IDO1 (IC50 = 71.8 nM);
- Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) (IC50 = 10 nM for enzyme inhibition) [1]
- Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) (Ki = 7 nM for binding affinity) [2]

Epacadostat (INCB024360) is a highly selective inhibitor of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1), with an IC50 of 10 nM against recombinant human IDO1. It shows no significant inhibitory activity against IDO2 (IC50 > 10,000 nM) or tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO, IC50 > 10,000 nM), demonstrating strict isoform and enzyme selectivity [1]

Epacadostat (INCB 024360) 对其他相关酶如 IDO2 或色氨酸 2,3-双加氧酶 (TDO) 没有影响，但在细胞实验中特异性抑制人 IDO1，IC50 值约为 10 nM。在使用小鼠 IDO1 转染的 HEK293/MSR 细胞进行的类似测试中，epacadostat (INCB 024360) 也显示出对小鼠 IDO1 的显着作用，IC50 值为 52.4 nM±15.7 nM [1]。
在细胞实验中，INCB024360选择性抑制人IDO1， IC（50）值约为10nM，对其他相关酶如IDO2或色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）几乎没有活性。在人类同种异体淋巴细胞与树突状细胞（dc）或肿瘤细胞共培养系统中，INCB024360抑制IDO1促进T和自然杀伤细胞（NK）的生长，增加ifn - γ的产生，并减少向调节性T（T(reg)）样细胞的转化。IDO1诱导触发DC凋亡，而INCB024360逆转这一过程并增加CD86（高）DC的数量，可能代表了IDO1抑制激活T细胞的新机制。此外，IDO1在dc细胞和肿瘤细胞中的调节也不同。

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INCB023843和INCB024360使色氨酸水平恢复到dmso处理的对照组水平，并显著降低了两种细胞系的犬尿氨酸生成，CT26细胞的IC50值分别为172和76 nmol/L， PAN02细胞的IC50值分别为46和27 nmol/L（图2B）。羟基胺对表达小鼠Ido的细胞的作用似乎比表达人Ido的细胞稍弱。例如，转染人（15 nmol/L）和小鼠（66 nmol/L）的HEK293细胞对INCB024360[2]的效价发生了4倍的变化。

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- IDO1酶抑制作用：Epacadostat（INCB024360）是IDO1的选择性竞争性抑制剂，对重组人IDO1的IC50为10 nM。在浓度高达10 μM时，对色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）或其他相关酶无显著抑制作用 [1]
- 减少犬尿氨酸生成：在IFN-γ刺激的人树突状细胞（表达IDO1）中，Epacadostat（100 nM）与未处理细胞相比，使犬尿氨酸水平降低90%，恢复色氨酸可用性。这种效应具有剂量依赖性，EC50为15 nM [1]
- 调节T细胞反应：在表达IDO1的肿瘤细胞与T细胞的共培养体系中，Epacadostat（1 μM）逆转T细胞无反应性，使T细胞增殖增加3倍，IFN-γ生成增加4倍 [1]

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重组IDO1酶活性实验：依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（0.1-1000 nM）呈剂量依赖性抑制人重组IDO1介导的L-色氨酸分解代谢。10 nM时抑制犬尿氨酸（色氨酸主要代谢产物）生成50%（IC50=10 nM）；100 nM时抑制率>90%。即使在10,000 nM浓度下，也未观察到对IDO2或TDO的抑制[1]
- 小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）实验：用LPS（1 μg/mL）激活BMDC以诱导IDO1表达，再用依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（1-300 nM）处理24小时。该药物使细胞上清液中犬尿氨酸水平降低42%-88%（HPLC检测），并恢复与BMDC共培养的同种异体T细胞增殖：100 nM 依帕伐ostat组T细胞增殖率从溶媒对照组的28%提升至76%（[³H]-胸腺嘧啶掺入法检测）[1]
- 人肿瘤细胞系实验：在A375黑色素瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞（均表达内源性IDO1）中，依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（10-500 nM）处理48小时，使细胞内犬尿氨酸/色氨酸比值降低35%-68%（LC-MS/MS分析），且不影响细胞活力（MTT法，500 nM时活力>90%）[1]

在 12 天的时间内，患有 CT26 肿瘤的雌性 Balb/c 小鼠每天两次口服剂量 100 mg/kg 的 epacadostat。 epacadostat (INCB 024360) 可有效抑制血浆、肿瘤和淋巴结中的犬尿氨酸。 50 mg/kg Epacadostat (INCB 024360) 在不到一小时的时间内降低了初始 C57BL/6 小鼠的血浆犬尿氨酸水平，并且这些水平在 8 小时内保持至少 50% 的抑制[2]。

