gamma-DGG

AMPA receptor

在制备大鼠海马片的过程中，用颗粒细胞记录了内侧穿通通路刺激引起的兴奋性突触后电位和兴奋性氨基酸诱导的去极化。比较了兴奋性氨基酸拮抗剂(+/-)-2-氨基-5-磷酸戊酸酯（APV）、γ - d -谷氨酰甘氨酸（Gamma-DGG）和顺式-2,3-哌啶二羧酸酯（PDA）对这些现象的影响。Gamma-DGG是最有效的e.p.s.p拮抗剂，其作用是可逆的，与颗粒细胞的被动膜特性或e.p.s.p的明显逆转电位的任何变化无关。量子分析表明，e.p.s.p的减少与量子大小的减少而不是量子含量的减少平行，证实了Gamma-DGG的作用是突触后部位。Gamma-DGG对外源激动剂的效价为n -甲基- d -天冬氨酸大于海因酸盐大于或等于准质量。APV对e.p.s.p.的影响很小，但它是n -甲基- d -天冬氨酸诱导的去极化的选择性拮抗剂。PDA使颗粒细胞去极化，增加其膜输入电阻。虽然Gamma-DGG是谷氨酸和天冬氨酸诱导的去极化的有效拮抗剂，但没有发现明确的特异性模式。谷氨酸的作用不受APV的影响。这些结果表明，在与颗粒细胞穿孔通路的纤维形成的突触上的递质受体是准质和/或盐酸盐型的。目前的数据与生化证据一致，谷氨酸可能是他突触的内源性递质。［1］

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我们确定突触后对量子大小变化的贡献的第二种方法是使用γ-d-谷氨酰甘氨酸（ γ- dgg ），这是一种竞争性的AMPA受体阻断剂，在谷氨酸浓度较高时阻断较少（Liu et al., 1999）。在200-400 μm， γ-DGG使mEPSC振幅降低了26±2% （n = 5个突触），mEPSC振幅分布和累积概率曲线都向左移动（图6A，B）。与谷氨酸透析类似，计算对照组mEPSC振幅（ACtrl）与γ-DGG应用期间的振幅之比（RDGG/Ctrl）。RDGG/Ctrl随着ACtrl的增加而增加（图6C）（5个突触的汇总见图6F）。因此，γ-DGG减少较大的mepsc的比例较小。
图6所示的结果强烈反对突触后受体簇的大小或密度是量子大小变化的唯一来源的假设，因为该假设预测RDGG/Ctrl不会随着ACtrl的增加而变化。谷氨酸透析（图4）和 γ - dgg 应用（图6）的实验表明，较大的mEPSCs，或至少很大一部分较大的mEPSCs，是由突触间隙中较高的谷氨酸浓度引起的（额外的对照，参见补充材料7，可在www.jneurosci.org上获得）。应该指出的是，无论是谷氨酸透析（图4）还是γ-DGG应用（图6）都不能排除突触后受体簇大小（或密度）部分导致量子大小变化的可能性。[2]

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γ-DGG (γ-DGG) 是一种 AMPA 受体竞争性阻断剂，可在较高浓度下阻断较少的谷氨酸。由于浴液中存在 γ-DGG，Micro-EPSC (mEPSC) 振幅在 200–400 μM 时降低了 26±2% (n=5)。此外，mEPSC 幅度分布和累积概率曲线向左移动 [1]。兴奋性突触后电位 (EPSPS) 最强的拮抗剂是 γ-DGG。其作用是可逆的，并且与颗粒细胞的被动膜特性或 EPSP 的表观逆转潜力的改变无关。当定量分析显示 EPSP 的下降是随着量子大小而不是量子含量的下降而下降时，γ-DGG 的突触后作用位点得到了证实 [2]。

