Human PNP (IC50 = 1.19 nM); Mouse PNP (IC50 = 0.48 nM); Rat PNP (IC50 = 1.24 nM); Monkey PNP (IC50 = 0.66 nM); Dog PNP (IC50 = 1.57 nM)[2]

呋咯地辛 (10-30 μM) 处理 24 和 48 小时可部分减少 RPMI-8226、MOLT-4 和 5T33MM 细胞的增殖 [1]。 MM 细胞不受呋咯地辛影响（10-30 μM；24 和 48 小时；RPMI-8226、MOLT-4 和 5T33MM 细胞）；然而，呋咯地辛会使 MOLT-4 细胞中活细胞的百分比降低 40%[1]。 Forodesine (BCX-1777) 可抑制各种药物、混合淋巴细胞反应 (MLR) 和白细胞介素 2 (IL-2) 刺激的人淋巴细胞增殖。植物血凝素 (PHA) 的 IC50 值小于 0.1-0.38 μM [2]。

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多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中恶性细胞的单克隆增殖。尽管最近在治疗策略方面取得了进展，但多发性骨髓瘤仍然无法治愈，需要新的治疗靶点。最近发现，嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂呋咯地辛通过增加dGTP水平诱导慢性淋巴细胞白血病患者的白血病细胞凋亡。因此，我们测试了呋咯地辛是否能够通过类似的途径抑制小鼠和人类MM细胞的增殖和/或诱导凋亡。我们发现，在用呋咯地辛治疗48小时后，5T33MM和RPMI-8226 MM细胞中的dGTP略有增加，这与部分增殖抑制和有限的凋亡诱导有关。在研究导致细胞周期阻滞和凋亡的途径时，我们观察到p27、胱天蛋白酶3和BIM的上调。我们可以得出结论，呋咯地辛对MM细胞有一定的影响，但不如已知的对白血病细胞的影响那么显著。然而，呋咯地辛可能对MM中其他已建立的细胞毒性药物具有增强作用[2]。

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PNP酶抑制[2]
BCX-1777非常有效地抑制了人、小鼠、大鼠、猴子和狗的PNP。IC50值范围为0.48至1.57 nM（表1）。所有这些酶在3-10nM时的最大抑制效果约为90%至100%，表明BCX-1777是人类、小鼠、大鼠、猴子和狗PNP的强效抑制剂。

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BCX-1777对IL-2、MLR-和PHA刺激的人T细胞淋巴增殖的抑制作用[2]
我们研究了BCX-1777抑制IL-2诱导的正常供体人PBL增殖的能力，结果如图1A所示。在dGuo（10μM）存在下，添加BCX-1777对IL-2的增殖反应产生了剂量依赖性抑制，IC50约为0.06μM。在没有dGuo的情况下，BCX-1777的IC50大于100μM。单独使用10μM的dGuo对活化淋巴细胞的增殖没有抑制作用。作为与同种异体排斥反应相关的体外实验，我们评估了BCX-1777在混合淋巴细胞反应中抑制四个供体对同种异体抗原刺激的人PBL增殖反应的能力（图1B）。如图1B所示，BCX-1777对这种反应产生了剂量依赖性的抑制作用，在0.05μM时抑制率为50%，在1μM时，抑制率为90-100%。在没有dGuo的情况下，BCX-1777在100μM以下没有明显的抑制作用。还检查了BCX-1777抑制PHA刺激的4名正常供体PBL增殖的能力（图1C）。在10μM dGuo存在下，BCX-1777对PHA刺激的细胞表现出剂量依赖性抑制作用，IC50为0.387μM。在没有dGuo的情况下，没有观察到明显的抑制作用。与未受刺激的淋巴细胞相比，用IL-2和PHA刺激的人淋巴细胞的胸苷掺入量增加了20倍以上，而用MLR刺激时，胸苷掺合量增加了10倍以上。

