Activin receptor-like kinase 5 (ALK5) (IC50 = 12.9 nM)
Vactosertib selectively targets ALK5 (TGF-β receptor type I), a serine/threonine kinase that mediates TGF-β signaling. As an ATP-competitive inhibitor, vactosertib binds to the ATP-binding pocket of ALK5, preventing receptor autophosphorylation and downstream SMAD signaling. The compound has an IC₅₀ of 12.9 nM for ALK5 inhibition. By inhibiting TGF-β signaling, vactosertib reduces epithelial-mesenchymal transition (EMT), fibrosis, and tumor metastasis.

用vactosertib（10-1000 nM；30分钟；4T1细胞）处理可剂量依赖性地抑制TGFβ诱导的4T1细胞中Smad2或Smad3的磷酸化[1]。在4T1和MCF10A细胞中，vactosertib抑制TGFβ诱导的Smad2/3核转位。vactosertib对4T1细胞中pSmad3的IC50值范围为10至30 nM[1]。vactosertib抑制TGFβ1诱导的肿瘤细胞迁移和侵袭[1]。TGFβ1可增加FN1、HMGA2（高迁移率族AT钩蛋白2）、SNAI1和SNAI2（分别为Snail家族锌指蛋白1和2）的mRNA水平，并降低CDH1的mRNA水平。此外，vactosertib 可消除 TGFβ1 对上皮间质转化 (EMT) 相关基因的影响[1]。新型 ALK5 激酶抑制剂 EW-7197 可抑制 CML-LICs 的体外生长。EW-7197 可抑制人 CML-LICs 的体外集落形成能力[2]。体外实验表明，vactosertib 可强效抑制 ALK5 激酶活性，IC₅₀ 为 12.9 nM。该化合物对 ALK5 的选择性高于其他激酶，这使其具有靶向作用机制。Vactosertib 可抑制多种癌细胞系中 TGF-β 诱导的 SMAD 磷酸化及其下游靶基因的表达。该化合物可抑制细胞迁移、侵袭和 EMT，展现出其抗转移潜力。

在MMTV/c-Neu雌性小鼠中，vactosertib（40 mg/kg；腹腔注射；隔日一次；持续10周）治疗可抑制肺转移、细胞迁移、侵袭以及Smad/TGFβ信号通路[1]。此外，vactosertib可预防4T1原位移植小鼠和TGFβ处理的乳腺癌细胞的上皮间质转化（EMT）。而且，vactosertib可延长4T1-Luc和4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的生存期，并增强4T1原位移植小鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性[1]。

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酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合EW-7197治疗可延长慢性粒细胞白血病（CML）小鼠的生存期。TKI联合EW-7197可在体内根除小鼠CML-MPP。 EW-7197联合帕纳替尼治疗可抑制TKI耐药的慢性粒细胞白血病（CML）小鼠的疾病复发。[2]
体内研究表明，vactosertib在动物模型中能有效抑制乳腺癌向肺的转移。该化合物可清除CML起始细胞，并在多种癌症模型中显示出疗效。作为一种口服活性药物，vactosertib可达到足够的全身暴露量，从而抑制肿瘤中的TGF-β信号通路。该化合物的抗转移和抗癌特性已在多项临床前研究中得到验证。

蛋白激酶活性测定[1]
使用ProQinase提供的放射性蛋白激酶测定法，在1 × 10⁻⁸、1 × 10⁻⁷、1 × 10⁻⁶和1 × 10⁻⁵ mol/L的浓度下，对Vactosertib (EW7197)针对320种蛋白激酶进行了选择性分析。详细信息见补充材料和方法。
Vactosertib的非细胞酶活性测定包括使用纯化的重组ALK5酶评估其对ALK5激酶活性的抑制作用。将酶与肽底物和ATP在不同浓度的Vactosertib存在下孵育。使用放射性（³³P-ATP）或基于发光（ADP-Glo™）的测定方法测量底物的磷酸化水平。 ALK5抑制的IC₅₀值由剂量反应曲线确定。选择性分析采用一系列相关激酶进行。

Western blot 分析[1]
细胞类型： 4T1 细胞
测试浓度： 10 nM、30 µM、50 nM、100 µM、300 nM、500 nM、1000 nM
孵育时间： 30 分钟
实验结果： 以剂量依赖的方式阻断 TGFβ 诱导的 Smad2 或 Smad3 磷酸化。