为了进一步评估头孢曲松治疗大鼠的LTD缺乏是否依赖于GLT-1的上调，我们用选择性拮抗剂双氢盐（DHK）阻断GLT-1；Arriza et al. 1994)。DHK （15 μm）本身对对照组（n= 6）和头孢曲松处理大鼠（n= 6）的fEPSP振幅产生温和但一致的降低，分别为18±2%和14±1% (P= 0.26；图5 c, D)。洗掉药物后，fEPSPs的振幅迅速恢复到控制水平。有趣的是，在头孢曲松治疗的大鼠中，在DHK存在的情况下给予LFS能够恢复LTD。LFS后40分钟，相对fEPSP值为0.70±0.03 (n= 6；P = 0.002;图5 e)。fEPSP相对于DHK的振幅为0.79±0.03 （P= 0.01）。在对照组中，在DHK存在的情况下，LFS给MF获得的相对fEPSP振幅为0.84±0.05 (P= 0.05；n = 6;图5 e)。虽然该值在CEF方面较低，但与不加药时的值没有显著差异（P= 0.1）。此外，在对照组（未示出）和头孢曲松处理大鼠中，广谱mGluR拮抗剂MCPG （500 μm）可阻止DHK对LTD的影响(相对fEPSP量级：0.96±0.004,n= 5；P = 0.68;图5F)，表明mGluR的激活对于MF-CA3突触的LTD诱导至关重要。为了探测突触谷氨酸瞬时浓度的变化，两组在有限诱导前后分别暴露于 /γ-DGG ，一种低亲和力谷氨酸受体拮抗剂（Liu et al. 1999）。由于γ-DGG的亲和力较低，在突触谷氨酸过渡过程中，一定比例的突触受体将取代结合的γ-DGG代替谷氨酸，从而可以评估基础突触传递和LTD期间突触间隙中谷氨酸过渡浓度的变化。与对照组相比，γ-DGG （1 mm）对盐水处理大鼠（n= 5）和头孢曲松处理大鼠（n= 5）的fEPSP抑制幅度分别为0.38±0.03和0.41±0.03。这些值无显著差异（P= 0.36）。然而，在LFS后15分钟，γ- dgg诱导的抑制程度相对于对照组，未治疗组为0.59±0.04，头孢曲松治疗组为0.45±0.03%（图6）。对照组在LTD前后对fEPSPs的平均抑制值差异有统计学意义（P= 0.045），而头孢曲松组无统计学意义(P= 0.74；见图5插页。这些结果表明，在对照组（而不是头孢曲松治疗的大鼠）中，LTD与谷氨酸浓度降低有关，进一步支持其突触前表达位点。[3]

药物通过一个独立安装的六管微移液管（尖端直径6-9米）以离子电泳的方式喷射，该微移液管位于齿状回分子层刺穿神经元的树突树上，与刺激电极的水平相同。在细胞被刺穿后，离子电泳电极的尖端以5-10 lam的步骤缓慢推进到切片中，直到在短暂（500-700 msec）的谷氨酸应用中可以观察到至少5 mV的快速上升去极化。离子电泳桶中含有以下药物的不同组合：l -谷氨酸(1 M；pH 8)， l -天冬氨酸(1 M；pH 8)， n -甲基- d -天冬氨酸(20 mm, 150 mm - naci；pH 8)，半球形(20 mm, 150 mm - nacl；pH 8)，盐酸盐(20 mM, 150 mM- nacl；pH 8), APV (50 mm, 100 mm - nacl；pH 8) γ - dgg (200mm；pH 8), PDA (200 mM；pH 8)和NaCl (1 M；pH值8)。必要时对单个桶施加1-5 nA的保持电流。在每次穿刺结束时，重新测试药物的离子电泳应用效果，以评估离子电泳移液管与记录电极之间的任何电耦合。结果存储在Racal FM 4D磁带录音机上，随后用PDP 11/23计算机进行分析。

动物和海马切片制备[3]
雄性Wistar大鼠（8-9周龄）以及野生型（WT）和GLT-1 KO小鼠（P15）每日腹腔注射生理盐水或头孢曲松（Rocefin，Roche；200 mg kg−1 day−1，溶于生理盐水），连续8天。末次注射24小时后，用于电生理研究的动物用氨基甲酸乙酯（2 g kg−1）腹腔注射麻醉后处死。
生理盐水或头孢曲松处理组大鼠的海马切片制备方法如前所述（Rosato-Siri等，2006）。简而言之，将脑组织迅速从颅骨中取出，并在冰冷的人工脑脊液（ACSF）中切割每个半球，获得厚度为400 μm的海马横切片。该人工脑脊液的成分为（单位：mM）：NaCl 126、KCl 3.5、NaH₂PO₄ 1.2、NaHCO₃ 25、MgCl₂ 1.3、CaCl₂ 2.5、葡萄糖 25，并用95% O₂-5% CO₂混合气体饱和（pH 7.3-7.4）。切片恢复至少1小时后，将其置于记录室中，并持续灌注氧合ACSF（流速2-3 ml min⁻¹，温度33-34°C）。切片首先用于电生理研究，然后用于免疫细胞化学研究。用于电镜研究的动物（4只大鼠：2只对照组，2只CEF处理组；以及8只小鼠：2只未经处理的野生型小鼠，2只头孢曲松处理的野生型小鼠，2只GLT-1基因敲除小鼠（Tanaka等人，1997），以及2只CEF处理的GLT-1基因敲除小鼠）在最后一次注射后24小时用水合氯醛（300 mg kg⁻¹）麻醉，并通过升主动脉灌注生理盐水（约1分钟），随后灌注4%多聚甲醛（PFA）。取出脑组织，后固定7天后进行切片；这些切片用于免疫金标记研究。

