加入每个孔中，然后加入5mM ATP和MgCl2，并在45分钟内恢复荧光读数。由于v-ATP酶的溶酶体再酸化，Dx-OG514的荧光发射随时间呈指数衰减。

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采用基于凝胶的活性蛋白谱分析（ABPP）来评估EN6与重组ATP6V1A的相互作用。将纯化的重组人ATP6V1A蛋白在PBS缓冲液中与载体或不同浓度的EN6于37°C预孵育1小时。然后将混合物与终浓度为1 µM的罗丹明功能化碘乙酰胺探针（IA-rhodamine）在室温下孵育1小时。反应通过加入SDS上样缓冲液终止，加热，并通过SDS-PAGE分离。探针标记的蛋白通过凝胶内荧光扫描和光密度法定量可视化。[1]
进行了体外v-ATP酶活性测定。通过亚细胞分级分离从HEK293T细胞中分离出加载了荧光素标记葡聚糖（FITC-葡聚糖或Oregon Green 514标记葡聚糖）的溶酶体。将细胞器组分重悬于测定缓冲液中。记录基线荧光。加入载体、EN6（25 µM）或巴弗洛霉素A1（200 nM），同时加入ATP（5 mM）和MgCl₂以启动v-ATP酶驱动的质子泵送和溶酶体再酸化。使用酶标仪监测荧光（由于葡聚糖缀合物的pH敏感性）随时间的淬灭情况。荧光衰减的速率反映了v-ATP酶的活性。[1]

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： HEK293A 细胞
测试浓度： 50 μM
孵育时间： 1 、4、8 小时
实验结果：时间和剂量依赖性触发 LC3 斑点形成并增加 LC3BII 水平。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： HEK293A 细胞
测试浓度： 25 μM
孵育时间： 1 小时
实验结果： 导致 mTORC1 信号传导完全失活，例如经典底物、S6 激酶 1 (S6K1)、4EBP1 和 ULK1 的磷酸化。

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免疫荧光 [1]
细胞类型： HEK293A 细胞
测试浓度： 50 μM
孵育时间： 4 h
实验结果：导致HEK293A细胞中溶酶体酸化显着增加，而这种增强的酸化被BafA1阻断。

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免疫荧光[1]
细胞类型： IPTG诱导的 GFP-TDP43 U2OS 骨肉瘤细胞系模型
测试浓度： 25 μM
孵育持续时间：7小时
实验结果：IPTG诱导的TDP43聚集体减少了75%。

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使用稳定表达双色、可切割的GFP-LC3-RFP-LC3ΔG报告基因的MEF或HEK293A细胞进行了基于细胞的自噬通量筛选。将细胞接种于96孔板中，使其贴壁过夜，然后在完全培养基中用载体、共价配体（例如50 µM EN6）、雷帕霉素（100 nM）或Torin1（250 nM）处理24小时。固定细胞，并使用酶标仪测量GFP/RFP荧光比值。GFP/RFP比值的降低表明LC3加工和自噬通量增加。[1]
对于信号传导和自噬标志物的免疫印迹分析，用指定化合物处理细胞（例如HEK293A、HeLa）。处理后，用冰预冷的PBS洗涤细胞，并在含有Triton X-100、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解液中裂解。将澄清的裂解物与SDS上样缓冲液混合，加热，通过SDS-PAGE分离，并转膜。将膜封闭，与一抗（例如针对phospho-S6K1、LC3B、p62、ATP6V1A）孵育，然后与相应的二抗孵育，并使用化学发光或荧光法检测。[1]
对于氨基酸饥饿和刺激实验，将亚汇合细胞用无氨基酸培养基洗涤并孵育50分钟，该培养基补充有透析过的血清。若适用，则在此饥饿期间加入药物。然后用完整的氨基酸混合物刺激细胞10分钟（或保持在饥饿培养基中）。立即裂解细胞进行免疫印迹分析。[1]
对于LC3B斑点成像，将接种在腔室载玻片上的HEK293A细胞用化合物处理、固定、透化并封闭。细胞在4°C与抗LC3B一抗孵育过夜，然后与荧光染料标记的二抗孵育。用Hoechst 33342染色细胞核。通过共聚焦荧光显微镜获取图像，并使用图像分析软件对每个细胞的LC3B斑点进行定量。[1]
对于通过免疫荧光评估mTORC1溶酶体定位，将接种在盖玻片上的细胞进行氨基酸饥饿和刺激方案（含或不含药物处理）。固定、透化细胞，并与抗mTOR和一抗和溶酶体标志物LAMP2的一抗孵育，然后是荧光二抗。通过共聚焦显微镜获取图像，并分析共定位情况。[1]
对于测量溶酶体pH，用化合物处理HEK293A细胞，然后用比率计量型pH敏感染料LysoSensor Yellow/Blue DND-160染色。使用双光子显微镜对活细胞进行成像，以收集两个波长范围（蓝色和黄色）的荧光发射。计算黄蓝荧光比值，并使用在离子载体存在下用已知pH缓冲液生成的校准曲线将其转换为pH值。[1]
对于TDP-43聚集体清除实验，接种稳定表达IPTG诱导型GFP-TDP-43的U2OS细胞。对于共处理实验，用IPTG诱导聚集体形成，同时用载体或EN6（含或不含BafA1）处理数小时。对于预刺激实验，首先用IPTG处理细胞以形成聚集体，然后用载体或EN6处理。固定细胞，用Hoechst染色，并通过共聚焦显微镜成像。使用图像分析软件对每个细胞的GFP-TDP-43聚集体进行定量。[1]
为了构建稳定细胞系，使用表达特异性shRNA的慢病毒在HeLa细胞中敲低ATP6V1A。然后通过慢病毒转导用表达shRNA抗性的、Flag标记的野生型或突变型（C277A、C277S）ATP6V1A的载体拯救敲低细胞。用嘌呤霉素筛选细胞。[1]

