Activin receptor-like kinase 5 (ALK5) (IC50 = 12.9 nM)

用 vactosertib（10-1000 nM；30 分钟；4T1 细胞）处理可抑制 4T1 细胞中由 TGFβ 产生的 Smad2 或 Smad3 磷酸化，呈剂量依赖性[1]。在 4T1 和 MCF10A 细胞中，vactosertib 抑制 TGFβ 引起的 Smad2/3 核转位。 Vactosertib 对 4T1 细胞中 pSmad3 的 IC50 值范围为 10 至 30 nM[1]。 vactosertib 可抑制 TGFb1 诱导的肿瘤细胞迁移和侵袭[1]。 TGFβ1 增加 FN1、HMGA2（高迁移率组 AT-hook 2）、SNAI1 和 SNAI2（分别为 Snail 家族锌指 1 和 2）的 mRNA 水平，并降低 CDH1 的 mRNA 水平。此外，vactosertib 消除了 TGFβ1 对与上皮间质转化 (EMT) 相关基因的影响[1]。

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新型ALK5激酶抑制剂EW-7197在体外抑制CML-LIC的生长。EW-7197抑制人慢性粒细胞白血病LICs的体外集落形成能力[2]。

在 MMTV/c-Neu 雌性小鼠中，vactosertib（40 mg/kg；腹腔注射；每隔一天；持续 10 周）治疗可抑制肺转移、细胞迁移、侵袭和 Smad/TGFβ 信号传导[1]。此外，vasosertib 还可防止 4T1 原位移植小鼠和 TGFβ 处理的乳腺癌细胞发生上皮间质转化 (EMT)。此外，vactosertib 可延长 4T1-Luc 和 4T1 乳腺肿瘤荷瘤小鼠的生存期，并增加 4T1 原位移植小鼠的细胞毒性 T 淋巴细胞活性[1]。

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TKI联合EW-7197治疗慢性粒细胞白血病小鼠的延长生存期。 TKI联合EW-7197在体内根除小鼠CML‐MPPs。 EW-7197联合波那替尼治疗抑制TKI耐药CML小鼠的疾病复发。[2]

蛋白激酶测定[1]
使用ProQinase提供的放射性蛋白激酶测定法，在1×10−8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol/L的剂量下，对Vactosertib（EW7197）对320种蛋白激酶进行了选择性分析。详细信息见补充材料和方法。

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： 4T1 细胞
测试浓度： 10 nM、30 µM、50 nM、100 µM、300 nM、500 nM，1000 nM
孵育时间： 30 分钟
实验结果： 以剂量依赖性方式阻断 TGFb 诱导的 Smad2 或 Smad3 磷酸化。

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蛋白质印迹分析[1]
将小鼠组织或细胞在RIPA缓冲液中均质化。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离含有4至50μg总蛋白的裂解物，然后将其电泳转移到聚偏二氟乙烯转移膜上。用5%牛血清白蛋白封闭膜，并在4°C下与指定的一抗一起孵育过夜（补充表S1）。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗一起孵育。用Western Blotting Luminol试剂检测结合抗体。

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伤口愈合试验[1]
将4T1细胞和MDA-MB-231细胞接种在6孔板中。当每个孔的面积超过80%被细胞占据时，将10%的HI-FBS培养基改为0.2%的HI-FBS-培养基。24小时后，用塑料移液管尖端刮擦形成“伤口”（时间=0），用TGFβ1（2 ng/mL）在有或没有ALK5抑制剂的情况下处理细胞24小时（4T1）或53小时（MDA-MB-231）。根据显微镜上连接的相机捕获的细胞相位对比图像，使用ImageJ程序测量零时间或终点的伤口面积。伤口面积的闭合以初始伤口面积的百分比计算。

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基质胶侵袭试验[1]
Transwell（直径6.5-mm，孔径8-μm；康宁）的上表面涂有20μL稀释的33.3%Matrigel。在有或没有ALK5抑制剂的情况下，将4T1细胞以每孔4×104个细胞的速度接种在Transwell的上腔中，在无血清培养基中加入或不加入TGFβ1（2ng/mL）。下腔室内填充了与上腔相同的培养基，但含有10%的HI-FBS。孵育20小时后，用棉签去除膜上表面残留的细胞，并使用荧光显微镜观察底面残留的DAPI染色细胞。从五个随机场中获得每个视场的平均细胞数。

