FIIN-3

FIIN-3 exhibits strong inhibition of both gatekeeper mutants of FGFR2 (EC50 = 64 nM) and WT FGFR (EC50 = 1 to 41 nM). Also, EGFR is significantly inhibited by FIIN-3, with an EC50 of 43 nM. The gatekeeper mutant V564F was effectively inhibited by FIIN-3, while the gatewaykeeper-plus-1 mutant E565K was also successfully targeted by FIIN-3. Furthermore, Ba transformed with EGFR vIII fusion protein (containing the WT EGFR kinase domain) /F3 cells demonstrate antiproliferative activity (EC50 of 135 nM). FIIN-3 exhibited moderate action against the EGFR mutant L858R/T790M mutant, with an EC50 of 231 nM, and greater activity against the EGFR mutant L858R (EC50 of 17 nM). Even at dosages as low as 3 nM, FIIN-3 totally blocked FGFR2 autophosphorylation on Tyr656/657 in WT FGFR2 Ba/F3 cells. FIIN-3 has the ability to partially inhibit FGFR2 mutant V564M autophosphorylation in FGFR2 V564M Ba/F3 cells, and to completely inhibit it at 300 nM [1].

FIIN-3 对 FGFR2 的守门突变体 (EC50 = 64 nM) 和 WT FGFR (EC50 = 1 至 41 nM) 表现出强烈的抑制作用。此外，FIIN-3 显着抑制 EGFR，EC50 为 43 nM。 Gatekeeper突变体V564F被FIIN-3有效抑制，而gatekeeper-plus-1突变体E565K也被FIIN-3成功靶向。此外，用EGFR vIII融合蛋白（含有WT EGFR激酶结构域）转化的Ba/F3细胞表现出抗增殖活性（EC50为135 nM）。 FIIN-3 对 EGFR 突变体 L858R/T790M 突变体表现出中等作用，EC50 为 231 nM，对 EGFR 突变体 L858R 表现出更大的活性（EC50 为 17 nM）。即使剂量低至 3 nM，FIIN-3 也能完全阻断 WT FGFR2 Ba/F3 细胞中 Tyr656/657 上的 FGFR2 自磷酸化。 FIIN-3 能够部分抑制 FGFR2 V564M Ba/F3 细胞中的 FGFR2 突变体 V564M 自磷酸化，并在 300 nM 时完全抑制 [1]。