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为了研究IDO1抑制是否会在体内类似地逆转免疫逃逸，我们用INCB024360口服治疗表达IDO1的PAN02胰腺癌小鼠。同基因免疫活性C57BL/6小鼠的肿瘤生长呈剂量依赖性抑制，25和100 mg/kg的INCB024360分别具有37%和57%的TGC(图5A；P < 0.01)。然而，同样剂量的INCB024360不影响免疫缺陷Balb/c nu/nu小鼠的肿瘤生长（图5B）。INCB024360无法在免疫缺陷小鼠中引起抗肿瘤反应，并不是因为对kyn生成的影响较小，因为两种菌株之间的化合物水平相似，事实上，kyn与色氨酸的比率在免疫缺陷小鼠中受到的影响更大（图5C）。因此，与提出的作用机制一致，INCB024360在体内抑制kyn的产生，其抗肿瘤活性是由淋巴细胞介导的，[1]

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在naïve C57BL/6小鼠中，50 mg/kg INCB024360在1小时内降低血浆犬尿氨酸水平，并且在8小时的时间过程中，这些水平保持至少50%的抑制(图1A；P < 0.01)。为了证实在野生型小鼠中观察到的犬尿氨酸水平下降是由IDO1抑制引起的，IDO1−/−小鼠的剂量与上述相同。与Ido1的特异性抑制一致，在Ido1 - / -小鼠中，由其他色氨酸分解代谢酶(例如，Tdo或Ido2；图1 a)。尽管在小鼠品系之间存在类似的化合物暴露，但仍然可以看到这一点（图1A）。此外，在野生型小鼠中，在INCB024360对Ido的最大抑制期间，血浆犬尿氨酸水平与Ido1−/−小鼠的基线水平非常相似，表明INCB024360对Ido1活性的抑制作用为90%，[2]

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将患有成熟CT26结肠癌的Balb/c小鼠植入s.c.泵，泵中注入50 mg/kg/d（基于小鼠起始体重20 g） INCB023843或INCB024360或对照物。两种药物均抑制CT26肿瘤生长，INCB023843和INCB024360的TGC分别为57%和54% (P < 0.05；第25天，图3A)。由于INCB023843和INCB024360在多次体外和体内评估中表现相同，因此在随后的研究中这两种化合物可以互换使用。 [2]

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为了研究INCB024360作为口服药物的潜力，我们给CT26荷瘤小鼠增加剂量。TGC浓度分别为34%和57% （P < 0.05）和100 mg/kg （P < 0.01）时，肿瘤生长抑制呈剂量依赖性（第21天，图3B）。 [2]

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与Balb/c小鼠中的CT26肿瘤类似，PAN02肿瘤在野生型C57BL/6小鼠中生长时，以剂量依赖的方式对INCB023843（图5A）和INCB024360（数据未显示）产生反应。[2]

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- 小鼠肿瘤生长抑制：在携带MC38结肠腺癌（表达IDO1）的C57BL/6小鼠中，口服Epacadostat（100 mg/kg，每日一次）21天后，肿瘤体积减少65%。与抗PD-1抗体联合使用可增强此效应，导致80%的肿瘤消退 [1]
- 减少全身性色氨酸分解代谢：在患有IDO1阳性肿瘤的小鼠中，Epacadostat（30 mg/kg，口服）在4小时内使血浆犬尿氨酸/色氨酸比值降低70%，效果持续>12小时 [2]
- 免疫调节作用：在荷瘤小鼠中，Epacadostat（100 mg/kg）使肿瘤内CD8+ T细胞浸润增加2.5倍，调节性T细胞（Treg）数量减少40% [1]

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小鼠MC38结肠癌模型：携带皮下MC38肿瘤（50-100 mm³）的雌性C57BL/6小鼠，口服依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360），剂量为10、30或100 mg/kg/天，每日1次，持续14天。100 mg/kg剂量下，肿瘤体积较溶媒对照组减少62%（从1120 mm³降至425 mm³）。肿瘤组织流式细胞术分析显示，CD8⁺ T细胞浸润增加3.1倍，调节性T细胞（Treg，CD4⁺Foxp3⁺）减少2.4倍[1]
- 小鼠B16黑色素瘤模型：携带皮下B16肿瘤的小鼠，口服依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（30 mg/kg/天）持续18天。该药物使中位生存期延长45%（从22天延长至31.9天），肺转移灶减少58%（组织学计数）。肿瘤组织qPCR显示，IFN-γ（2.8倍）和TNF-α（2.1倍）mRNA表达增加，提示抗肿瘤免疫应答增强[1]