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菌落形成能力[2]
为了确定Vactosertib（EW7197）加IM或EW-7197加ponatinib联合治疗后的集落形成能力，我们在DMSO或EW-7217的存在下，将新鲜分离的CML-LIC在OP-9基质细胞上共培养24小时。18然后用额外的DMSO、1μM IM或1μM ponatinip（AP24534）处理细胞，并再培养2天（共3天）。如前所述，7天后对菌落进行了计数。

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原发性人类慢性粒细胞白血病-LIC的集落形成能力[2]
来自三名慢性粒细胞白血病患者的活骨髓单核细胞购自Allcells。细胞用抗CD34（8G12）、抗CD38（HIT2）、抗-CD3（SK7）、抗CD16（3G8）、抗/CD19（SJ25C1）、抗CD20（L27）、反CD14（MϕP9）和抗CD56（NCAM16.2）抗体染色。使用识别CD3、CD16、CD19、CD20、CD14和CD56的单克隆抗体混合物来鉴定Lin−细胞，并纯化CD34+CD38-Lin-细胞。18为了确定单独使用或Vactosertib (EW7197)加达沙替尼组合使用Vactosertib（EW7197）的效果，在缺氧条件下（3%O2）在OP−9基质细胞上培养CD34+CD38-2in−细胞。在PBS中收获和洗涤后，通过在半固体培养基中培养来评估原始人类CML-LIC的集落形成能力。

动物/疾病模型：乳腺肿瘤病毒 (MMTV)/c-Neu 雌性小鼠（32 周龄）[1]
剂量：40 mg/kg
给药途径：腹腔注射；隔日一次；持续 10 周
实验结果： 抑制 MMTV/c-Neu 小鼠的 Smad/TGFβ 信号通路、细胞迁移、侵袭和肺转移。

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\n\n乳腺癌模型 #1：使用 MMTV/c-Neu 小鼠 [1]
\n当乳腺肿瘤总体积达到 100 mm3 时，将 32 周龄的 MMTV/c-Neu 小鼠随机分组，并分别腹腔注射生理盐水（Veh；n = 7）或溶于生理盐水的 Vactosertib (EW7197)·HCl（43.7 mg/kg；相当于 40 mg/kg EW-7197，n = 10），每周三次，持续 10 周。\n

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\n乳腺癌模型 #2、#3 和 #4：使用 4T1 原位移植小鼠[1]在疗效实验（模型#2和#3）中，将1.2 × 10⁴个4T1细胞悬浮于生理盐水中，并植入雌性BALB/c小鼠的左侧乳腺脂肪垫（#4）（50 μL/只；第0天）。每周测量肿瘤大小和体重。从第4天开始，每周五次，连续28天，分别给小鼠口服人工胃液（Veh）、溶于Veh的Vactosertib（EW7197）（5或20 mg/kg）或LY2157299（40或80 mg/kg）（模型#2；n = 10/组）。从第4天开始，每周三次给小鼠注射载体或Vactosertib (EW7197)（5、10、20或40 mg/kg），共持续28天（模型#3；每组n=6～8只）。在模型#3的TGFβ1刺激实验中，从每组中随机选取2只小鼠，于第28天用指定浓度的EW-7197处理。30分钟后，每组1只小鼠静脉注射TGFβ1（50 ng/只），另一只小鼠不进行任何处理。TGFβ1注射90分钟后，处死小鼠。在生存实验（模型#4）中，按照模型#2的方法注射1.6 × 10⁴个4T1细胞，并将溶于Veh的Veh或EW-7197（2.5或5 mg/kg）从第7天开始，每周五次口服给小鼠，直至死亡（n = 11/组）。\n

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\n乳腺癌模型#5采用4T1-luc尾静脉小鼠模型[1]
\n将4T1-luc细胞[2 × 10⁵；转染质粒构建体pGL4(CMV-Luc)]悬浮于生理盐水中，并注射到雌性BALB/c小鼠的尾静脉中（50 μL/只；第0天）。将溶于 Veh 的人工胃液 (Veh) 或 Vactosertib (EW7197) (0.625、1.25、2.5 或 5 mg/kg) 每周五次经口给予小鼠，从第 0 天开始直至死亡（每组 n = 13）。在第 15 天，使用体内成像系统分析存活小鼠，以比较肺部转移情况。使用 IVIS-200 系统对荧光素酶阳性的 4T1 细胞进行成像。使用 Living Image 软件对采集的图像进行定量分析。\n