动物/疾病模型： 六周龄雄性 C57BL/6 小鼠 [1]。
剂量： 50 mg/kg
给药途径： 腹腔注射；单次
实验结果：骨骼肌和心脏中 mTORC1 信号通路受到显著抑制，表现为 S6、4EBP1 和 ULK1 磷酸化水平降低。 LC3BII 水平升高和 p62 水平降低表明自噬被强烈激活。

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\n评估 mTORC1 在体内的抑制作用以及 EN6 在小鼠体内的药代动力学[1]
\n6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠（杰克逊实验室）腹腔注射溶剂对照、EN6（50 mg/kg）或雷帕霉素（10 mg/kg），溶于生理盐水/乙醇/PEG-40（v/v/v = 18:1:1）。 4小时后，处死小鼠，收集组织，并在裂解缓冲液（1% Triton X-100、10 mM β-甘油磷酸钠、10 mM 焦磷酸钠、4 mM EDTA、40 mM HEPES，pH 7.4，每50 ml缓冲液中加入1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂）中于4℃裂解30分钟。裂解液在4℃下以21,130 g离心10分钟，去除细胞碎片，并用BCA法测定上清液的蛋白浓度。然后将裂解液稀释至1.5 mg/mL，与4×上样缓冲液混合，于95℃加热5分钟，通过预制4-20% TGX凝胶电泳分离，并进行免疫印迹分析。抗体购自各种商业渠道，并按照制造商推荐的程序进行稀释。[1]
\n在药代动力学研究中，小鼠腹腔注射溶剂对照或指定剂量的EN6。在指定时间间隔，处死小鼠并收集组织。然后称量组织并匀浆，用十二烷基甘油（10 nmol）作为内标，从氯仿：甲醇：PBS混合溶液（2:1:1，v/v/v；总体积4 mL）中提取EN6。收集有机层，在氮气流下蒸发，重新分散于氯仿中，并使用配备Luna反相C5色谱柱（50 mm × 4.6 mm，粒径5 μm，Phenomenex）的Agilent 6430 QQQ液相色谱仪，通过基于多反应监测（MRM）的靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。流动相：缓冲液A，95:5水/甲醇；缓冲液 B：60:35:5 的异丙醇/甲醇/水，两者均添加 0.1% 甲酸和 50 mM 甲酸铵。初始流速为 0.2 mL/min，持续 2 分钟；随后以 0.4 mL/min 的流速进行梯度洗脱，缓冲液 B 的比例从 0% 线性增加至 100%，历时 23 分钟；最后以 100% 缓冲液 B 的等度梯度洗脱 5 分钟，流速从 0.04 mL/min 线性增加至 0.4 mL/min。采用电喷雾电离 (ESI) 进行质谱分析，干燥气温度为 350 °C，干燥气流速为 10 L/min，雾化器压力为 35 psi，毛细管电压为 3.0 kV，碎裂电压为 100 V。用于测定 EN6 水平的母离子/子离子 MRM 转换分别为 369.34/163.2 和 369.34/189，对应的碎裂电压分别为 10 和 20 V，以及 30 和 40 V。通过 LC-MS/MS 分析一系列含有十二烷基甘油 (10 nmol) 和已知浓度 EN6 (0.01、0.1、1、10 和 30 nmol) 的溶液混合物，将 EN6 的峰面积与十二烷基甘油的峰面积进行校准，从而确定每克组织中 EN6 的含量。使用安捷伦定性分析软件，通过计算曲线下面积（AUC）分析数据。

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\n为了评估体内 mTORC1 抑制情况，将 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠腹腔注射（ip）单剂量载体对照（生理盐水/乙醇/PEG-40，18:1:1 v/v/v）、EN6（50 mg/kg）或雷帕霉素（10 mg/kg）。4 小时后，处死小鼠。收集心脏和骨骼肌组织，在裂解缓冲液中匀浆，并通过离心去除细胞碎片。测定蛋白质浓度，并通过免疫印迹分析裂解液中 mTORC1 信号通路和自噬标志物的表达。 [1]
\n在药代动力学研究中，小鼠腹腔注射赋形剂或指定剂量的EN6（例如，10、25、50 mg/kg）。在指定时间点（例如，0.5、1、2、4、8 小时），处死小鼠并采集组织（例如，骨骼肌、心脏）。称量组织，匀浆，并使用含内标的氯仿：甲醇：PBS 混合物提取EN6。收集有机层，干燥，复溶，并使用多反应监测 (MRM) 进行靶向 LC-MS/MS 分析，以定量每克组织中的EN6含量。[1]