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Western blot 分析 [1]
将小鼠组织或细胞在 RIPA 缓冲液中匀浆。取含 4 至 50 μg 总蛋白的裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后电转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 转印膜上。将膜用 5% 牛血清白蛋白封闭，并在 4°C 下与指定的一抗（补充表 S1）孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育。用 Western Blotting Luminol 试剂检测结合的抗体。

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伤口愈合实验[1]
将 4T1 细胞和 MDA-MB-231 细胞接种于 6 孔板中。当每个孔的细胞覆盖率超过 80% 时，将含 10% HI-FBS 的培养基更换为含 0.2% HI-FBS 的培养基。24 小时后，用塑料移液器吸头刮擦细胞形成“伤口”（时间 = 0），然后用 TGFβ1 (2 ng/mL) 处理细胞，并分别在有或无 ALK5 抑制剂的情况下处理 24 小时（4T1）或 53 小时（MDA-MB-231）。使用连接显微镜的相机拍摄细胞相差图像，并利用 ImageJ 程序测量零时点或终点时的伤口面积。伤口面积的闭合率以初始伤口面积的百分比计算。

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Matrigel 侵袭实验[1]
将 20 μL 稀释的 33.3% Matrigel 涂覆于 Transwell 小室（直径 6.5 mm，孔径 8 μm；Corning）的上室表面。将 4T1 细胞以每孔 4 × 10⁴ 个细胞的密度接种于 Transwell 小室的上室，培养基为无血清培养基，并添加或不添加 TGFβ1 (2 ng/mL)，同时加入或不加入 ALK5 抑制剂。下室加入与上室相同的培养基，但添加 10% HI-FBS。孵育20小时后，用棉签去除膜上表面残留的细胞，并用荧光显微镜观察膜下表面残留的DAPI染色细胞。每个视野的平均细胞数取自五个随机视野。

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集落形成能力[2]
为了确定Vactosertib (EW7197)联合IM或EW-7197联合ponatinib治疗后的集落形成能力，我们将新鲜分离的CML-LICs与OP-9基质细胞在DMSO或EW-7197存在下共培养24小时。¹⁸ 然后用额外的DMSO、1 μM IM或1 μM ponatinib (AP24534)处理细胞，并继续培养2天（总共3天）。7天后，按照先前描述的方法计数集落。

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原代人 CML-LIC 的集落形成能力 [2]
从 Allcells 公司购买了来自三名 CP-CML 患者的有活力的骨髓单核细胞。用抗 CD34(8G12)、抗 CD38(HIT2)、抗 CD3(SK7)、抗 CD16(3G8)、抗 CD19(SJ25C1)、抗 CD20(L27)、抗 CD14(MϕP9) 和抗 CD56(NCAM16.2) 抗体对细胞进行染色。使用识别 CD3、CD16、CD19、CD20、CD14 和 CD56 的单克隆抗体混合物来鉴定 Lin− 细胞，并纯化 CD34+CD38−Lin− 细胞。¹⁸ 为了确定 Vactosertib (EW7197) 单独使用或与达沙替尼联合使用的效果，将 CD34+CD38−Lin− 细胞在低氧条件 (3% O₂) 下培养于 OP-9 基质细胞上。收集细胞并用 PBS 洗涤后，通过在半固体培养基中培养来评估原始人 CML-LIC 的集落形成能力。
Vactosertib 的体外细胞实验包括用该化合物处理 TGF-β 反应性癌细胞系，并评估 SMAD 信号通路、细胞迁移和侵袭。将细胞用不同浓度的vactosertib（0.1-1000 nM）处理，并用TGF-β刺激。采用Western blotting法检测SMAD2/3磷酸化水平。使用划痕实验或Transwell迁移实验评估细胞迁移能力。使用Matrigel包被的Transwell小室评估细胞侵袭能力。使用MTT或CellTiter-Glo®法检测细胞活力。

动物/疾病模型：乳腺肿瘤病毒 (MMTV)/c-Neu 雌性小鼠（32 周龄）[1]
剂量：40 mg/kg
给药途径：腹腔注射；隔日一次；持续 10 周
实验结果：抑制 MMTV/c-Neu 小鼠的 Smad/TGFβ 信号通路、细胞迁移、侵袭和肺转移。