[1]. Blockade of amino acid-induced depolarizations and inhibition of excitatory post-synaptic potentials in rat dentate gyrus. J Physiol. 1983 Aug;341:627-40.

[2]. The origin of quantal size variation: vesicular glutamate concentration plays a significant role. J Neurosci. 2007 Mar 14;27(11):3046-56.

[3]. Up-regulation of GLT-1 severely impairs LTD at mossy fibre--CA3 synapses. J Physiol. 2009 Oct 1;587(Pt 19):4575-88.

D-γ-Glu-Gly 是一种由 D-γ-谷氨酰和甘氨酸残基组成的二肽。

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本研究的主要结论是，奎斯奎酸/红藻氨酸受体介导穿通纤维与颗粒细胞形成的突触的兴奋。这一结论基于以下几点：(1) 与 APV 相比，γ-DGG/γ-DGG 在拮抗内侧穿通纤维刺激诱发的兴奋性突触后电位 (EPSP) 方面具有更高的效力；(2) γ-DGG 的真正作用位点位于突触后；(3) γ-DGG 和 APV 对 N-甲基-D-天冬氨酸、奎斯奎酸和红藻氨酸诱导的颗粒细胞去极化具有选择性。研究发现，突触拮抗剂yDGG比APV更能有效地拮抗内侧穿通通路刺激颗粒细胞诱发的兴奋性突触后电位（epsp）。APV无效不太可能是由于给药剂量不足所致，因为APV和yDGG均通过离子导入电极相邻的电极管，在被刺穿神经元的树突上同一位置给药，且APV的给药剂量小于对epsp无影响的剂量，即可阻断N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）反应。因此，NMDA受体似乎并不参与穿通通路纤维与颗粒细胞形成的突触的兴奋。相反，奎斯奎酸受体和/或红藻氨酸受体很可能参与其中，因为yDGG的突触拮抗作用仅在给药剂量足以阻断奎斯奎酸和/或红藻氨酸反应时才会发生。目前区分这两种受体类型似乎很困难。尽管其他研究者（Davies & Watkins，1981；参见Watkins & Evans，1981）发现γ-二酰谷氨酸（yDGG）优先拮抗红藻氨酸而非奎斯奎酸的反应，但我们无法区分这两种受体（这与Salt & Hill，1982以及Collingridge等人，1983的研究结果一致）。因此，奎斯奎酸受体与红藻氨酸受体的分离尚需等待更具特异性的拮抗剂的开发。在最近一篇聚焦于外侧穿通通路的论文中，Koerner & Cotman（1981）报道，1-2-氨基-4-膦酸丁酸酯是齿状回中分子层细胞外记录的突触场电位最有效的拮抗剂，并提出存在“一种此前未被描述的新型L-谷氨酸受体”。然而，由于方法上的差异以及这些作者仅关注了ω-磷酸系列兴奋性氨基酸拮抗剂的作用，任何将他们的结果与当前数据进行比较的尝试都受到阻碍。此外，1,2-氨基-4-膦酸丁酸酯作为兴奋性氨基酸拮抗剂的效力和选择性在脊髓水平（Evans等人，1982）以及最近的在海马CA1锥体细胞（Collingridge等人，1983）中都受到了强烈质疑，它不仅增强了N-甲基-D-天冬氨酸和奎斯奎酸的作用，而且自身也表现出一定的兴奋作用。基于同样的道理，PDA因其兴奋性作用，在本研究中被排除在有效的拮抗剂之外。[1]