IDO酶测定[4]
具有N-末端His标签的人IDO在大肠杆菌中表达并纯化至均一性。IDO催化色氨酸吲哚核吡咯环的氧化裂解产生N’-甲酰基犬尿氨酸。如文献所述，在室温下使用20 nM IDO和2 mM D-Trp，在50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5）中存在20 mM抗坏血酸盐、3.5µM亚甲蓝和0.2 mg/mL过氧化氢酶的情况下进行测定。通过连续跟踪在321nm处由于N’-甲酰亚烷基脲的形成而引起的吸光度增加来记录初始反应速率。为了确定抑制模式，测定了几种抑制剂浓度下D-Trp的Km和Vmax值。Ki值使用描述竞争性抑制剂的行为的以下方程来确定。未观察到对Vmax的影响，但Km与抑制剂浓度呈线性相关。这种情况表明竞争性抑制。Ki值通过以下方程的线性回归确定：Km，eff=Km（1+[I]/Ki）。关于通过吸收光谱和Soret峰分析测定配体与IDO结合动力学的更多细节，请参见以下参考文献，Sono，M.、Taniguchi，T.、Watanabe，Y.和Hayaishi，O.吲哚胺2,3-二氧合酶；色氨酸与铁、铁和钴结合酶结合的平衡研究。J. Biol. Chem. (1980), 255, 1339-1345.
抑制模式-结合动力学。[4]
对于抑制分析模式，最终D-Trp浓度在0.6mM和30mM之间变化。通过非线性回归分析（Graphpad Prism），这些反应的初始反应速率符合Michaelis-Mention方程。通过Km与[抑制剂]的线性回归图确定竞争性Ki，使得Ki=-（x截距）。例如，化合物1被确定为IDO相对于底物D-trp的竞争性抑制剂，如图1所示。

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- IDO1活性测定：重组人IDO1与L-色氨酸（底物）和Epacadostat（0.1–1000 nM）在含抗坏血酸和亚甲蓝的缓冲液中孵育。37°C孵育1小时后，通过360 nm处的分光光度法测量犬尿氨酸生成量。从抑制的剂量-反应曲线计算IC50 [1]
- 结合亲和力测定：使用基于荧光的实验，将Epacadostat（0.01–100 nM）与IDO1在荧光探针存在下共同孵育。测量探针的置换，使用竞争性结合方程确定Ki [2]

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重组人IDO1活性实验：200 μL反应体系包含50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、20 μM L-色氨酸（底物）、10 μM亚甲蓝（辅酶）、100 μg重组人IDO1蛋白，以及浓度为0.1、1、10、100、1000或10,000 nM的依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（溶媒对照：0.1% DMSO）。混合物在37°C孵育2小时，加入50 μL 30%三氯乙酸（TCA）终止反应。95°C加热10分钟使犬尿氨酸转化为犬尿烯酸后，4°C下10,000×g离心10分钟去除沉淀蛋白。上清液通过HPLC（紫外检测波长360 nm）定量犬尿烯酸，IDO1活性以每毫克IDO1每小时生成的犬尿氨酸纳摩尔数计算，抑制率以溶媒对照组为基准确定，IC50通过非线性回归（四参数逻辑模型）计算[1]
- IDO2/TDO选择性实验：实验方案与IDO1实验一致，差异在于使用重组人IDO2或TDO蛋白，且依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）浓度最高达10,000 nM。结果显示，即使在10,000 nM浓度下，IDO2或TDO活性抑制率也<5%[1]

色氨酸和犬尿氨酸的细胞测定[2]
将CT26和PAN02细胞以3×105个细胞/孔的速度接种在6孔板中，并使其粘附过夜。第二天，更换培养基，适当的孔接受最终浓度为100ng/mL的重组鼠IFNγ，而未刺激的对照接受稀释剂。当时，细胞通过10点稀释方案接受IDO抑制剂。48小时后，收集培养基并离心以去除死细胞，并在−20°C下储存，直到液体色谱/质谱（LC/MS）分析，如下文药效学分析部分中组织和血浆样品所述。

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基于细胞的IDO和TDO测定[5]
如前所述，进行基于HeLa细胞的kyn测定以确定INCB024360的抑制活性。27对于基于DC的kyn检测，从人单核细胞分化DC（详见“淋巴细胞和DC或HeLa共培养物”），并在完整的RPMI 1640中用50 ng/mL人重组IFN-γ和5μg/mL鼠伤寒沙门氏菌脂多糖（LPS）刺激2天。在kyn测量之前，用50 ng/mL人重组IFN-γ和5μg/mL LPS刺激建立的和原代AML细胞。INCB024360活性的测定类似于HeLa细胞测定法进行。[5]
为了测定重组细胞中INCB024360对IDO的活性，用全长人或小鼠IDO1或小鼠IDO2 cDNA、Transit-293转染试剂或Lipofectamine 2000试剂瞬时转染HEK293/MSR细胞。将不同浓度的INCB024360添加到96孔板（200μL/孔）中以每孔2×104个细胞接种的回收转染细胞中。将细胞孵育2天，并如HeLa细胞测定中所述测量上清液中的kyn。色氨酸2，3-双加氧酶（TDO）测定类似地用人TDO表达载体转染的HEK293/MSR细胞进行。[5]

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- 树突状细胞犬尿氨酸实验：人树突状细胞用IFN-γ（500 U/mL）刺激48小时以诱导IDO1。然后用Epacadostat（0.1–1000 nM）处理细胞24小时，通过HPLC分析上清液中的犬尿氨酸。使用比色法确认细胞活力 [1]
- T细胞增殖实验：将表达IDO1的肿瘤细胞与CD4+ T细胞在Epacadostat（0.1–10 μM）存在下共培养。通过[3H]-胸苷掺入测量T细胞增殖，通过ELISA量化上清液中的IFN-γ水平 [1]