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T细胞中的核苷酸库[2]
在BCX-1777和10μM dGuo存在的情况下，IL-2刺激的PBL显示出dGTP的积累（表2）。与对照样品相比，0.1μM BCX-1777的dGTP大约增加了4.5倍，1μM BCX-1777的dGTP增加了7.5倍。dGTP的增加与IL-2刺激的T细胞增殖的抑制平行。dGTP增加4.5倍产生52%的抑制作用，dGTP增加7.5倍产生76%的抑制作用。脱氧胞苷抑制激酶介导的dGuo转化为dGMP。为了进一步评估dGTP在T细胞抑制中的作用，在BCX-1777、dGuo和脱氧胞苷存在的情况下进行了增殖和核苷酸分析。脱氧胞苷（3μM）部分逆转了BCX-1777和dGuo对T细胞增殖的抑制作用。用BCX-1777、dGuo和dCyt孵育的T细胞的核苷酸库的测定显示，与用BCX-1777和dGuo孵育细胞相比，dGTP降低。不使用更高浓度（≥10μM）的脱氧胞苷，因为它会抑制T细胞的增殖。

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IL-2刺激小鼠脾细胞增殖[2]
为了评估BCX-1777的特异性，我们评估了BCX-1777在存在和不存在dGuo（10μM）的情况下抑制IL-2诱导的小鼠脾细胞增殖的能力。在存在和不存在dGuo（10μM）的情况下，在高达100μM的BCX-1777浓度下，均未观察到对IL-2诱导的小鼠脾细胞增殖的显著抑制。与人类淋巴细胞不同，在BCX-1777（1μM）和dGuo（10μM）存在的情况下，小鼠脾细胞没有表现出dGTP的积累。

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3.5.口服生物利用度和体内药理活性[2]
口服和静脉注射BCX-1777对血浆水平的影响结果如图3A所示。口服BCX-1777后迅速吸收，半小时内达到约3μM的Cmax。3小时时，血浆药物水平为1.1μM，6小时时检测不到药物。经计算，BCX-1777在小鼠体内的口服生物利用度为63%。

Forodesine (BCX-1777) 在小鼠体内具有出色的口服生物利用度 (63%) [2]。在小鼠中，单剂量 10 mg/kg 的 Forodesine 将 dGuo 升高至约 5 μM [2]。在人外周血淋巴细胞严重联合免疫缺陷（hu-PBL-SCID）小鼠模型中，呋咯地辛可有效延长寿命2倍以上[2]。

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小鼠T细胞模型[2]
在DNFB诱导的接触性迟发型超敏反应小鼠耳水肿模型中评估了呋咯地辛/BCX-1777的体内疗效。迟发型超敏反应是由T细胞介导的。BCX-1777在30mg/kg剂量下对减轻小鼠耳水肿无效。环孢菌素（50mg/kg）用作阳性对照，耳肿胀减少58%。BCX-1777也在移植物抗宿主（GVH）诱导的小鼠脾肿大模型中进行了评估。通过注射对同种异体MHC抗原有反应并诱导全身GVHR症状的亲本T细胞，可以在成年F1小鼠中诱导实验性移植物抗宿主反应（GVHR）。GVHR类似于由T细胞对受体组织的细胞表面抗原反应介导的DTH反应。环孢菌素显著抑制了53%的GVH诱导的脾肿大，而BCX-1777在这种小鼠T细胞模型中无效。

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Hu-PBL SCID小鼠模型[2]
Mosier等人报道了将人PBL移植到SCID小鼠体内以构建hu-PBL SCID小鼠，并建议将其作为研究正常人类免疫功能的有用模型。最近，Sandhu等人[19]描述了一种将hu-PBLs有效植入SCID小鼠的新方案。移植到这些SCID小鼠体内的hu-PBL被证明可以通过诱导人类初级反应发挥作用。该方案的植入效率非常高，几乎100%的hu-PBL SCID小鼠在注射人PBL后不到4周内死于异种移植物抗宿主病（XGVHD）。在SCID小鼠中植入hu-PBL可诱导严重的XGVHD，并伴有体重减轻、腹泻、驼背和皮毛褶皱。这些小鼠最终因人类淋巴细胞浸润SCID小鼠组织而死亡。为了确定呋咯地辛/BCX-1777是否抑制小鼠体内人类T细胞的增殖并影响这些小鼠的寿命，从植入人类PBL前5天开始，以20mg/kg/天（b.i.d.）的剂量口服BCX-1777治疗SCID小鼠。对动物进行药物预处理以保持dGuo水平升高。按照相同的时间表继续给药，直到动物死亡。将来自三个供体的人淋巴细胞移植到三组SCID小鼠（n=10）中。实验动物（n=5）用药物治疗，对照动物（n=5）用载体（0.5%CMC）治疗。图5显示了这些实验中存活小鼠与存活天数的代表性曲线。在一项实验中，BCX-1777处理的小鼠平均寿命为30天，而对照组为15天。在另外两个实验中，BCX-1777治疗的小鼠分别存活了39天和43天，而未治疗组分别存活了17天和20天。因此，在每个实验中，BCX-1777将这些小鼠的寿命延长了2倍或更多（表3）

嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）缺乏症患者表现出选择性T细胞免疫缺陷。因此，PNP抑制剂作为潜在的T细胞选择性免疫抑制剂引起了人们的兴趣。BCX-1777是一种来自人类、小鼠、大鼠、猴子和狗等不同物种的PNP强效抑制剂，IC50值在0.48至1.57 nM之间。BCX-1777在2'-脱氧鸟苷（dGuo，3-10微M）存在下，抑制由白细胞介素-2（IL-2）、混合淋巴细胞反应（MLR）和植物血凝素（PHA）等各种试剂激活的人类淋巴细胞增殖（IC50值<0.1-0.38微M）。BCX-1777是一种比PD141955和BCX-34等其他已知PNP抑制剂强10-100倍的人类淋巴细胞增殖抑制剂。人淋巴细胞的核苷酸分析表明，BCX-1777对增殖的抑制与细胞中的dGTP水平相关[2]。

细胞增殖测定[1]
细胞类型：人 RPMI-8226、人 MOLT-4 (T-ALL) 细胞、5T33MM（多发性骨髓瘤，MM）
测试浓度： 10 μM、20 μM、30 μM
孵育时间： 24 和 48 小时
实验结果： 48 小时后（小时 ）），MOLT-4细胞增殖被完全阻断，5T33MM细胞增殖减少15%。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型：人 RPMI-8226、人 MOLT-4 (T-ALL) 细胞、5T33MM（多发性骨髓瘤，MM）
测试浓度：10 μM、20 μM、30 μM
孵育持续时间：24 小时和 48 小时（hrs）
实验结果： 细胞凋亡的诱导有限。

BCX-1777 在小鼠体内具有极佳的口服生物利用度（63%）。小鼠单次服用 10 mg/kg 剂量的 BCX-1777 后，dGuo 水平可升高至约 5 μM。由于小鼠 T 细胞不像人 T 细胞那样会积累 dGTP，因此 BCX-1777 在小鼠 T 细胞模型（例如迟发型超敏反应 (DTH) 和脾肿大）中无效。然而，在人外周血淋巴细胞重症联合免疫缺陷 (hu-PBL-SCID) 小鼠模型中，BCX-1777 可有效延长小鼠寿命 2 倍或以上。这是首个已知的 PNP 抑制剂，其在小鼠体内可使 dGuo 水平升高至与 PNP 缺陷患者相似的水平。此外，BCX-1777 体外抑制 T 细胞活性也需要达到这样的 dGuo 水平。因此，BCX-1777 代表了一类新型选择性免疫抑制剂，可能对多种 T 细胞疾病具有治疗价值。[2]

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\n\n口服生物利用度和体内药理活性[2]
\n将四只雌性小鼠（Balb/c）分组，分别单次口服或静脉注射溶于无菌生理盐水中的药物。在不同时间点，对小鼠进行麻醉（吸入麻醉），并通过眼眶后静脉丛采血。每个时间点均使用不同的小鼠组。血液经离心后收集血浆，并储存于 -20°C 直至分析。观察动物 48 小时，记录其死亡率和发病率。采用反相高效液相色谱法测定血浆药物浓度，定量限为 0.5 μM。采用反相高效液相色谱法测定脱氧鸟苷浓度，该分析的定量限为 0.75 μM。采用非房室模型和Winnonlin软件计算口服生物利用度。\n

