FR 901464

Spliceosome
SF3b, a protein component of the spliceosome. [2]

FR901464 是一种强效的剪接体抑制剂，对多种人类癌细胞系均表现出显著的抗癌活性。[2] 研究人员选择 FR901464 作为候选化合物，并研究了 FR901464 处理的肿瘤细胞中细胞周期转换、染色质状态和内源基因表达的变化，这些肿瘤细胞的转录活性均有所提高。FR901464 诱导细胞周期中特征性的 G1 期和 G2/M 期阻滞，并导致基因组 DNA 的核间降解，其动力学与 M-8 肿瘤细胞中 SV40 启动子依赖性细胞转录的激活动力学相同。与病毒启动子的强效激活相反，FR901464 抑制了 M-8 细胞中一些可诱导的内源基因的转录，但并未抑制管家基因的转录。这些结果表明，FR901464 可能诱导染色质结构的动态变化，从而产生强大的抗肿瘤活性，因此可能代表一种新型的癌症化疗药物。[1]

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FR901464 在体外对多种人类癌细胞系表现出强效的细胞毒性，IC50 值范围为 0.6 至 3.4 nM。[2]
在以合成前体 mRNA 底物、ATP 和 HeLa 细胞核提取物为底物的体外剪接系统中，FR901464 抑制剪接，IC50 值为 0.05 μM。该值是通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 定量前体 mRNA 转化为 mRNA 的百分比来确定的。[2]
在相同的体外剪接系统中，FR901464 被证实会影响剪接体的组装。非变性凝胶分析表明，随着FR901464浓度的增加，剪接体组装停滞在先前观察到的A样复合物上，从而破坏了从H/E→A→B→C复合物的正常进程。[2]

从假单胞菌属2663号菌株的发酵液中分离得到三种新型抗肿瘤化合物FR901463、FR901464和FR901465。在三种小鼠肿瘤模型和一种人肿瘤模型中检测了它们的抗肿瘤活性。这三种FR化合物均能延长荷鼠腹水瘤P388白血病小鼠的生存期（FR901463、FR901464和FR901465的T/C值分别为160%、145%和127%），并且在不同的有效剂量范围内抑制人实体瘤A549肺腺癌的生长。在三种FR化合物中，FR901464对这些肿瘤模型的抑制效果最为显著。FR901464还能抑制小鼠实体瘤Colon 38癌和Meth A纤维肉瘤的生长。 [1]

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FR901464对移植到小鼠体内的人类实体瘤表现出显著的抗肿瘤作用，剂量范围为0.056-1 mg/kg。[2]

体外剪接反应[2]
前体mRNA底物来源于腺病毒主要晚期转录本。通过T7酶的延伸转录，并经凝胶纯化，生成32P-UTP标记的G(5′)ppp(5′)G加帽底物。从在DMEM/F12 (1:1)培养基和5% (v/v)新生牛血清中培养的HeLa细胞中制备核提取物。剪接反应中，将10 nM前体mRNA底物与60 mM谷氨酸钾、2 mM乙酸镁、2 mM ATP、5 mM磷酸肌酸、0.05 mg mL⁻¹ tRNA和50% (v/v) HeLa细胞核提取物在30 °C下孵育。

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变性凝胶分析[2]
从体外剪接反应中提取RNA，并在15% (v/v)变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。用磷成像技术对³²P标记的RNA进行可视化，并使用ImageQuant软件进行定量。剪接效率是指mRNA相对于总RNA的量，并以DMSO对照反应进行标准化。抑制剂的IC₅₀值是指导致剪接效率降低50%的抑制剂浓度，该值由剪接效率与化合物浓度关系的平均曲线得出。

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体外剪接抑制实验：在体外剪接系统中评估了FR901464的生物学特性。将化合物添加到含有合成前体mRNA底物、ATP和从HeLa细胞中分离的核提取物的剪接反应体系中。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离底物、中间体（套索中间体、5'外显子中间体）和产物mRNA，从而检测剪接化学反应。剪接效率以转化为mRNA的前体mRNA的百分比来量化。与DMSO对照组相比，将剪接效率降低一半所需的浓度定义为IC50。[2]
剪接体组装实验：还检测了FR901464对剪接体组装的影响。将相同的体外剪接反应等分试样在天然条件下分离，并通过凝胶电泳进行分析。这使得可以观察到一系列有序的剪接体中间体复合物（H/E、A、B和C）。观察了该化合物对正常组装过程的影响。[2]