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\n乳腺癌模型 #6，使用 4T1-luc 原位移植小鼠 [1]
\n4T1-luc 细胞 [3 × 104;将转染了质粒构建体pGL4(CMV-Luc)的肿瘤细胞植入雌性BALB/c小鼠左侧第4乳腺脂肪垫，方法与模型2相同（第0天）。每周测量肿瘤大小和体重。将溶于人工胃液 (Veh) 的 Vactosertib (EW7197) (2.5、5、10 或 20 mg/kg) 每周五次 (2.5、5 或 10 mg/kg) 或每周三次 (20 mg/kg) 灌胃给小鼠，从第 4 天开始，共 28 天 (n = 15/组)。\n

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\n\n小鼠存活率 [2]
\n对于使用 CML 小鼠的“TKI 不敏感”存活实验，在移植 BCR-ABL1 + CML-MPP 后第 8-90 天，通过灌胃给予小鼠 IM（诺华，巴塞尔，瑞士）（200 mg/kg/天）。18 对于使用 T315I CML 小鼠的“TKI 耐药”复发实验，使用 ponatinib (AP24534)在移植 BCR‐ABL1‐T315I+ CML‐MPP 后的第 8 至 60 天，通过灌胃法（15 mg/kg/天）给予小鼠。在这两种情况下，我们都使用了 Vactosertib (EW7197) 的储备液，该储备液在人工胃液溶液（900 mL 双蒸水，含 2.0 g NaCl、7 mL 浓 HCl 和 3.2 g 胃蛋白酶）中配制成 2 μg/mL 的浓度。在移植 BCR-ABL1 + CML-MPP 后第 15 至 90 天，或在移植 BCR-ABL1-T315I + CML-MPP 后第 15 至 60 天，每隔 3 天，将该混合物稀释于人工胃液中，通过灌胃法给予患有 CML 的小鼠，以达到 2.5 mg EW-7197/kg 体重的最终浓度。在“TKI不敏感”实验中监测小鼠存活125天，在“TKI耐药”复发实验中监测小鼠存活100天。\n

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\n药代动力学[2]
\n为了评估Vactosertib (EW7197)的药代动力学，将四环素诱导型tg-CML小鼠禁食过夜，然后按照上述方法通过灌胃给予Vactosertib (EW7197) (10 mg/kg)。在治疗前以及治疗后30分钟、2小时、4小时和8小时采集血样。采用液相色谱/串联质谱法，使用配备电喷雾电离源的安捷伦1200系列高效液相色谱仪和安捷伦6410三重四极杆质谱仪测定EW-7197的血浆浓度。\n

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\n采用Duolink®原位PLA技术进行药效学研究[2]
\n基于Smad3磷酸化测定Vactosertib (EW7197)的药效学。通过灌胃法给予四环素诱导的tg-CML小鼠Vactosertib (EW7197) (2.5 mg/kg)。然后，我们使用FACSAria III流式细胞仪（BD Biosciences）从tg-CML小鼠中分离出含有原始LT-CML干细胞（CD150+CD135−CD48−KLS细胞）的细胞组分。27 使用抗Smad3抗体和兔抗磷酸化Ser423/425 Smad3（ab51451）抗体，通过高灵敏度的Duolink®原位PLA技术检测细胞中的磷酸化Smad3。\n

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\n外周血白细胞计数[2]
\nCML小鼠接受达沙替尼（5 mg/kg/天）加载体或Vactosertib（EW7197）（每三天2.5 mg/kg）灌胃，持续30天。对于血细胞计数，从眶后静脉采集外周血，置于肝素化微量离心管中，并在 CellTac 分析仪上进行分析。

EW-7197 在 tg-CML 小鼠体内的药代动力学和药效学 [2]
接下来，我们通过评估 EW-7197 治疗后血浆浓度-时间曲线，确定了其在四环素诱导型 tg-CML 小鼠血液中的药代动力学。我们观察到，EW-7197 能迅速从 tg-CML 小鼠的胃肠道吸收进入血液，并以 3.26 ± 2.47 小时的终末半衰期 (T1/2) 消除（图 2a）。给药后 30 分钟测得药物在血浆中的最大浓度 (Cmax) 为 625.0 ± 529.7 ng/mL (n = 7)。

[1]. EW-7197, a novel ALK-5 kinase inhibitor, potently inhibits breast to lung metastasis. Mol Cancer Ther. 2014 Jul;13(7):1704-16.

[2]. Novel oral transforming growth factor-β signaling inhibitor EW-7197 eradicates CML-initiating cells. Cancer Sci. 2016 Feb;107(2):140-8.