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\n\n小鼠T细胞模型[2]
\n小鼠迟发型超敏反应（DTH）的实验方法参照Braida和Knop以及Walsh等人的描述。简而言之，在第0天和第1天（给药后1小时），将25 μl 0.5% 2,4-二硝基氟苯（DNFB）的丙酮/橄榄油（4:1）溶液涂抹于小鼠剃毛后的腹部皮肤上进行致敏。小鼠每天（qd）分别给予赋形剂、福罗地辛/BCX-1777（30 mg/kg，口服）或环孢素A（50 mg/kg，腹腔注射），连续6天。在第5天，将20 μl 0.3% DNFB丙酮/橄榄油（4:1）溶液涂抹于小鼠右耳，24小时后，用游标卡尺测量耳廓厚度。
\n\n根据Roudebush和Bryant描述的方法，通过腹腔注射亲代品系（C57BL/6）的脾细胞，测量雄性杂交小鼠脾肿大的程度，来评估移植物抗宿主（GVH）反应。简而言之，从C57BL/6小鼠中无菌取出脾脏，并在聚丙烯网筛中进行分离。用氯化铵缓冲液裂解后，脾细胞用改良的HBSS洗涤两次，并在第0天以0.5 ml/只的体积腹腔注射（2×10⁸个细胞/ml）至杂交小鼠体内。杂交小鼠分别接受BCX-1777（30 mg/kg，口服）或环孢素A（50 mg/kg，腹腔注射）治疗10天；对照组小鼠在第0天接受HBSS或亲代脾脏注射，并分别腹腔注射或口服载体。取出脾脏并称重，结果以脾脏重量与体重的比值记录。\n

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\n\nHu-PBL SCID小鼠模型[2]
\n按照Sandhu等人描述的方法，将人外周血淋巴细胞（hu-PBL）移植到重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠体内。在注射人外周血淋巴细胞（hu-PBL）前1天，SCID小鼠预先注射单剂量抗ASGM1抗体。抗ASGM1抗体为兔多克隆抗体，可识别小鼠NK细胞并抑制NK细胞活性。在hu-PBL移植前，SCID小鼠接受照射。照射剂量为3 Gy，使用137Cs源。用于移植到SCID小鼠体内的人类淋巴细胞分离自志愿者供体的白细胞层或全血。hu-PBL通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离，并在无菌条件下腹腔注射（每只小鼠注射3.0–5.0×10⁷个PBL）到SCID小鼠体内。实验动物预先接受福洛地辛/BCX-1777（20 mg/kg/天，每日两次）溶于0.5%羧甲基纤维素（CMC）的溶液处理5天，以提高dGuo水平。对照组动物仅接受0.5% CMC处理。比较对照组和实验组动物的寿命。

口服生物利用度和体内药理活性[2]
图3A显示了BCX-1777口服和静脉给药后血浆浓度的变化。BCX-1777口服后吸收迅速，半小时内达到约3 μM的血药浓度峰值（Cmax）。3小时后，血浆药物浓度为1.1 μM，6小时后则检测不到。计算得出小鼠BCX-1777的口服生物利用度为63%。
在小鼠口服BCX-1777（10 mg/kg）后，监测了血浆dGuo水平的变化（图3B）。dGuo随时间增加，3小时时达到约5 μM的血药浓度峰值（Cmax）。6小时时，dGuo水平约为2.2 μM。24小时后，dGuo检测不到。血浆dGuo水平与药物浓度并非完全平行。 dGuo 达到血药浓度峰值 (Cmax) 的时间（3 小时）比药物达到血药浓度峰值 (Cmax) 的时间（约 30 分钟）存在延迟。在小鼠口服不同剂量 BCX-1777 3 小时后，监测血浆中 dGuo 和药物的浓度（图 4）。BCX-1777 可使 dGuo 水平呈剂量依赖性升高，直至 10 mg/kg 剂量。超过此剂量后，dGuo 水平不再升高。然而，血浆药物浓度随着 BCX-1777 剂量的增加而升高，直至 100 mg/kg。

[1]. The effects of forodesine in murine and human multiple myeloma cells. Adv Hematol. 2010;2010:131895.

[2]. Purine nucleoside phosphorylase inhibitor BCX-1777 (Immucillin-H)--a novel potent and orally active immunosuppressive agent. Int Immunopharmacol. 2001 Jun;1(6):1199-210.