小鼠单次腹腔注射 50 mg/kg 的 EN6 后，1 小时内即可在骨骼肌和心脏组织中检测到 EN6。[1] 剂量反应和时间进程研究表明，腹腔注射 EN6 后，可在小鼠组织（骨骼肌、心脏）中检测到 EN6。[1]

该研究指出，EN6 在细胞或小鼠体内均不抑制 mTORC2-AKT 信号通路，而 ATP 竞争性 mTOR 抑制剂则可以抑制这一重要的生存信号。[1]
作者指出，虽然 isoTOP-ABPP 将 ATP6V1A 的 C277 鉴定为主要靶点，但 EN6 可能存在其他结合力较低的非靶点，或与其他氨基酸反应的靶点，这些非靶点对其生物学效应的贡献尚需进一步确定。[1]

[1]. Covalent targeting of the vacuolar H+-ATPase activates autophagy via mTORC1 inhibition. Nat Chem Biol. 2019 Aug;15(8):776-785.

自噬是一种溶酶体降解途径，可清除聚集的蛋白质和受损的细胞器，从而维持细胞稳态。激活自噬的主要途径之一是抑制 mTORC1 激酶，但目前靶向 mTORC1 的化合物无法实现完全且选择性的 mTORC1 阻断。本研究结合共价配体库筛选和基于活性的蛋白质谱分析，发现了一种名为 EN6 的小分子体内自噬激活剂。EN6 可共价靶向溶酶体 v-ATPase 的 ATP6V1A 亚基中的半胱氨酸 277，该亚基通过 Rag 鸟苷三磷酸酶激活 mTORC1。EN6 介导的 ATP6V1A 修饰使 v-ATPase 与 Rag 解偶联，从而抑制 mTORC1 信号通路，增加溶酶体酸化并激活自噬。 EN6 能够持续地以溶酶体依赖的方式清除 TDP-43 聚集体（额颞叶痴呆的致病因子）。我们的研究结果揭示了 v-ATPase 如何调控 mTORC1，并提出了一种基于共价抑制溶酶体 mTORC1 信号通路来增强细胞清除的独特方法。[1]

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EN6 是一种小分子半胱氨酸反应性共价配体，它是通过筛选共价化合物库并结合化学蛋白质组学靶标解卷积 (isoTOP-ABPP) 而发现的。[1]
其作用机制涉及对 v-ATPase 的 ATP6V1A 亚基上的 C277 位点进行共价修饰。这种修饰使 v-ATPase 与 Ragulator-Rag GTPase 复合物解偶联，抑制 mTORC1 在溶酶体上的营养依赖性募集和激活，从而诱导自噬。此外，该修饰增强了v-ATPase的质子泵活性和溶酶体酸化。[1]
EN6代表了一种不同于雷帕霉素（不完全的mTORC1抑制剂）或ATP竞争性mTOR抑制剂（它们也会抑制mTORC2/AKT）的自噬激活方法。它在不影响mTORC2-AKT信号通路的情况下实现了对mTORC1的完全抑制。[1]
EN6以溶酶体依赖的方式促进了TDP-43蛋白聚集体的清除，这些聚集体与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）有关。[1]
该研究提出了一种模型，其中v-ATPase通过与Ragulator-Rag复合物的物理偶联为mTORC1激活提供能量或构象信号。EN6破坏了这种偶联。 [1]
作者指出，EN6是一种早期化合物，需要进一步的药物化学优化以提高其效力、选择性、体内疗效和脑渗透性。其在体内抑制mTORC1的持续时间以及对mTORC2信号通路的潜在长期影响仍有待确定。[1]
另一种共价配体，称为CZ，靶向ATP6V1A上的C138，抑制v-ATPase活性，也抑制mTORC1信号通路，但不会像EN6那样破坏mTORC1的溶酶体定位或清除TDP-43聚集体，这凸显了靶向不同半胱氨酸的功能差异。[1]

C19H14F2N4O2

368.34

368.11

C, 61.96; H, 3.83; F, 10.32; N, 15.21; O, 8.69

1808714-73-9

99640033

White to off-white solid

2.7

76Ų

2

5

5

27

562

0

SUSXQEYPNDORDQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H14F2N4O2/c1-2-18(26)24-16-9-13(7-8-14(16)20)23-19(27)12-10-22-25(11-12)17-6-4-3-5-15(17)21/h2-11H,1H2,(H,23,27)(H,24,26)

N-(3-Acrylamido-4-fluorophenyl)-1-(2-fluorophenyl)-1H-pyrazole-4-carboxamide

EN6 EN-6 EN 6

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~5 mg/mL (~13.57 mM)
Ethanol : ~1.11 mg/mL (~3.01 mM)

配方 1 中的溶解度: 10 mg/mL (27.15 mM) in 50% PEG300 +50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。