非变性凝胶分析[2]
剪接反应按上述方法进行，并在 30 °C 下孵育 4–30 分钟。各时间点的样品均置于冰上，直至所有样品准备就绪进行分析。取 10 μL 剪接反应液与 10 μL 非变性凝胶上样缓冲液（20 mM Tris 碱、20 mM 甘氨酸、25% (v/v) 甘油、0.1% (w/v) 青蓝、0.1% (w/v) 溴酚蓝、1 mg mL–1 硫酸肝素）混合，室温孵育 5 分钟后，上样至 2.1% (w/v) 低熔点琼脂糖凝胶。凝胶在 72 V 电压下运行 3.5 小时，干燥后置于 Whatman 滤纸上，并曝光于磷光成像屏，最后使用 Typhoon 扫描仪进行数字化。

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流式细胞术细胞周期分析：将 M-8 细胞用 FR901464 (10 ng/ml) 或其他药物处理不同时间。为检测 DNA 合成，将细胞用 BrdU 脉冲标记 30 分钟。分离的细胞核与荧光素标记的抗 BrdU 抗体孵育，并用碘化丙啶染色。然后使用 FACScan 流式细胞仪分析细胞周期分布。[1]
细胞死亡分析（凋亡）：将 M-8 细胞在有或无 FR901464 (10 ng/ml) 的条件下孵育不同时间。随后裂解细胞，并使用光度酶免疫测定法（细胞死亡检测ELISA）定量细胞质中单核小体和寡核小体的富集情况。结果以405 nm处的吸光度值表示。[1]
RT-PCR基因表达分析：将M-8细胞用或不用FR901464（10 ng/ml）处理16小时。纯化总RNA，并使用针对CAT、c-myc、E2F-1、p53、p21 cip-1、β-actin和G3PDH的特异性引物进行RT-PCR扩增。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并用溴化乙锭染色进行分析。[1]
CAT蛋白定量：将M-8细胞与FR901464（10 ng/ml）孵育不同时间。细胞经冻融循环裂解后，采用比色酶免疫测定法（CAT ELISA）测定裂解液中CAT蛋白的水平。[1]

从假单胞菌属2663号菌株的发酵液中分离得到三种新型抗肿瘤化合物FR901463、FR901464和FR901465。在三种小鼠肿瘤模型和一种人肿瘤模型中检测了它们的抗肿瘤活性。这三种FR化合物均能延长荷鼠腹水瘤P388白血病小鼠的生存期（FR901463、FR901464和FR901465的T/C值分别为160%、145%和127%），并且在不同的有效剂量范围内抑制人实体瘤A549肺腺癌的生长。在三种FR化合物中，FR901464对这些肿瘤模型的抑制效果最为显著。FR901464还能抑制小鼠实体瘤Colon 38癌和Meth A纤维肉瘤的生长。为了探究三种FR化合物的转录激活能力在抗肿瘤作用中的作用，我们选择FR901464作为候选化合物，并研究了FR901464处理后具有高转录活性的肿瘤细胞的细胞周期转换、染色质状态和内源基因表达。FR901464诱导了M-8肿瘤细胞中特征性的G1期和G2/M期阻滞以及基因组DNA的核间降解，其动力学与SV40启动子依赖性细胞转录的激活相同。与病毒启动子的强效激活相反，FR901464抑制了M-8细胞中一些可诱导的内源基因的转录，但对管家基因没有影响。这些结果表明，FR901464 可能诱导染色质结构的动态变化，从而产生强大的抗肿瘤活性，因此可能代表一种新型的癌症化疗药物。[1]

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药物制剂：**体内研究中，FR901464溶解并稀释于10%聚氧乙烯化（60 mol）氢化蓖麻油的生理盐水（HCO60溶液）中。所有药物均以10 ml/kg体重的剂量给予小鼠。[1]
* **小鼠腹水型P388白血病模型：**在第0天，将P388细胞（1 × 10⁶）腹腔注射（ip）至BDF₁小鼠体内。FR901464每日腹腔注射一次，连续4天（第1-4天）。抗肿瘤疗效通过治疗组 (T) 的中位生存时间与对照组 (C) 的中位生存时间之比来评估，计算公式为 T/C (%)。[1]
* **小鼠实体瘤模型（Colon 38 和 Meth A）：** 对于 Colon 38 模型，于第 0 天将肿瘤碎片（2×2×2 mm）皮下植入 BDF₁ 小鼠体内。FR901464 于第 1、4、7 和 10 天每天静脉注射一次。对于 Meth A 模型，于第 0 天将细胞（1 × 10⁵）皮内接种到 BALB/c 小鼠体内。FR901464 于第 8、11 和 14 天每天静脉注射一次。使用游标卡尺测量肿瘤大小并计算肿瘤重量。疗效以生长抑制率 (1 - T/C) % 表示。[1]
* **人 A549 肺腺癌异种移植模型（肾包膜下试验）：** 于第 0 天将 1 mm³ 的肿瘤组织块植入 BDF₁ 小鼠的肾包膜下。于第 1、2、5、7、9 和 12 天皮下注射免疫抑制剂 FK-506 (32 mg/kg) 以防止异种移植排斥反应。于第 1、5 和 9 天腹腔注射 FR901464（每 4 天一次）。于第 14 天处死小鼠，并测量最终肿瘤大小。疗效以生长抑制率 (1 - T/C) % 计算。 [1]