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γ-DGG/γ-DGG的作用机制 目前关于化学突触处兴奋性突触后电位（epsp）产生的观点认为，epsp的振幅是由大量振幅相近的离子电流叠加决定的，这些离子电流是由神经递质特异性通道的开放产生的（Eccles，1964；Ginsborg，1967）。该理论的一个预测是，突触电位的振幅与相关的电导变化之间存在连续的线性关系，拮抗剂的作用仅仅是与特异性受体结合，从而减少通道的数量。本研究中报道的γ-DGG的突触拮抗作用与这些预测基本吻合。因此，yDGG通过限制与兴奋性突触后电位（epsp）相关的膜输入电阻变化，减少了内源性递质开放的通道数量，从而降低了epsp的振幅，而没有改变其表观反转水平。本研究使用“表观反转水平”一词，是因为该值是通过外推法确定的。然而，无论是在超极化方向（0至-30 mV）（参见Brown、Fricke和Perkel，1981）还是在去极化方向（0至+15 mV），颗粒细胞的电压-电流关系均未观察到明显的线性偏差。这种线性关系与Barnes和McNaughton（1980）的研究结果一致，他们也报道了epsp的外推反转电位为-18 mV。根据神经递质释放的量子化假说，微型兴奋性突触后电位（mEPSP）的大小取决于突触后膜对内源性神经递质的敏感性（Katz，1966；Martin，1977；Takeuchi，1977；Kuno，1971）。因此，在γ-二酰甘油（yDGG）存在下进行的量子化分析结果（即q值降低而m值不变）提供了进一步的独立证据，表明yDGG直接作用于颗粒细胞膜，降低其对内源性神经递质的敏感性。本研究中报告的m值和q值与McNaughton等人近期发表的数据相似，支持了该分析的有效性。 （1981 年，见图 5，第 960 页），他们使用方差法和失效法计算了刺激内侧穿通通路诱发的 EPSP 的量子参数，并采用了不同的方法来校正 EPSP 的非线性求和。[1]

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内侧穿通通路的神经递质谷氨酸和天冬氨酸长期以来被认为是穿通通路纤维与颗粒细胞形成的突触中最可能的神经递质候选者（Nadler 等人，1977 年；Storm-Mathisen 和 Iversen，1979 年；Wheal 和 Miller，1980 年），并且有强有力的生化证据支持谷氨酸（White 等人，1977 年）。最近有研究提出，在脊髓及更高级的神经中枢中，谷氨酸和天冬氨酸作为混合激动剂发挥作用，因为它们能够与所有三种类型的兴奋性氨基酸受体相互作用（参见Watkins，1980）。此外，研究表明，拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受体的化合物往往也会拮抗天冬氨酸诱导的兴奋作用，而对谷氨酸的影响相对较小（Hicks、Hall和McLennan，1978；Watkins和Evans，1981）。基于此，人们推测天冬氨酸优先与N-甲基-D-天冬氨酸受体相互作用，而谷氨酸优先与奎斯奎酸受体相互作用。在我们的系统中，即使谷氨酸受体未被阻断，兴奋性突触后电位（epsp）也会降低（见图3）。γ-DGG/γ-DGG对谷氨酸和天冬氨酸的反应均有相同的抑制作用（与Salt & Hill, 1982的研究结果一致），因此，根据这些数据无法确定谷氨酸或天冬氨酸哪一种才是穿通通路的主要内源性神经递质。然而，总体而言，在阻断奎斯奎酸和/或红藻氨酸受体的情况下，γ-DGG总是能降低内侧穿通通路刺激诱发的兴奋性突触后电位。在同时测试γ-DGG对兴奋性突触后电位、天冬氨酸和谷氨酸反应的影响的细胞中，兴奋性突触后电位的振幅降低程度与谷氨酸反应的降低程度相同。因此，尽管在颗粒细胞中，yDGG 对天冬氨酸诱导反应的选择性抑制作用似乎不如在脊髓中那么强，但我们倾向于认为穿通通路的内源性神经递质和谷氨酸都与同一受体相互作用，并且二者的作用均被 yDGG 阻断。然而，也不能排除其他氨基酸或相关酸性化合物作为突触受体的天然配体的可能性。[1] 单个囊泡的融合会诱导量子化反应，这对于决定突触强度至关重要。大多数突触的量子化大小存在差异。其潜在机制尚不完全清楚。在此，我们研究了五个变异来源：囊泡谷氨酸浓度 ([Glu]v)、囊泡体积、超快融合孔关闭、突触后受体以及谷氨酸能 Held 杯状突触中释放点与突触后受体簇之间的位置。通过对来自 459 个突触的 266 万次融合事件进行平均，我们解析了单个囊泡融合引起的电容跃变。这种电容跃变是囊泡体积的指标，与在同一突触同时记录的微型兴奋性突触后电流 (mEPSC) 的幅度无关。因此，囊泡体积并非 mEPSC 变异的主要来源。电容跃变之后并未发生亚毫秒级的内吞作用，排除了超快内吞作用作为变异来源的可能性。突触前谷氨酸透析可轻微增加较大的 mEPSC，而竞争性 AMPA 受体阻滞剂 γ-DGG (γ-D-谷氨酰甘氨酸) 也可轻微降低较大的 mEPSC，这表明突触间隙中较高的谷氨酸浓度有助于 mEPSC 的增大。较大的mEPSC并未伴随更短的上升时间，这与预测不符，因此反驳了“较大的mEPSC是由释放位点与突触后受体簇之间距离更短引起的”这一假设。总之，mEPSC振幅的差异主要归因于释放的囊泡体积相似但谷氨酸含量不同，这表明[Glu]v是量子大小变化的主要来源。[2]此外，γ-DGG/γ-DGG（一种竞争性AMPA受体阻滞剂，在高谷氨酸浓度下阻滞作用较弱）对较大的mEPSC的抑制作用较小（图6）。这些结果表明，较大的mEPSC，或者至少很大一部分较大的mEPSC，并非归因于突触后受体簇的体积更大或密度更高，而是由于突触后受体所处的谷氨酸浓度更高所致。第四，突触后受体所感受到的较高谷氨酸浓度主要并非由释放位点与突触后受体簇之间的距离缩短所致，而是由释放的递质量增加所致（图7）。总之，mEPSC振幅的差异主要归因于释放的囊泡体积相似但谷氨酸含量不同，这表明[Glu]v的变化是量子大小变化的主要来源。[2]