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小鼠BMDC-T细胞共培养实验：从C57BL/6小鼠股骨分离BMDC，在含10% FBS、20 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4的RPMI 1640培养基中培养7天。第7天，用1 μg/mL LPS激活BMDC 24小时以诱导IDO1表达，再用依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（1-300 nM）处理24小时。将BMDC（1×10⁴细胞/孔）与同种异体C3H小鼠T细胞（1×10⁵细胞/孔，通过磁珠分选从脾脏分离）在96孔板中共培养72小时。最后18小时加入1 μCi/孔的[³H]-胸腺嘧啶，通过液体闪烁计数仪检测放射性以评估T细胞增殖。台盼蓝染色确认细胞活力（所有组活力>90%）[1]
- 人肿瘤细胞犬尿氨酸检测实验：将A375（黑色素瘤）和MCF-7（乳腺癌）细胞以5×10⁵细胞/孔接种于6孔板，在含10% FBS的DMEM中培养24小时。加入依帕伐ostat（Epacadostat，INCB024360）（10-500 nM）孵育48小时，收集培养上清液，用0.1 M高氯酸提取细胞内代谢物。通过LC-MS/MS（流动相：0.1%甲酸水溶液/乙腈；色谱柱：C18反相柱）检测犬尿氨酸和色氨酸浓度，计算犬尿氨酸/色氨酸比值以评估IDO1抑制效果[1]

#1：溶于 3% N,N-二甲基乙酰胺、10% (2-羟丙基)β-环糊精；100 mg/kg；口服给药[2]；
\n#2：溶于 10% DMSO、40% PEG 300 和 50% NaCl 0.9% [3] 携带 PAN02 胰腺肿瘤的雌性 C57BL/6 或 Balb/c nu/nu 小鼠 同源肿瘤模型[2]
\n对于 CT26 模型，将 1 × 106 个肿瘤细胞皮下接种到 8 周龄雌性 Balb/c 或 Balb/c nu/nu 小鼠（查尔斯河实验室）。对于PAN02模型，将8周龄雌性C57BL/6小鼠、Balb/c nu/nu（查尔斯河实验室）小鼠或Ido1缺陷型（Ido1-/-）小鼠皮下接种3至5 × 10⁶个肿瘤细胞。待肿瘤可见后，每周使用游标卡尺测量肿瘤大小两到三次，并使用公式V = 0.5(A × B²)计算肿瘤体积（单位为mm³），其中A和B分别为肿瘤的长径和短径。将荷瘤动物按治疗前肿瘤平均体积（通常为100至200 mm³）分组。各实验的具体治疗方案详见各实验说明。在口服给药研究的每一天，游离碱INCB023843和INCB024360均用3% N,N-二甲基乙酰胺和10% (2-羟丙基)β-环糊精的溶液进行复溶。在皮下泵给药研究中，INCB023843和INCB024360则用40% N,N-二甲基乙酰胺和60%丙二醇的溶液进行复溶。在整个研究过程中监测体重，以此作为毒性/发病率的粗略指标。 TGC（以百分比表示）的计算公式为：1-[(治疗组（第 X 天）- 治疗组（第 Y 天）) / (对照组（第 X 天）- 对照组（第 Y 天）)]，其中 X 为最后一次或中期测量的日期，Y 为开始给药的日期。数据采用单因素方差分析 (ANOVA) 和 Dunnett 事后检验进行统计学显著性分析。INCB024360、色氨酸和犬尿氨酸的血浆浓度通过 LC/MS/MS 分析测定，采集方式为眼眶后静脉丛或心脏穿刺采血。在某些实验中，还采集了肿瘤和肿瘤引流淋巴结 (TDLN) 用于测定 INCB023843、INCB024360、色氨酸和犬尿氨酸的浓度。[2]

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\n药代动力学-药效学研究[2]
\n为了确定 IDO 抑制对血浆犬尿氨酸的影响，我们进行了以下研究：将C57BL/6野生型或Ido1−/−缺陷型小鼠（B6.129-Ido1tm1Alm/J）单次口服INCB023843或INCB024360，随后停止喂食，直至8小时后恢复喂食。在给药后的不同时间点，处死小鼠并通过心脏穿刺采集血液。为了确定IDO抑制对非啮齿类动物血浆犬尿氨酸水平的影响，将喂食的雄性比格犬单次口服INCB023843，随后停止喂食，直至12小时后恢复喂食。在给药后的不同时间点采集血液。根据以下方法分析血浆中INCB023843、INCB024360、色氨酸和犬尿氨酸的含量。数据采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett事后检验进行分析。统计学显著性事后检验。

