FM4-64

Fluorescent dye for binding to and staining of cell membranes

1. FM工作溶液的制备
1.1 储备液的制备
用DMSO制备5mM储备液
1.2 工作溶液的制备
使用预热的HBSS溶液制备5-20μM FM4-64工作溶液
注意：请根据您的具体需要调整FM4-64工作溶液的浓度，并现配现用(使用新制备的溶液)
2. 细胞染色（悬浮细胞）
2.1 离心收集细胞，用PBS洗涤两次，每次5分钟。细胞密度为1×10~6/mL
2.2 加入1 mL FM工作溶液，在室温下孵育5-30分钟
2.3 在400g下离心3-4分钟，丢弃上清液
2.4 用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟
将细胞重新悬浮在1 mL无血清培养基或PBS中后，使用荧光显微镜或流式细胞仪进行观察
3. 细胞染色（贴壁细胞）
3.1 在无菌盖玻片上培养贴壁细胞
3.2 从培养基上取下盖玻片，吸出多余的培养基
3.3 加入100μL染料工作液，轻轻摇晃至完全覆盖细胞，孵育5-30分钟
3.4 吸出染料工作液，用培养基洗涤2-3次，每次5分钟，用荧光显微镜或流式细胞仪观察。

在这项研究中，研究人员报告了活细胞核膜（NE）内独特的微环境，这是由荧光染料FM4-64（N-（3-三乙基铵丙基）-4-（对二乙氨基苯基六三烯基）-吡啶鎓2Br）的光谱偏移所揭示的。在生理温度下，染料很容易转移到NE，当在620-650nm下激发时，它表现出增强的荧光，而在内吞途径和内质网（ER）中的激发波长为480-520nm。体外数据表明，染料显示带负电荷的脂质富集，可能是由于局部磷脂合成。FM4-64与有丝分裂过程中的薄层相关多肽-1-绿色荧光蛋白的双激发成像表明，NE的分解在ER中保留了微规模的脂质复合物。癌症或原代细胞中的NE的卷积很容易观察到，T细胞对肿瘤细胞的杀伤以NE中长波长激发荧光的突然丧失为标志，同时发生凋亡。FM4-64作为第一种对NE环境敏感的重要染料的报告为NE的实时可视化和功能研究开辟了新的途径。[2]

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目的：对荧光苯乙烯基染料FM 1-43和FM 4-64进行构象分析，以阐明两种染料对单个催乳素囊泡和质膜的不同活性依赖性标记是否与其结构差异有关。 方法：利用共聚焦显微镜研究FM 1-43和FM 4-64对单个囊泡和质膜的活性依赖性标记。测量与质膜融合的囊泡和单独的质膜的荧光强度；计算它们各自的峰值振幅之比。通过蒙特卡洛方法搜索这些分子的构象空间，进一步对FM 1-43和FM 4-64进行了构象分析。 结果：在囊泡和质膜的FM 1-43染色中，荧光峰振幅的比值（囊泡与质膜）比FM 4-64染色高2.6倍。在FM 4-64分子中，低能构象分布在三种构象状态（分别由3、4和2个构象组成），其中处于给定状态的分子比例分别为62%、28%和9%。在FM 1-43中，构象分布仅限于一种构象状态，其中三种构象大致相等，这可以用分子的更大内在刚性来解释。 结论：观察到的FM 1-43分子的结构特征可能解释了将染料掺入囊泡基质后量子产率和/或结合亲和力的更高增加，因此与FM 4-64相比，荧光发射更强。[3]

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FM染料被广泛用于研究活真核细胞的内吞作用、囊泡运输和细胞器组织。FM染料在植物细胞中的使用越来越多，这引发了关于它们作为内吞标记物的适用性、它们染色哪些细胞器以及它们在囊泡运输网络中遵循的精确途径的争论。本文的主要目的是批判性地评估这场争论在植物细胞方面的现状。为此，提供了FM染料的重要特征、最佳染料浓度、染料储存条件以及染色和成像方案的背景信息。特别强调在双重标记实验中使用FM染料来鉴定特定的细胞器。通过这种方式，首次证明了FM4-64对高尔基体的染色。[4]

[1]. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J Neurosci. 2001 Sep 15;21(18):7013-25.