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FIIN-3 能有效抑制依赖野生型 FGFR1、FGFR2、FGFR3 或 FGFR4 激酶活性的 Ba/F3 细胞的增殖，EC₅₀ 值在个位到十位数纳摩尔范围内，且对 FGFR2 尤其有效（EC₅₀ 约 1 nM）。[1]
FIIN-3 能抑制由 EGFR vIII 融合蛋白（EC₅₀ = 135 nM）、EGFR L858R 突变体（EC₅₀ = 17 nM）以及对第一代EGFR抑制剂耐药的 EGFR L858R/T790M 双突变体（EC₅₀ = 231 nM）转化的 Ba/F3 细胞的增殖。[1]
FIIN-3 能有效抑制依赖 FGFR2 V564M 看门人突变的 Ba/F3 细胞的增殖（EC₅₀ = 64 nM），而第一代抑制剂 BGJ398 对该突变体的 EC₅₀ 超过 1.0 μM。它对 FGFR2 V564F 看门人突变体和 E565K 突变体也显示出良好的效力。[1]
FIIN-3 对一系列携带 FGFR 改变的癌细胞系具有抗增殖活性，包括 H2077 和 H1581（FGFR1 扩增的 NSCLC，EC₅₀ 分别为 5.3 nM 和 2.5 nM）、Kato III（FGFR2 扩增的胃癌，EC₅₀ = 2.5 nM）、AN3 CA（FGFR2 N549K 突变的子宫内膜腺癌，EC₅₀ = 26.2 nM）、RT112（FGFR3/TACC3 融合的膀胱癌，EC₅₀ = 15.9 nM）以及 A2780（FGFR4 扩增的卵巢癌，EC₅₀ = 0.01 nM）。[1]
FIIN-3 对表达 FGFR1 V561M 看门人突变的工程化癌细胞系具有活性（H2077 V561M EC₅₀ = 1.4 nM；H1581 V561M EC₅₀ = 11.8 nM），克服了 BGJ398 所观察到的耐药性。[1]
FIIN-3 能抑制 SKOV-3 卵巢癌细胞系（同时过表达 EGFR 和 FGFR）的增殖，EC₅₀ 为 499 nM，在此背景下比 FIIN-2 或 BGJ398 更有效。其活性在存在外源性 FGF 或 EGF 配体的情况下得到了进一步评估。[1]
在使用表达野生型 FGFR2 的 Ba/F3 细胞进行的细胞洗脱实验中，用 FIIN-3 处理并充分洗涤后，FGFR2 的自磷酸化持续受到抑制，证实了其不可逆的共价作用机制。可逆抑制剂 BGJ398 未观察到这种持续抑制。[1]
在表达 FGFR2 V564M 的 Ba/F3 细胞中，FIIN-3 在 300 nM 浓度下能完全抑制 FGFR2 的自磷酸化及其下游信号蛋白（p-FRS2, p-AKT, p-ERK1/2）的磷酸化。[1]
在表达 FGFR1 V561M 看门人突变的 H1581 细胞中，FIIN-3 以剂量依赖的方式抑制 FGFR1 V561M 的自磷酸化，在 333 nM 浓度下即显示出显著抑制。[1]
在 SKOV-3 细胞中，FIIN-3（1.0 μM）能独特地同时抑制 EGFR 和 FGFR 的磷酸化，并且在 FGF1 刺激后能阻止 p-AKT 和 p-ERK1/2 信号通路的恢复，这与 BGJ398 或 FIIN-2 不同。[1]
在三维微流控分散实验中，FIIN-3（1.0 μM）能抑制 FGF1 诱导的 SKOV-3 细胞球体的分散，并且是所测试化合物中唯一也能阻断 EGF 诱导的分散的化合物。[1]

使用斑马鱼胚胎发育模型评估了 FIIN-3 的体内功效。从受精后2小时开始，用 25 μM 的 FIIN-3 处理胚胎会导致后部中胚层和尾部形态发生缺陷，该表型与 FGFR 信号抑制一致。据报道，其效率低于 BGJ398（测试浓度为 5.0 μM），但高于 AZD4547 和 PD173074。[1]

使用针对 456 种激酶的体外 ATP 位点竞争性结合实验（KinomeScan）在 1.0 μM 浓度下评估了 FIIN-3 的激酶选择性谱。FIIN-3 显示出对 FGFRs 和 EGFR 的强结合力，并具有良好的整体激酶选择性，选择性评分 (S(1)) 为 15。[1]
使用 Z’-lyte 酶活性实验测定了 FIIN-3 对纯化激酶结构域的 IC₅₀ 值。FIIN-3 抑制 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4 的 IC₅₀ 值分别为 13、21、31 和 35 nM。它抑制 EGFR 的 IC₅₀ 为 43 nM。在此生化实验中，它抑制 FGFR1 V561M 看门人突变体的 IC₅₀ 为 109 nM。[1]

细胞活力检测：将 TEL-FGFR2 转化的 Ba/F3 细胞或其他激酶转化的 Ba/F3 细胞接种于 96 孔板中，并用系列稀释的化合物处理。72 小时（或癌细胞系 96 小时）后，使用 MTS 比色法（针对 Ba/F3 细胞）或 CellTiter-Glo 荧光细胞活力检测法（针对癌细胞系）评估细胞活力。使用 GraphPad Prism 软件绘制剂量反应曲线并计算 EC₅₀ 值。[1]
免疫印迹分析：为评估信号通路抑制，在特定条件下（例如，处理 6 或 12 小时，有或无血清饥饿/生长因子刺激）用抑制剂处理细胞。随后裂解细胞，通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，转膜，并用针对目标蛋白总形式及磷酸化形式的特异性抗体进行检测。[1]
细胞洗脱实验：为确认共价抑制，将细胞与抑制剂孵育 3 小时，用 PBS 充分洗涤，然后在新鲜培养基中继续培养 4 小时，之后收集细胞进行免疫印迹分析，以检查是否存在持续的靶标抑制。[1]
三维分散实验：首先将 SKOV-3 细胞培养形成球体。将特定大小的球体包埋在微流控装置内的胶原凝胶中。将含有 FGF1 或 EGF（有或无抑制剂）的培养基灌流通过凝胶两侧的通道。在 48 小时内通过显微镜监测球体的分散情况（细胞从球体中迁出），并对抑制程度进行量化。[1]