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乳腺癌模型 #1（使用 MMTV/c-Neu 小鼠）[1]
当乳腺肿瘤总体积达到 100 mm3 时，将 32 周龄的 MMTV/c-Neu 小鼠随机分组，并分别腹腔注射生理盐水（Veh；n = 7）或溶于生理盐水的 Vactosertib (EW7197)·HCl（43.7 mg/kg；相当于 40 mg/kg EW-7197，n = 10），每周三次，持续 10 周。

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乳腺癌模型 #2、#3 和 #4（使用 4T1 原位移植小鼠）[1]
在疗效实验（模型 #2 和将1.2 × 10⁴个4T1细胞悬浮于生理盐水中，并植入雌性BALB/c小鼠左侧乳腺脂肪垫（#4）（50 μL/只；第0天）。每周测量肿瘤大小和体重。从第4天开始，每周五次给小鼠口服人工胃液（Veh）、溶于Veh的Vactosertib（EW7197）（5或20 mg/kg）或LY2157299（40或80 mg/kg），共28天（模型#2；n = 10/组）。从第4天开始，每周三次给小鼠口服Veh或Vactosertib（EW7197）（5、10、20或40 mg/kg），共28天（模型#3；n = 6～8/组）。在模型#3的TGFβ1挑战实验中，每组选取2只小鼠，于第28天用指定浓度的EW-7197处理。30分钟后，每组1只小鼠静脉注射TGFβ1（50 ng/只），另一只小鼠不进行任何处理。TGFβ1注射后90分钟，处死小鼠。在生存实验（模型#4）中，注射1.6 × 10⁴个4T1细胞，方法与模型#2相同，从第7天开始，每周5次口服给予溶于Veh的载体或EW-7197（2.5或5 mg/kg），直至小鼠死亡（n = 11/组）。

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乳腺癌模型#5采用4T1-luc尾静脉注射小鼠模型[1]
4T1-luc细胞[2 × 10⁵;将转染了质粒构建体 pGL4(CMV-Luc) 的细胞悬浮于生理盐水中，并注射到雌性 BALB/c 小鼠的尾静脉（50 μL/只；第 0 天）。从第 0 天开始，每周五次给小鼠口服人工胃液 (Veh) 或溶于 Veh 的 Vactosertib (EW7197)（0.625、1.25、2.5 或 5 mg/kg），直至小鼠死亡（每组 n = 13）。在第 15 天，使用活体成像系统分析存活小鼠，以比较肺部转移情况。使用 IVIS-200 系统对荧光素酶阳性的 4T1 细胞进行成像。使用 Living Image 软件对采集的图像进行定量分析。

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乳腺癌模型 #6：4T1-luc 原位移植小鼠 [1]
将 4T1-luc 细胞 [3 × 10⁴；转染质粒构建体 pGL4(CMV-Luc)] 植入雌性 BALB/c 小鼠左侧第 4 乳腺脂肪垫，方法与模型 #2 相同（第 0 天）。每周测量肿瘤大小和体重。将溶于人工胃液 (Veh) 的 Vactosertib (EW7197) (2.5、5、10 或 20 mg/kg) 每周五次 (2.5、5 或 10 mg/kg) 或每周三次 (20 mg/kg) 经口给予小鼠，从第 4 天开始，共持续 28 天 (n = 15/组)。

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小鼠存活率 [2]
对于使用 CML 小鼠进行的“TKI 不敏感”存活实验，在移植 BCR-ABL1 + CML-MPP 后第 8-90 天，通过灌胃给予小鼠 IM（诺华公司，巴塞尔，瑞士）（200 mg/kg/天）。¹⁸ 对于使用 T315I CML 小鼠进行的“TKI 耐药”复发实验，通过口服给予小鼠 ponatinib (AP24534)。在 BCR-ABL1-T315I+ CML-MPP 移植后第 8-60 天，采用灌胃法（15 mg/kg/天）给药。在这两种情况下，我们都使用了 Vactosertib (EW7197) 的储备液，该储备液在人工胃液溶液（900 mL 双蒸水，含 2.0 g NaCl、7 mL 浓盐酸和 3.2 g 胃蛋白酶）中配制为 2 μg/mL。在移植 BCR-ABL1 + CML-MPP 后第 15 至 90 天，或在移植 BCR-ABL1-T315I + CML-MPP 后第 15 至 60 天，每隔 3 天，将该混合物稀释于人工胃液中，通过灌胃法给予患有 CML 的小鼠，以达到 2.5 mg EW-7197/kg 体重的最终浓度。在“TKI不敏感”实验中监测小鼠存活125天，在“TKI耐药”复发实验中监测小鼠存活100天。