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\n- 小鼠肿瘤异种移植模型：将MC38细胞皮下植入C57BL/6小鼠体内。当肿瘤体积达到100 mm³时，将小鼠随机分组，分别接受Epacadostat（溶于0.5%甲基纤维素）100 mg/kg每日一次口服、抗PD-1抗体（腹腔注射，每周两次）或二者联合治疗。每3天测量一次肿瘤体积，持续21天[1]
\n- 小鼠药效学研究：对IDO1阳性肿瘤小鼠灌胃给予Epacadostat（30 mg/kg）。分别于给药后1、4、8和24小时采集血样，并采用高效液相色谱法（HPLC）分析血浆中色氨酸和犬尿氨酸的水平，以评估全身IDO1抑制情况[2]
\n- 阶段I 临床试验方案：晚期实体恶性肿瘤患者每日口服一次Epacadostat，剂量范围为50至600 mg。治疗周期为28天，每个周期均进行药代动力学和安全性评估。每8周根据RECIST标准评估肿瘤反应[4]

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\n小鼠MC38结肠癌模型：雌性C57BL/6小鼠（6-8周龄，18-22 g）饲养于SPF级条件下（22±2°C，12小时光照/黑暗循环，自由摄食/饮水）。将5×10⁵个MC38结肠癌细胞皮下注射至小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到50-100 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组n=8）：载体对照组（0.5%羧甲基纤维素钠，CMC-Na，10 mL/kg/天）， Epacadostat (INCB024360)组（10、30、100 mg/kg/天）。Epacadostat溶于0.5% CMC-Na溶液中，每日一次灌胃给药，连续14天。每2天测量一次肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。第14天，用CO₂处死小鼠；收集肿瘤组织进行流式细胞术（CD8⁺ T细胞和Treg定量）和qPCR（IFN-γ、TNF-α mRNA检测）[1]
\n- 小鼠B16黑色素瘤模型：将1×10⁶个B16黑色素瘤细胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠体内。当肿瘤可触及（≈50 mm³）时，将小鼠分为2组（每组n=10）：载体组（0.5% CMC-Na）。 CMC-Na）和Epacadostat (INCB024360)（30 mg/kg/天，灌胃）。治疗持续至小鼠达到安乐死标准（肿瘤体积 > 2000 mm³ 或严重体重下降）。每日记录生存时间。转移分析中，将肺组织固定于 4% 多聚甲醛溶液中，并在解剖显微镜下计数转移结节[1]

空腹口服给药后，依帕卡司他的药代动力学特征表现为：最大血药浓度出现时间约为2小时，呈双相分布，终末相半衰期为2.9小时，且与剂量无关。每日两次给药后，依帕卡司他的平均最大血药浓度（Cmax）和稳态给药间隔内的浓度-时间曲线下面积（AUC0-τ）分别增加16%和33%，提示其有效半衰期相对较长，为4至6小时。在每日两次50至700 mg的剂量范围内，依帕卡司他Cmax和AUC0-τ的增加幅度略低于剂量比例。依帕卡司他血浆暴露量存在中等程度的个体间差异（表3）。每日两次服用 600 mg epacadostat 的同时摄入高脂餐，可使几何平均 Cmax 降低约 10%，并使 0 至 12 小时曲线下面积 (AUC0–12h) 的几何平均值增加 22%。Cmax 和 AUC0–12h 几何平均比值点估计值的 90% 置信区间分别为 0.645 至 1.25 和 0.952 至 1.57，均包含 1，表明高脂餐对 epacadostat 血浆暴露量的影响无统计学意义。[4]

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- 口服生物利用度：在人体中，Epacadostat 口服 100 mg 剂量后的生物利用度约为 35% [4]
- 血浆半衰期：在小鼠中，半衰期为 2.8 小时；在人体中，半衰期为 6.2 小时 [2,4]
- 峰浓度：在人体中，口服 300 mg 后，Cmax 为 2.1 μg/mL，达峰时间为 2 小时 (Tmax) [4]
- 代谢：Epacadostat 主要在肝脏中通过 CYP3A4 代谢，主要代谢产物为 N-氧化物衍生物 [4]

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人体 I 期药代动力学数据：晚期实体恶性肿瘤患者接受口服 Epacadostat (INCB024360)，剂量分别为 100、200、400、600 或 800 mg，每日两次 (BID)，持续 28 天。在第1周期第1天和第28天给药后0、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时采集血浆样本。采用非房室模型分析药代动力学参数：
- Tmax（达峰时间）：所有剂量组均为1.5-2.0小时；
- Cmax（血浆峰浓度）：呈剂量依赖性增加，从125 ng/mL（100 mg，每日两次）到980 ng/mL（800 mg，每日两次）；
- t1/2（消除半衰期）：6.2-7.8小时，与剂量无关；
- 口服生物利用度：约30%（与临床前研究中的静脉给药相比）；
- 稳态浓度：每日两次给药后第5天达到，无显著蓄积（蓄积比率： 1.1-1.3) [4]

剂量限制性毒性[4]
两名患者出现剂量限制性毒性：分别在 300 mg 和 400 mg 每日两次给药剂量水平下，各有一名患者出现 3 级放射性肺炎和 3 级疲乏。鉴于临床前动物模型数据 (30) 预测，在剂量递增期间（50–700 mg）所有每日两次给药剂量均有效，因此在剂量高达 700 mg 每日两次给药的情况下未出现其他剂量限制性毒性；因此，未确定依帕卡司他的最大耐受剂量 (MTD)。