斑马鱼胚胎研究：收集野生型斑马鱼（TübingeB品系）胚胎，并在28°C下孵育。受精后2小时（hpf），将15个胚胎置于含有1 mL E3胚胎培养基的24孔板中。向培养基中加入FIIN-3（或溶剂对照DMSO，或其他FGFR抑制剂），使其最终浓度达到25 μM。将处理后的胚胎在28°C下孵育至50 hpf，此时对其后部中胚层和尾部形态发生中的表型缺陷进行评分。使用解剖显微镜采集图像。[1]

[1]. Development of covalent inhibitors that can overcome resistance to first-generation FGFR kinase inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014 Nov 11, 111(45):E4869-77.

N-[4-[[[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯胺基)-氧甲基]-[6-[4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯胺基]-4-嘧啶基]氨基]甲基]苯基]-2-丙烯酰胺属于哌嗪类化合物。

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FIIN-3 是一种新一代不可逆（共价）成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 抑制剂。它采用基于结构的药物设计方法开发，旨在克服由门控突变（例如 FGFR2 中的 V564M、FGFR1 中的 V561M）引起的对第一代 FGFR 抑制剂（如 NVP-BGJ398 和 AZD4547）的耐药性。 [1]
FIIN-3 的一个独特之处在于，它能够通过将单个亲电丙烯酰胺基团靶向 FGFR 和表皮生长因子受体 (EGFR) ATP 结合口袋内空间上不同的半胱氨酸残基（FGFR4 P 环中的 Cys477；EGFR 中的 Cys797），从而作为 FGFR 和 EGFR 的双重共价抑制剂发挥作用。这是首个报道的具有此能力的激酶抑制剂。[1]
FIIN-3 与 FGFR4 V550L 和 EGFR L858R 的共晶结构揭示了其结合模式。在 FGFR4 中，FIIN-3 诱导一种独特的“DFG-out”非活性构象，该构象通过与 Cys477 的共价结合以及由此产生的 π-π 堆积相互作用而稳定。在 EGFR 中，FIIN-3 以“DFG-in”构象结合，并与 Cys797 共价连接。其 4-丙烯酰胺基苄基的柔性使其能够适应不同的结合口袋。[1] 相应的非共价类似物 FIIN-3 (FRIN-3) 对 EGFR 和 FGFR 门控突变体的抑制活性均降低，这凸显了共价键形成对于其强效双重抑制活性（特别是针对 EGFR 及其耐药突变体）的必要性。[1] FIIN-3 对 FGFR 和 EGFR 的双重抑制被认为是一种策略，可以克服在两种受体均参与的癌症中，仅靶向其中一条通路时可能出现的潜在旁路信号传导和耐药机制。[1]

C34H36CL2N8O4

691.606844902039

690.223

1637735-84-2

73707531

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

909.4±65.0 °C at 760 mmHg

503.8±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.683

5.65

124

3

9

11

48

1020

0

SFLKJNSBBVSPFE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C34H36Cl2N8O4/c1-5-30(45)40-24-8-6-22(7-9-24)20-44(34(46)41-33-31(35)26(47-3)18-27(48-4)32(33)36)29-19-28(37-21-38-29)39-23-10-12-25(13-11-23)43-16-14-42(2)15-17-43/h5-13,18-19,21H,1,14-17,20H2,2-4H3,(H,40,45)(H,41,46)(H,37,38,39)

N-(4-((3-(2,6-dichloro-3,5-dimethoxyphenyl)-1-(6-((4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)amino)pyrimidin-4-yl)ureido)methyl)phenyl)acrylamide

FIIN3; FIIN 3; FIIN-3.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~10 mg/mL (~14.46 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (3.61 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。