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药代动力学[2]
为了评估Vactosertib (EW7197)的药代动力学，将四环素诱导型tg-CML小鼠禁食过夜，然后按照上述方法通过灌胃给予Vactosertib (EW7197)（10 mg/kg）。在治疗前以及治疗后30分钟、2小时、4小时和8小时采集血样。采用液相色谱/串联质谱法测定血浆中 EW-7197 的浓度，所用仪器为安捷伦 1200 系列高效液相色谱仪和配备电喷雾电离源的安捷伦 6410 三重四极杆质谱仪。

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采用 Duolink® 原位 PLA 技术进行药效学研究[2]
基于 Smad3 的磷酸化测定 Vactosertib (EW7197) 的药效学。通过灌胃法给予四环素诱导的 tg-CML 小鼠 Vactosertib (EW7197) (2.5 mg/kg)。然后，我们使用FACSAria III流式细胞仪（BD Biosciences）从tg-CML小鼠中分离出含有原始LT-CML干细胞（CD150+CD135−CD48−KLS细胞）的细胞组分。²⁷采用高灵敏度的Duolink®原位PLA技术，使用抗Smad3抗体和兔抗磷酸化Ser423/425 Smad3（ab51451）抗体检测细胞中的磷酸化Smad3。

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外周血白细胞计数测定[2]
CML小鼠接受达沙替尼（5 mg/kg/天）加载体或Vactosertib (EW7197)（每三天2.5 mg/kg）灌胃给药，持续30天。血细胞计数方面，从眶后静脉采集外周血，置于肝素化微量离心管中，并在 CellTac 分析仪上进行分析。
在小鼠异种移植和转移模型中开展了 vactosertib 的体内动物实验。荷瘤小鼠通过灌胃给予 vactosertib，剂量范围为每日 10-50 mg/kg。通过游标卡尺测量监测肿瘤生长抑制情况。在转移模型中，计数肺部或其他器官中的转移结节数量。通过免疫组织化学方法检测磷酸化 SMAD2/3 来评估肿瘤组织中的 TGF-β 信号通路。药代动力学研究表征了药物的吸收和组织分布。

EW-7197 在 tg-CML 小鼠中的药代动力学和药效学 [2]
接下来，我们通过评估治疗后血浆浓度-时间曲线，确定了 EW-7197 在四环素诱导的 tg-CML 小鼠血液中的药代动力学。我们观察到 EW-7197 能迅速从 tg-CML 小鼠的胃肠道吸收进入血液，并以 3.26 ± 2.47 小时的末端半衰期 (T1/2) 消除（图 2a）。给药 30 分钟后，血浆中药物的最大浓度 (Cmax) 为 625.0 ± 529.7 ng/mL (n = 7)。
盐酸伐托替尼的分子量为 501.94，分子式为 C₂₃H₂₁ClN₆O₃·HCl。该化合物在室温下为固体，纯度≥97%。它可溶于DMSO和其他有机溶剂。通常储存于-20°C，避光防潮。Vactosertib具有良好的口服生物利用度和药代动力学特性，支持每日一次给药。

在临床前研究中，Vactosertib 在治疗剂量下通常耐受性良好。作为一种 TGF-β 抑制剂，它可能对免疫功能和组织稳态产生影响。处理该化合物时应遵循标准的实验室安全预防措施。它可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。该化合物尚未获准用于人体，仅供研究用途。

[1]. EW-7197, a novel ALK-5 kinase inhibitor, potently inhibits breast to lung metastasis. Mol Cancer Ther. 2014 Jul;13(7):1704-16.

[2]. Novel oral transforming growth factor-β signaling inhibitor EW-7197 eradicates CML-initiating cells. Cancer Sci. 2016 Feb;107(2):140-8.