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谷氨酸转运蛋白负责清除突触释放的谷氨酸。通过这一作用，它们维持较低的细胞外谷氨酸水平，从而防止兴奋性毒性损伤，并有助于塑造突触电流。我们发现，头孢曲松上调谷氨酸转运蛋白GLT-1会严重损害由重复刺激传入纤维在大鼠苔藓纤维（MF）-CA3突触处诱导的mGluR依赖性长时程抑制（LTD）。该效应与GLT-1有关，因为选择性GLT-1拮抗剂二氢红藻氨酸（DHK）可以挽救LTD。DHK本身可使fEPSP振幅略微降低，但在DHK洗脱后，fEPSP振幅迅速恢复至对照水平。此外，低亲和力谷氨酸受体拮抗剂γ-DGG诱导的fEPSP抑制程度在基础突触传递期间相似，但在LTD期间则不同，这表明在头孢曲松治疗的大鼠中，LTD诱导并未改变突触谷氨酸瞬时浓度。此外，头孢曲松诱导的GLT-1上调显著降低了MF-CA3突触的LTP幅度，但对Schaffer侧支-CA1突触的LTP幅度没有影响。大鼠的包埋后免疫金标记研究显示，星形胶质细胞突起和苔状纤维末端中编码GLT-1a的金颗粒密度增加；在苔状纤维末端，金颗粒位于活性区附近和活性区内。在用于验证免疫染色特异性的CEF处理和未处理的GLT-1 KO小鼠中，MF末端的金颗粒密度与背景水平相当。GLT-1在释放位点的表达增强可能抑制突触前受体的激活，从而揭示了GLT-1调控海马突触可塑性的新机制。

C7H12N2O5

204.182

204.075

C, 41.18; H, 5.92; N, 13.72; O, 39.18

6729-55-1

6604701

White to off-white solid powder

586.6ºC at 760 mmHg

308.6ºC

-4.3

129.72

4

6

6

14

240

1

C(CC(=O)NCC(=O)O)[C@H](C(=O)O)N

ACIJGUBIMXQCMF-SCSAIBSYSA-N

InChI=1S/C7H12N2O5/c8-4(7(13)14)1-2-5(10)9-3-6(11)12/h4H,1-3,8H2,(H,9,10)(H,11,12)(H,13,14)/t4-/m1/s1

(2R)-2-amino-5-(carboxymethylamino)-5-oxopentanoic acid

gamma-DGG; gamma DGG; 6729-55-1; gamma-D-Glutamylglycine; gamma-DGG; H-D-GLU(GLY-OH)-OH; gammaDGG; D-gamma-Glu-Gly; gamma-D-GLU-GLY; D-gamma-glutamylglycine; gammaDGG

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ≥ 150 mg/mL (~734.65 mM)

配方 1 中的溶解度: 25 mg/mL (122.44 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。