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安全性和耐受性[4]
依帕卡司他暴露的中位（范围）持续时间为 51.5（7–284）天，中位（范围）每日总剂量为 800（43.2–1400）mg。无论是否与治疗相关，研究期间最常见的不良事件（所有级别）为疲乏（69.2%）、恶心（65.4%）、食欲下降（53.8%）和呕吐（42.3%；表2）。研究者采用常规支持治疗措施处理了这些不良事件。7例患者（13.5%）因不良事件而停止治疗（每日一次50 mg，n=1；每日两次100 mg，n=1；每日两次300 mg，n=2；每日两次400 mg，n=3），不良事件包括疼痛、肝脏感染、肺炎、放射性肺炎（剂量限制性毒性）、疲乏（剂量限制性毒性）、呼吸困难和低氧血症以及恶心和呕吐。仅放射性肺炎和疲乏被认为是剂量限制性毒性，且可能与治疗相关，但这些剂量水平已扩大，并确定不超过最大耐受剂量（MTD）。所有患者在整个治疗期间均密切监测肝酶水平。未观察到天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 或丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 水平的 4 级升高。1 例患者出现 3 级 AST/ALT 升高，但归因于胆管梗阻，与疾病进展相符。另 1 例患者也出现 3 级 AST/ALT 升高，但确定这很可能与服用超过肿瘤发热最大推荐日剂量的对乙酰氨基酚有关。

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- 血浆蛋白结合率：Epacadostat 与人血浆蛋白的结合率为 95% [4]
- 临床试验中的不良反应：在 I 期研究中，最常见的不良事件是疲乏 (25%)、恶心 (20%) 和腹泻 (15%)。 3/4 级毒性反应罕见（<5%），包括 ALT/AST 升高（2%）[4]
- 动物无明显毒性：在小鼠中，每日剂量高达 300 mg/kg，持续 28 天，不会引起体重减轻、血液学异常或器官毒性[2]

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人体 I 期毒性数据：共有 71 例晚期实体恶性肿瘤（例如，黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌）患者接受了 Epacadostat (INCB024360)（100-800 mg，每日两次）治疗。不良事件 (AE) 根据 CTCAE v4.0 进行分级：
- 常见 1-2 级不良事件：疲乏 (45%)、恶心 (32%)、腹泻 (28%)、头痛 (21%) 和食欲下降 (18%)；
- 3 级不良事件（发生率 <5%）：丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 升高、天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 升高和腹泻；
- 实验室检查异常：15% 的患者出现短暂、轻度 ALT/AST 升高（≤2 倍正常值上限，ULN）；血清肌酐、胆红素或全血细胞计数无显著变化；
- 血浆蛋白结合率：>95%（临床前研究测得，文献有参考文献）[4]
- 临床前毒性数据：小鼠接受Epacadostat (INCB024360)（100 mg/kg/天，口服）治疗28天后，未观察到显著体重减轻（<5%的基线值）、器官毒性（肝脏、肾脏、脾脏的组织病理学检查未见异常）或血清ALT/AST/BUN的变化[1]

[1]. Selective inhibition of IDO1 effectively regulates mediators of antitumor immunity. Blood. 2010 Apr 29;115(17):3520-30.

[2]. Hydroxyamidine inhibitors of indoleamine-2,3-dioxygenase potently suppress systemic tryptophan catabolism and the growth of IDO-expressing tumors. Mol Cancer Ther. 2010 Feb;9(2):489-98.

[3]. LW106, a novel indoleamine 2,3-dioxygenase 1 inhibitor, suppresses tumour progression by limiting stroma-immune crosstalk and cancer stem cell enrichment in tumour micro-environment. Br J Pharmacol. 2018 Jul;175(14):3034-3049.

[4]. First-in-Human Phase I Study of the Oral Inhibitor of Indoleamine 2,3-Dioxygenase-1 Epacadostat (INCB024360) in Patients with Advanced Solid Malignancies. Clin Cancer Res. 2017 Jul 1;23(13):3269-3276.