Immucillin H 是一种吡咯并嘧啶类和二羟基吡咯烷类化合物。
福洛地辛是一种高效、口服有效的、经合理设计的嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP) 抑制剂，在临床前研究中已显示出对恶性细胞的活性，并在临床上对 T 细胞急性淋巴细胞白血病和皮肤 T 细胞淋巴瘤具有疗效。其他初步研究结果支持其用于治疗某些 B 细胞恶性肿瘤。
福洛地辛是一种嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP) 的过渡态类似物抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，福洛地辛优先结合并抑制 PNP，导致脱氧鸟苷三磷酸的积累，进而抑制核糖核苷二磷酸还原酶和 DNA 合成。该药物可选择性地诱导受刺激或恶性T淋巴细胞凋亡。

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药物适应症
已研究用于治疗淋巴瘤（非霍奇金淋巴瘤）和白血病（淋巴样白血病）。

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嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP) 缺乏症患者表现出选择性T细胞免疫缺陷。因此，PNP抑制剂作为潜在的T细胞选择性免疫抑制剂备受关注。BCX-1777是一种强效的PNP抑制剂，对包括人、小鼠、大鼠、猴和犬在内的多种物种均有效，其IC50值范围为0.48至1.57 nM。在 2'-脱氧鸟苷 (dGuo，3-10 μM) 存在的情况下，BCX-1777 可抑制由多种因子激活的人淋巴细胞增殖，例如白细胞介素-2 (IL-2)、混合淋巴细胞反应 (MLR) 和植物血凝素 (PHA)（IC50 值 < 0.1-0.38 μM）。BCX-1777 对人淋巴细胞增殖的抑制作用比其他已知的 PNP 抑制剂（如 PD141955 和 BCX-34）强 10-100 倍。人淋巴细胞的核苷酸分析表明，BCX-1777 对细胞增殖的抑制作用与细胞内 dGTP 水平相关。BCX-1777 在小鼠体内具有良好的口服生物利用度 (63%)。小鼠单次服用 10 mg/kg 剂量的 BCX-1777 后，dGuo 可升高至约 5 μM。 BCX-1777 在小鼠 T 细胞模型（例如迟发型超敏反应 (DTH) 和脾肿大）中无效，因为小鼠 T 细胞不像人类 T 细胞那样会积累 dGTP。然而，在人外周血淋巴细胞重症联合免疫缺陷 (hu-PBL-SCID) 小鼠模型中，BCX-1777 可有效延长小鼠寿命 2 倍或更多。这是首个已知的 PNP 抑制剂，其可使小鼠体内 dGuo 水平升高至与 PNP 缺陷患者相似的水平。此外，这些 dGuo 水平也是 BCX-1777 体外抑制 T 细胞所必需的。因此，BCX-1777 代表了一类新型的选择性免疫抑制剂，可能对多种 T 细胞疾病具有治疗价值。[2] 总之，BCX-1777 是一种有效的 PNP 酶抑制剂，可抑制人类 T 细胞增殖。 BCX-1777 在小鼠体内具有口服生物利用度，能够最大程度地抑制 PNP，从而提高 dGuo 水平。这种 dGuo 水平的升高在 PNP 缺陷患者中发现，并已被证实是 T 细胞抑制所必需的。利用 hu-PBL SCID 小鼠模型，证实了 BCX-1777 的体内疗效。鉴于体外和体内数据，我们得出结论：BCX-1777 是一种新型的、口服有效的、T 细胞选择性免疫抑制剂，可用于治疗 T 细胞增殖性疾病。[2]

C11H14N4O4

266.25326

266.102

C, 49.62; H, 5.30; N, 21.04; O, 24.04

209799-67-7

Forodesine hydrochloride;284490-13-7

135409409

Light brown to gray solid

2.01

613.5ºC at 760mmHg

324.8ºC

6.61E-16mmHg at 25°C

1.894

-2.3

134.26

6

6

2

19

404

4

O=C1C(NC=C2[C@@H]3N[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]3O)=C2NC=N1

IWKXDMQDITUYRK-KUBHLMPHSA-N

InChI=1S/C11H14N4O4/c16-2-5-9(17)10(18)7(15-5)4-1-12-8-6(4)13-3-14-11(8)19/h1,3,5,7,9-10,12,15-18H,2H2,(H,13,14,19)/t5-,7+,9-,10+/m1/s1

7-[(2S,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)pyrrolidin-2-yl]-3,5-dihydropyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-one

Forodesine; Immucillin H; 209799-67-7; Fodosine; Immucillin-H; mundesine; BCX-1777; 1,4-dideoxy-4-aza-1-(s)-(9-deazahypoxanthin-9-yl)-d-ribitol; Immucillin H; NTR 001; NTR-001; NTR001

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~375.59 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。