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药物制剂：体内研究中，FR901464溶解并稀释于10%聚氧乙烯化（60 mol）氢化蓖麻油生理盐水溶液（HCO60溶液）中。所有药物均以10 ml/kg体重的剂量给予小鼠。[1]
小鼠腹水P388白血病模型：于第0天将P388细胞（1 × 10⁶）腹腔注射（ip）至BDF₁小鼠体内。FR901464每日腹腔注射一次，连续4天（第1-4天）。抗肿瘤疗效通过治疗组（T）中位生存时间与对照组（C）中位生存时间的百分比来评估，计算公式为T/C（%）。 [1]
小鼠实体瘤模型（Colon 38 和 Meth A）：对于 Colon 38 模型，于第 0 天将肿瘤碎片（2×2×2 mm）皮下植入 BDF₁ 小鼠体内。FR901464 于第 1、4、7 和 10 天每日静脉注射一次。对于 Meth A 模型，于第 0 天将细胞（1 × 10⁵）皮内接种到 BALB/c 小鼠体内。FR901464 于第 8、11 和 14 天每日静脉注射一次。使用游标卡尺测量肿瘤大小并计算肿瘤重量。疗效以生长抑制率 (1 - T/C) % 表示。 [1]
人A549肺腺癌异种移植模型（肾包膜下移植）：于第0天将1 mm³肿瘤组织块植入BDF₁小鼠肾包膜下。为防止异种移植排斥反应，于第1、2、5、7、9和12天皮下注射免疫抑制剂FK-506（32 mg/kg）。于第1、5和9天腹腔注射FR901464（每4天一次）。于第14天处死小鼠，测量最终肿瘤大小。疗效以生长抑制率(1 - T/C)%计算。[1]

在小鼠P388白血病模型中，3.2 mg/kg剂量的FR901464具有毒性，T/C值<86%（具体而言，T/C值为22%）。[1]
在人A549异种移植SRC试验中，5.6 mg/kg剂量的FR901464具有毒性，导致评估当日的存活率低于65%。[1]
在小鼠Colon 38实体瘤模型中，1.0 mg/kg剂量的FR901464具有毒性，导致评估当日的存活率低于65%。[1]

[1]. New antitumor substances, FR901463, FR901464 and FR901465. II. Activities against experimental tumors in mice and mechanism of action. J Antibiot (Tokyo). 1996 Dec;49(12):1204-11.

[2]. Enantioselective total syntheses of FR901464 and spliceostatin A and evaluation of splicing activity of key derivatives. J Org Chem. 2014 Jun 20;79(12):5697-709.

FR901464 是一种具有强效抗癌活性的螺环氧化物，能够降低癌基因和抑癌基因的 mRNA 水平。它分离自假单胞菌 2663 株。FR901464 可用作抗菌剂、抗肿瘤剂和细菌代谢产物。它是一种乙酸酯、环状半缩酮、吡喃化合物、单羧酸酰胺和螺环氧化物。
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4,7-二羟基-7-甲基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯已在泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)中被报道，并且已有相关数据。

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FR901464 (1) 和剪接抑制素A (2) 是剪接体的强效抑制剂。这些化合物已显示出对多种人类癌细胞系的显著抗癌活性。本文描述了剪接阻遏物A（FR901464）及其六种相应非对映异构体的高效对映选择性合成，并评估了它们的剪接活性。剪接阻遏物A和FR901464的合成均遵循最长的线性序列，分别涉及9步和10步反应。为了构建高官能化的四氢吡喃A环，我们采用了CBS还原、Achmatowicz重排、Michael加成和还原胺化作为关键步骤。Michael加成反应表现出显著的非对映选择性，我们针对不同的底物和反应条件验证了这一点。侧链B由光学活性醇制备，随后进行乙酰化和Lindlar催化氢化。另一个高官能化的四氢吡喃C环由易得的(R)-异丙基甘油醛衍生而来，其合成路线包括1,2-加成、环状缩酮化和区域选择性环氧化。这些片段随后通过酰胺化和交叉复分解反应在汇聚合成中偶联在一起。然后合成了六种关键的非对映异构体，以研究FR901464和剪接抑制因子A的特定立体化学特征对其体外剪接活性的重要性。[2]