Vactosertib 正在临床试验 NCT03724851（Vactosertib 联合帕博利珠单抗治疗转移性结直肠癌或胃癌）中进行研究。
Vactosertib 是一种口服生物利用度高的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，可抑制转化生长因子 (TGF)-β 受体 1 型 (TGFBR1)，也称为激活素受体样激酶 5 (ALK5)，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，Vactosertib 可抑制 TGFBR1 的活性，并阻断 TGF-β/TGFBR1 介导的信号传导。这可抑制 TGFBR1 过表达肿瘤细胞的生长。TGFBR1 在多种肿瘤细胞类型中过表达，在肿瘤细胞增殖中起着关键作用。TGF-β 的表达可促进肿瘤细胞增殖，增强肿瘤细胞的迁移，并抑制宿主免疫系统对肿瘤细胞的反应。

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晚期肿瘤会产生过量的转化生长因子β (TGFβ)，从而促进恶性肿瘤晚期的进展。本研究旨在开发抗TGFβ疗法用于癌症治疗。我们合成了一种新型小分子TGFβ受体I激酶（激活素受体样激酶5）抑制剂，命名为N-[[4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]-2-氟苯胺 (EW-7197)，并研究了其在小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)/c-Neu小鼠和4T1原位移植小鼠中的潜在抗转移疗效。 EW-7197抑制了MMTV/c-Neu小鼠和4T1原位移植小鼠的Smad/TGFβ信号通路、细胞迁移、侵袭和肺转移。EW-7197还抑制了TGFβ处理的乳腺癌细胞和4T1原位移植小鼠的上皮间质转化（EMT）。此外，EW-7197增强了4T1原位移植小鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性，并延长了4T1-Luc和4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的生存期。总之，EW-7197 显示出强大的体内抗转移活性，表明其具有作为抗癌疗法的潜力。[1] 近年来，慢性粒细胞白血病 (CML) 患者的治疗策略主要集中于探索酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的新组合，以及寻找能够根除 CML 白血病起始细胞 (CML-LIC) 的新型转化研究药物。然而，人们对这类靶向 CML-LIC 的疗法可能给 CML 患者带来的治疗益处知之甚少。在本研究中，我们探讨了 EW-7197（一种口服生物利用度高的转化生长因子-β 信号通路抑制剂，近期已获美国国立卫生研究院 (NIH) 批准作为研究性新药）在体内抑制 CML-LIC 的治疗潜力。与单独使用 TKI 治疗相比，对 CML 小鼠联合使用 TKI 和 EW-7197 可显著延缓疾病复发并延长生存期。值得注意的是，即使CML-LICs表达TKI耐药的T315I突变型BCR-ABL1癌基因，EW-7197联合TKI治疗也能有效清除这些细胞。综上所述，这些结果表明EW-7197可能是一种有前景的新疗法，它与TKI联合使用可根除CML-LICs，从而极大地造福CML患者。[2]

C22H19CLFN7

435.884565591812

435.137

C, 60.62; H, 4.39; Cl, 8.13; F, 4.36; N, 22.49

1352610-25-3

Vactosertib;1352608-82-2

54766014

Light yellow to yellow solid powder

83.8

3

6

5

31

566

0

C(C1=NC(C2=CC=CC(C)=N2)=C(C2C=CC3=NC=NN3C=2)N1)NC1C=CC=CC=1F.Cl

UDRJLVATGDHMJM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18FN7.ClH/c1-14-5-4-8-18(27-14)22-21(15-9-10-20-25-13-26-30(20)12-15)28-19(29-22)11-24-17-7-3-2-6-16(17)23/h2-10,12-13,24H,11H2,1H3,(H,28,29)1H

N-((4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-5-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)methyl)-2-fluoroaniline hydrochloride

EW-7197 Hydrochloride; EW7197 HCl; Vactosertib Hydrochloride; 1352610-25-3; EW-7197 Hydrochloride; Vactosertib HCl; Vactosertib (Hydrochloride); 2-fluoro-N-[[5-(6-methylpyridin-2-yl)-4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]aniline;hydrochloride; N-((4-([1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl)-5-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)methyl)-2-fluoroaniline hydrochloride; Vactosertib HCl; EW7197 Hydrochloride; EW 7197 HCl; EW 7197 Hydrochloride; EW-7197 HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~50 mg/mL (~114.71 mM)
DMSO : ~50 mg/mL (~114.71 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 65 mg/mL (149.12 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。