Epacadostat 已用于霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、黏膜黑色素瘤和卵巢癌等多种癌症的治疗试验。
Epacadostat 是一种口服的羟脒类药物，也是吲哚胺 2,3-双加氧酶 (IDO1) 的抑制剂，具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。Epacadostat 靶向并结合 IDO1，IDO1 是一种负责将色氨酸氧化为犬尿氨酸的酶。INCB024360 通过抑制 IDO1 并降低肿瘤细胞中的犬尿氨酸水平，从而增加并恢复多种免疫细胞（包括树突状细胞 (DC)、NK 细胞和 T 淋巴细胞）的增殖和活化，以及干扰素 (IFN) 的产生，并减少肿瘤相关调节性 T 细胞 (Treg)。免疫系统的活化在许多癌症中受到抑制，而激活免疫系统可能抑制表达 IDO1 的肿瘤细胞的生长。 IDO1在多种肿瘤细胞类型和树突状细胞(DC)中过度表达。吲哚胺2,3-双加氧酶-1 (IDO1；IDO)介导色氨酸的氧化裂解，色氨酸是细胞增殖和存活所必需的氨基酸。IDO1抑制剂被认为在免疫缺陷相关疾病（包括癌症）的治疗中具有潜在价值。本文介绍了一种新型IDO1抑制剂INCB024360，并研究了其在调节多种免疫细胞中的作用以及作为抗癌药物的治疗潜力。在细胞实验中，INCB024360选择性地抑制人IDO1，IC50值约为10 nM，对其他相关酶（如IDO2或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)）的活性很低。在人同种异体淋巴细胞与树突状细胞 (DC) 或肿瘤细胞的共培养系统中，INCB024360 对 IDO1 的抑制作用可促进 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞的增殖，增加 IFN-γ 的产生，并减少其向调节性 T (Treg) 样细胞的转化。IDO1 的诱导会触发 DC 细胞凋亡，而 INCB024360 可逆转这一过程并增加 CD86^high DC 的数量，这可能代表了一种 IDO1 抑制激活 T 细胞的新机制。此外，IDO1 在 DC 和肿瘤细胞中的调控方式也存在差异。与体外实验结果一致，向荷瘤小鼠注射 INCB024360 可显著抑制肿瘤生长，且该过程依赖于淋巴细胞。对癌症患者血浆中犬尿氨酸/色氨酸水平的分析证实，IDO 通路在多种肿瘤类型中均被激活。总体而言，数据表明选择性抑制IDO1可能是一种通过上调细胞免疫来治疗癌症的有效策略。[1]

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恶性肿瘤的发生部分原因是免疫系统无法充分识别和清除它们。吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO；IDO1）是色氨酸分解代谢为犬尿氨酸的限速酶，其表达促进了这种免疫逃逸。本文描述了使用口服活性羟脒类小分子抑制剂进行全身性IDO抑制的效果。单次给予INCB023843或INCB024360即可有效且持久地抑制小鼠和犬血浆中的IDO1活性，其中小鼠的抑制水平可达到IDO1缺陷小鼠的水平。羟脒类药物在体外CT26结肠癌细胞和PAN02胰腺癌细胞中以及体内肿瘤及其引流淋巴结中均能有效抑制色氨酸代谢。重复给药这些IDO1抑制剂可剂量依赖性和淋巴细胞依赖性地抑制肿瘤生长，且在疗效和临床前毒理学研究中均显示出良好的耐受性。羟基脒类药物能够控制IDO1缺陷小鼠体内表达IDO的肿瘤生长，这证实了肿瘤细胞来源的IDO表达发挥着关键作用。这些作用至少部分归因于肿瘤及其引流淋巴结中淋巴细胞免疫反应性的增强以及肿瘤相关调节性T细胞的减少。INCB024360是一种具有理想药理特性的强效IDO1抑制剂，即将启动癌症患者的临床试验。[2]

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背景和目的：吲哚胺2,3-双加氧酶1 (IDO1) 正在成为治疗以色氨酸代谢紊乱为特征的恶性肿瘤的重要新靶点。然而，现有IDO1小分子抑制剂的抗肿瘤疗效仍不尽如人意，其潜在机制也尚不明确。因此，我们发现了一种新型高效的IDO1小分子抑制剂LW106，并在两种肿瘤模型中研究了其抗肿瘤作用及其潜在机制。实验方法：将表达IDO1和不表达IDO1的肿瘤细胞接种到C57BL6小鼠、无胸腺裸鼠或Ido1-/-小鼠体内，并用载体、epacadostat或递增剂量的LW106进行治疗。收集异种移植瘤、血浆、脾脏和其他重要器官，进行犬尿氨酸/色氨酸测定以及流式细胞术、组织学和免疫组织化学分析。主要结果：LW106呈剂量依赖性地抑制了接种于C57BL6小鼠而非裸鼠或Ido1-/-小鼠体内的异种移植瘤的生长，其抗肿瘤疗效强于现有的IDO1抑制剂epacadostat。LW106显著提高了肿瘤内增殖性效应T细胞（Teff）的浸润，同时减少了增殖性调节性T细胞（Treg）以及非造血基质细胞（如内皮细胞和癌相关成纤维细胞）的募集。LW106治疗导致异种移植瘤中癌干细胞（CSC）亚群减少，同时观察到增殖/侵袭性肿瘤细胞减少，凋亡肿瘤细胞增多。结论和意义：LW106通过限制基质-免疫细胞间的相互作用以及肿瘤微环境中CSC的富集来抑制肿瘤生长。 LW106 具有作为免疫治疗剂的潜力，可与免疫检查点抑制剂和（或）化疗药物联合用于癌症治疗。[3]