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FR901464是一种强效抗癌化合物，最初由藤泽制药株式会社于1996年从假单胞菌2663号菌株的发酵液中分离得到。[2]
FR901464在M-8细胞中浓度为10 nM时可增强SV40 DNA肿瘤病毒启动子的活性。 [2]
FR901464 的主要作用机制是通过与剪接体蛋白组分 SF3b 结合，抑制体外剪接并促进前体 mRNA 的积累。这代表了一种产生抗肿瘤反应的新机制。[2]
FR901464 与结构不同的 pladienolide B 一起，是目前已知的少数能够调节剪接以产生抗肿瘤作用的分子骨架之一。[2]
Spliceostatin A 是 FR901464 在 C1 位上的甲基缩酮衍生物，具有更好的化学稳定性和相似的抗肿瘤活性。在本研究中，合成的 FR901464 是通过在 0°C 下，使用 PPTS 在湿 THF 中水解合成的 spliceostatin A 的缩酮部分而获得的。 [2]
本文描述了一种高效的、对映选择性的FR901464全合成方法，共20步，最长线性序列为10步。合成的FR901464经过全面表征，其光谱数据与天然产物的报道数据完全一致。[2]
此外，还合成并测试了FR901464和剪接抑制素A的六种非对映异构体。所有非对映异构体在体外抑制剪接方面的活性均显著降低（比剪接抑制素A低100倍以上），IC50值范围为1至35 μM。这凸显了正确的立体化学对生物活性至关重要。[2]

C27H41NO8

507.624

507.283

C, 63.89; H, 8.14; N, 2.76; O, 25.21

146478-72-0

10553647

White to off-white solid powder

1.21g/cm3

702.7ºC at 760mmHg

378.8ºC

7.94E-23mmHg at 25°C

1.553

3.152

130.34

3

8

9

36

900

9

O1C([H])([H])C21C([H])([H])[C@@](C([H])([H])[H])(O[H])O[C@]([H])(/C(/[H])=C(\[H])/C(/C([H])([H])[H])=C(\[H])/C([H])([H])[C@@]1([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([C@@]([H])(C([H])([H])[H])O1)N([H])C(/C(/[H])=C(\[H])/[C@]([H])(C([H])([H])[H])OC(C([H])([H])[H])=O)=O)[C@@]2([H])O[H]

PJKVJJDQXZARCA-QHYZBLTGSA-N

InChI=1S/C27H41NO8/c1-16(8-11-23-25(31)27(15-33-27)14-26(6,32)36-23)7-10-22-17(2)13-21(19(4)35-22)28-24(30)12-9-18(3)34-20(5)29/h7-9,11-12,17-19,21-23,25,31-32H,10,13-15H2,1-6H3,(H,28,30)/b11-8+,12-9-,16-7+/t17-,18-,19+,21+,22-,23+,25+,26-,27+/m0/s1

[(Z,2S)-5-[[(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4,7-dihydroxy-7-methyl-1,6-dioxaspiro[2.5]octan-5-yl]-3-methylpenta-2,4-dienyl]-2,5-dimethyloxan-3-yl]amino]-5-oxopent-3-en-2-yl] acetate

FR 901464; FR901464; FR901464; 146478-72-0; (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4,7-dihydroxy-7-methyl-1,6-dioxaspiro[2.5]oct-5-yl]-3-methylpenta-2,4-dien-1-yl}-2,5-dimethyltetrahydro-2H-pyran-3-yl]amino}-5-oxopent-3-en-2-yl acetate; CHEBI:65915; [(Z,2S)-5-[[(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4,7-Dihydroxy-7-methyl-1,6-dioxaspiro[2.5]octan-5-yl]-3-methylpenta-2,4-dienyl]-2,5-dimethyloxan-3-yl]amino]-5-oxopent-3-en-2-yl] acetate; FR-901464; [(E,2S)-4-[[(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4,7-dihydroxy-7-methyl-1,6-dioxaspiro[2.5]octan-5-yl]-3-methylpenta-2,4-dienyl]-2,5-dimethyloxan-3-yl]carbamoyl]but-3-en-2-yl] acetate; CHEMBL494107; FR-901464

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~197.00 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.92 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。