Vactosertib 正在临床试验 NCT03724851 中进行研究（Vactosertib 联合帕博利珠单抗治疗转移性结直肠癌或胃癌）。Vactosertib 是一种口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，可抑制转化生长因子 (TGF)-β 受体 1 型 (TGFBR1)，也称为激活素受体样激酶 5 (ALK5)，并具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，Vactosertib 可抑制 TGFBR1 活性并阻断 TGF-β/TGFBR1 介导的信号通路。这可抑制 TGFBR1 过表达的肿瘤细胞的生长。TGFBR1 在多种肿瘤细胞类型中过表达，并在肿瘤细胞增殖中发挥关键作用。TGF-β 的表达可促进肿瘤细胞增殖、增强肿瘤细胞迁移并抑制宿主免疫系统对肿瘤细胞的反应。晚期肿瘤会产生过量的转化生长因子β (TGFβ)，从而促进晚期恶性肿瘤的进展。本研究旨在开发抗TGFβ疗法用于癌症治疗。我们合成了一种新型小分子TGFβ受体I激酶（激活素受体样激酶5）抑制剂，命名为N-[[4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]-2-氟苯胺 (EW-7197)，并研究了其在小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)/c-Neu小鼠和4T1原位移植小鼠中的潜在抗转移疗效。 EW-7197抑制了MMTV/c-Neu小鼠和4T1原位移植小鼠的Smad/TGFβ信号通路、细胞迁移、侵袭和肺转移。EW-7197还抑制了TGFβ处理的乳腺癌细胞以及4T1原位移植小鼠的上皮-间质转化（EMT）。此外，EW-7197增强了4T1原位移植小鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性，并延长了4T1-Luc和4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的生存期。总之，EW-7197表现出强大的体内抗转移活性，表明其具有作为抗癌疗法的潜力。 [1] 近年来，慢性粒细胞白血病 (CML) 的治疗策略主要集中于探索酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的新组合，以及寻找能够根除 CML 白血病起始细胞 (CML-LIC) 的新型转化研究药物。然而，人们对这类靶向 CML-LIC 的疗法可能给 CML 患者带来的治疗获益知之甚少。本研究探讨了 EW-7197（一种口服生物利用度高的转化生长因子-β 信号通路抑制剂，近期已获美国国立卫生研究院 (NIH) 批准作为研究性新药）在体内抑制 CML-LIC 的治疗潜力。与单独使用 TKI 治疗相比，TKI 联合 EW-7197 治疗可显著延缓 CML 小鼠的疾病复发并延长其生存期。值得注意的是，即使 CML-LICs 表达 TKI 耐药的 T315I 突变型 BCR-ABL1 癌基因，EW-7197 与 TKI 联合治疗也能有效清除这些细胞。总之，这些结果表明 EW-7197 可能是一种有前景的新疗法，与 TKI 联合使用可以根除 CML-LICs，从而极大地造福 CML 患者。[2]
盐酸伐克替尼（EW-7197 盐酸盐；CAS 1352610-25-3）是一种强效的口服活性 ATP 竞争性 ALK5 抑制剂，IC₅₀ 为 12.9 nM。它具有抗转移和抗癌特性。在临床前模型中，伐克替尼能有效抑制乳腺癌向肺癌的转移并根除 CML 起始细胞。该化合物可从多家商业供应商处获得，用于研究用途。

C22H19CLFN7

435.884565591812

435.137

C, 60.62; H, 4.39; Cl, 8.13; F, 4.36; N, 22.49

1352610-25-3

Vactosertib;1352608-82-2

54766014

Light yellow to yellow solid powder

83.8

3

6

5

31

566

0

C(C1=NC(C2=CC=CC(C)=N2)=C(C2C=CC3=NC=NN3C=2)N1)NC1C=CC=CC=1F.Cl

UDRJLVATGDHMJM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18FN7.ClH/c1-14-5-4-8-18(27-14)22-21(15-9-10-20-25-13-26-30(20)12-15)28-19(29-22)11-24-17-7-3-2-6-16(17)23/h2-10,12-13,24H,11H2,1H3,(H,28,29)1H

N-((4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-5-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)methyl)-2-fluoroaniline hydrochloride

EW-7197 Hydrochloride; EW7197 HCl; Vactosertib Hydrochloride; 1352610-25-3; EW-7197 Hydrochloride; Vactosertib HCl; Vactosertib (Hydrochloride); 2-fluoro-N-[[5-(6-methylpyridin-2-yl)-4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]aniline;hydrochloride; N-((4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-5-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)methyl)-2-fluoroaniline hydrochloride; Vactosertib HCl; EW7197 Hydrochloride; EW 7197 HCl; EW 7197 Hydrochloride; EW-7197 HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~50 mg/mL (~114.71 mM)
DMSO : ~50 mg/mL (~114.71 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 65 mg/mL (149.12 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。