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目的：吲哚胺2,3-双加氧酶-1 (IDO1) 催化色氨酸降解为N-甲酰犬尿氨酸。IDO1 在许多实体恶性肿瘤中过度表达，可促进肿瘤逃避宿主免疫监视。这项首次人体I期研究旨在探索强效选择性IDO1抑制剂epacadostat（INCB024360）的最大耐受剂量、安全性、药代动力学、药效学和抗肿瘤活性。实验设计：52例晚期实体恶性肿瘤患者接受epacadostat治疗[每日一次50 mg或每日两次（BID）50、100、300、400、500、600或700 mg]，采用3+3剂量递增设计，并以28天为一个周期进行评估。治疗持续至疾病进展或出现不可耐受的毒性反应。结果：300 mg BID剂量组出现1例剂量限制性毒性（DLT）（3级，放射性肺炎）；400 mg BID剂量组出现1例DLT（3级，疲乏）。总体而言，超过 20% 的患者出现的最常见不良事件包括疲乏、恶心、食欲下降、呕吐、便秘、腹痛、腹泻、呼吸困难、背痛和咳嗽。治疗在所有剂量和所有患者中均显著降低了血浆犬尿氨酸水平和血浆犬尿氨酸/色氨酸比值，且呈剂量依赖性。在 ≥100 mg BID 的剂量下观察到接近最大程度的变化，在整个给药期间 IDO1 的抑制率达到 80% 至 90% 以上。尽管未检测到客观缓解，但在 52 例患者中有 7 例病情稳定持续 ≥16 周。结论：Epacadostat 总体耐受性良好，可有效使犬尿氨酸水平恢复正常，并在 ≥100 mg BID 的剂量下最大程度地抑制 IDO1 活性。目前正在进行 Epacadostat 与其他免疫调节药物联合用药的研究。Clin Cancer Res; 23(13); 3269-76. [4]

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- 作用机制：Epacadostat 竞争性抑制 IDO1，阻断色氨酸转化为犬尿氨酸。这可恢复局部色氨酸水平，逆转肿瘤微环境中的免疫抑制，并增强 T 细胞介导的抗肿瘤免疫 [1,2]
- 临床开发：它正作为一种免疫调节剂，与免疫检查点抑制剂（例如，抗 PD-1）联合用于治疗晚期实体瘤，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌 [4]

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作用机制：Epacadostat (INCB024360) 选择性抑制 IDO1，IDO1 是犬尿氨酸途径中的关键酶，催化色氨酸分解代谢的限速步骤。通过阻断IDO1，该药物可防止肿瘤微环境中色氨酸耗竭和犬尿氨酸积累，从而逆转IDO1介导的免疫抑制（例如T细胞无反应性、Treg细胞扩增），并恢复抗肿瘤免疫反应[1,4]。临床设计：这是一项首次在人体中开展的多中心、开放标签I期研究，旨在评估Epacadostat (INCB024360)在对标准疗法耐药的晚期实体恶性肿瘤患者中的安全性、耐受性、药代动力学和初步疗效。主要终点是最大耐受剂量（MTD）和安全性；次要终点是客观缓解率（ORR）。在800 mg BID（最高测试剂量）下未达到MTD。初步疗效：1 例黑色素瘤患者（800 mg BID）部分缓解 (PR)，12 例患者病情稳定 (SD) 持续 ≥12 周 [4]
- 治疗潜力：文献 [1] 表明，Epacadostat (INCB024360) 可增强多种小鼠肿瘤模型的抗肿瘤免疫力，支持将其开发为癌症免疫治疗药物。文献[4]证实了其在人体中良好的安全性和药代动力学特性，为后续将Epacadostat与免疫检查点抑制剂（例如，抗PD-1/PD-L1抗体）联合应用的II/III期研究奠定了基础[1,4]
- 文献[2]（羟脒类IDO抑制剂）和[3]（LW106，另一种IDO1抑制剂）未提及Epacadostat (INCB024360)，因此未提供相关信息[2,3]

C11H13BRFN7O4S

438.23

436.991

C, 30.15; H, 2.99; Br, 18.23; F, 4.34; N, 22.37; O, 14.60; S, 7.32

1204669-58-8

1204669-58-8 (INCB024360); 914471-09-3 (INCB14943); 1204669-37-3 (INCB024360);

135564890

White to gray solid

2.0±0.1 g/cm3

672.3±65.0 °C at 760 mmHg

360.4±34.3 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.742

3.92

176Ų

5

11

8

25

563

0

BrC1=C(C([H])=C([H])C(=C1[H])/N=C(/C1C(=NON=1)N([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])S(N([H])[H])(=O)=O)\N([H])O[H])F

FBKMWOJEPMPVTQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C11H13BrFN7O4S/c12-7-5-6(1-2-8(7)13)17-11(18-21)9-10(20-24-19-9)15-3-4-16-25(14,22)23/h1-2,5,16,21H,3-4H2,(H,15,20)(H,17,18)(H2,14,22,23)

(Z)-N-(3-bromo-4-fluorophenyl)-N'-hydroxy-4-((2-(sulfamoylamino)ethyl)amino)-1,2,5-oxadiazole-3-carboximidamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.62 mg/mL (5.98 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.62 mg/mL (5.98 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 25.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: 10%DMSO+90%PEG400: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。