[2]. Spectral shift of fluorescent dye FM4-64 reveals distinct microenvironment of nuclear envelope in living cells. Traffic. 2006;7(12):1607-1613.

[3]. Distinct labelling of fusion events in rat lactotrophs by FM 1-43 and FM 4-64 is associated with conformational differences. Acta Physiol (Oxf). 2007;191(1):35-42.

[4]. Bolte S, et al, Satiat-Jeunemaitre B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 2004;214(Pt 2):159-173.

Hair cells in mouse cochlear cultures can be selectively labeled by transient exposure to FM1-43 (a styrene-based dye used to study endocytosis and exocytosis). Real-time confocal microscopy showed that the dye entered the cells rapidly, primarily through the apical surface. Cooling to 4°C and high extracellular calcium concentrations reduced the dye loading. Pretreatment with EGTA (which disrupts apical junctions and prevents gating of mechanotransduction channels) eliminated subsequent dye loading in the presence of calcium. After calcium chelation, the dye loading was restored, with a time course similar to that of apical junction regeneration. Although Myo7a mutant hair cells are capable of mechanotransduction, all their mechanotransduction channels are normally closed at rest and are not labeled by FM1-43 unless subjected to strong excitatory stimuli. Extracellular perfusion of FM1-43 reversibly blocked mechanotransduction at low micromolar concentrations. High extracellular calcium ion concentrations can reduce the blocking effect, and the blocking effect is voltage-dependent, weakening at extremely high positive and negative potentials, indicating that FM1-43 is a permeable blocker of mechanotransduction channels. The time course of the blocking effect after the voltage step to extremely high potential further suggests that FM1-43 competes with other cations for binding sites in the channel pores. At intracellular concentrations, FM1-43 does not block the transduction channel, while at the same concentrations, it leads to complete blockade when applied extracellularly. Both calcium chelation and FM1-43 can reduce the ototoxicity of the aminoglycoside antibiotic neomycin sulfate, suggesting that FM1-43 and aminoglycoside antibiotics enter hair cells through the same pathway. [1]

C30H45N3+2.2[BR-]

607.5064

605.198

C, 59.31; H, 7.47; Br, 26.31; N, 6.92

162112-35-8

6508728

Gray to dark gray solid powder

0.377

7.12

0

3

14

35

561

0

CCN(CC)C1=CC=C(C=C1)/C=C/C=C/C=C/C2=CC=[N+](C=C2)CCC[N+](CC)(CC)CC.[Br-].[Br-]

AFVSZGYRRUMOFH-UHFFFAOYSA-L

InChI=1S/C30H45N3.2BrH/c1-6-32(7-2)30-20-18-28(19-21-30)16-13-11-12-14-17-29-22-25-31(26-23-29)24-15-27-33(8-3,9-4)10-5;;/h11-14,16-23,25-26H,6-10,15,24,27H2,1-5H3;2*1H/q+2;;/p-2

3-[4-[(1E,3E,5E)-6-[4-(diethylamino)phenyl]hexa-1,3,5-trienyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium;dibromide

FM4 64; FM464; 162112-35-8; FM4-64; N-(3-Triethylammoniopropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl) hexatrienyl)pyridinium dibromide; 3-[4-[(1E,3E,5E)-6-[4-(Diethylamino)phenyl]hexa-1,3,5-trienyl]pyridin-1-ium-1-yl]propyl-triethylazanium;dibromide; 4-((1E,3E,5E)-6-(4-(diethylamino)phenyl)hexa-1,3,5-trien-1-yl)-1-(3-(triethylammonio)propyl)pyridin-1-ium bromide; 4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexa-1,3,5-trien-1-yl)-1-(3-(triethylammonio)propyl)pyridin-1-ium bromide; FM4-64

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~82.30 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。