FLT3 (IC50 = 0.29 nM); LTK (IC50 = 0.35 nM); AXL (IC50 = 0.73 nM); EML4-ALK (IC50 = 1.2 nM); c-KIT (IC50 = 230 nM)
The targets of Gilteritinib hemifumarate (active ingredient: Gilteritinib/ASP2215) are Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) and AXL receptor tyrosine kinase; it is a type I tyrosine kinase inhibitor with high selectivity for FLT3 and AXL, and weak activity against c-KIT. [2]
Gilteritinib hemifumarate inhibits mutated forms of FLT3 including internal tandem duplication (FLT3-ITD), FLT3-D835Y point mutation, and FLT3-F691 mutation (weaker inhibitory activity against FLT3-F691); [2]

体外活性：在体外测试的 78 种酪氨酸激酶中，1 nM 浓度的 Gilteritinib 可抑制 FLT3、白细胞酪氨酸激酶 (LTK)、间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 和 AXL 激酶超过 50%，IC50 值为 0.29 nM对于 FLT3，其效力比 c-KIT 强约 800 倍。 Gilteritinib 在 1 nM（FLT3、LTK、ALK 和 AXL）或 5 nM（TRKA、ROS、RET 和 MER）浓度下对 78 种测试激酶中的 8 种抑制超过 50%。 FLT3 的 IC50 值为 0.29 nM，AXL 的 IC50 值为 0.73 nM。 Gilteritinib 抑制 FLT3 的 IC50 浓度比抑制 c-KIT 所需浓度 (230 nM) 强约 800 倍。 Gilteritinib 的抗增殖活性是针对内源性表达 FLT3-ITD 的 MV4-11 和 MOLM-13 细胞进行评估。治疗 5 天后，Gilteritinib 抑制 MV4-11 和 MOLM-13 细胞的生长，平均 IC50 分别为 0.92 nM (95% CI: 0.23-3.6 nM) 和 2.9 nM (95% CI: 1.4-5.8 nM)。 。 MV4-11 细胞的生长抑制伴随着 FLT3 磷酸化的抑制。相对于载体对照细胞，用 0.1 nM、1 nM 和 10 nM Gilteritinib 处理 2 小时后，磷酸化 FLT3 水平分别为 57%、8% 和 1%。此外，低至 0.1 nM 或 1 nM 的剂量会导致磷酸化 ERK、STAT5 和 AKT 的抑制，所有这些都是 FLT3 激活的下游靶标。为了研究 Gilteritinib 对 AXL 抑制的影响，用 Gilteritinib 处理表达外源 AXL 的 MV4-11 细胞。在 1 nM、10 nM 和 100 nM 浓度下持续 4 小时，Gilteritinib 治疗可使磷酸化 AXL 水平分别降低 38%、29% 和 22%。激酶测定：Gilteritinib 在一组 78 个测试激酶中进行了测试，使用的 ATP 浓度大约等于 TK-ELISA 或片外迁移率变动测定中每种激酶的 Km 值。最初，测试了两种浓度的 Gilteritinib（1 nM 和 5 nM），以评估每种化合物对 TK 活性的抑制作用。然后使用 Gilteritinib 的剂量范围进行进一步的研究，以确定激酶的 IC50 值，其中 1 nM Gilteritinib 以及 c-KIT 的活性被抑制 > 50%。 TK-ELISA 和 MSA 测定用于进行 FLT3、LTK、AXL 和 c-KIT 的 IC50 研究； HTRF KinEASE-TK 测定用于评估棘皮动物微管相关蛋白样 4-ALK (EML4-ALK) 的 IC50 值。细胞测定：用DMSO或增加浓度的gilteritinib处理的MV4-11细胞孵育2小时。对磷酸化 FLT3 和总 FLT3 进行免疫沉淀和免疫印迹。

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1. AML细胞系抗增殖活性：Gilteritinib hemifumarate的活性成分吉瑞替尼在携带FLT3突变的MV4-11、MOLM-13 AML细胞系，以及表达突变型FLT3（FLT3-ITD、FLT3-D835Y、FLT3-ITD-D835Y）的Ba/F3细胞中进行测试。MV4-11细胞经DMSO或递增浓度的吉瑞替尼处理5天后，采用CellTiter-Glo法检测细胞活力，结果显示吉瑞替尼以剂量依赖方式抑制细胞生长（均值±标准误，四重复实验，三次独立实验的代表性结果）；MOLM-13细胞经相同方式处理后，也观察到一致的剂量依赖性生长抑制[2]
2. 抑制FLT3磷酸化及下游信号通路：MV4-11细胞经DMSO或递增浓度的Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼处理2小时后，免疫沉淀和蛋白质印迹分析显示，吉瑞替尼以剂量依赖方式降低FLT3的磷酸化水平（印迹下方标注光密度值，三次重复实验）；此外，蛋白质印迹分析证实吉瑞替尼可降低FLT3下游靶点AKT、ERK、STAT5的磷酸化水平（三次重复实验）[2]
3. 抑制不同FLT3突变体：Gilteritinib hemifumarate的活性成分吉瑞替尼在细胞实验中对FLT3-ITD和FLT3-D835Y突变体表现出强效抑制活性，对FLT3-F691突变体的抑制活性较弱[2]

口服Gilteritinib 10 mg/kg 4天后，肿瘤（MV4-11异种移植小鼠）中Gilteritinib的浓度比血浆中的浓度高20倍。 Gilteritinib 治疗 28 天会导致 MV4-11 肿瘤生长的剂量依赖性抑制，并在超过 6 mg/kg 时诱导肿瘤完全消退。此外，Gilteritinib 可降低骨髓中的肿瘤负荷，并延长静脉移植 MV4-11 细胞的小鼠的存活时间。

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1. 血浆与肿瘤分布：给荷MV4-11皮下移植瘤的裸鼠单次口服Gilteritinib hemifumarate的活性成分吉瑞替尼（1 mg/kg、6 mg/kg、10 mg/kg），采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定血浆和肿瘤中的药物浓度，观察到吉瑞替尼在肿瘤组织中分布水平高（均值±标准差：血浆2-3只动物，肿瘤3只动物）[2]
2. 抑制移植瘤中FLT3/STAT5磷酸化：给荷MV4-11移植瘤的雄性小鼠口服溶媒对照或递增浓度的Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼，24小时内收集肿瘤组织蛋白裂解液，检测：（1）ELISA法测定磷酸化FLT3/总FLT3的比值（相对溶媒对照组归一化）；（2）蛋白质印迹法测定磷酸化STAT5/总STAT5的比值（相对溶媒对照组归一化）[2]
3. MV4-11异种移植模型的抗肿瘤活性：给荷MV4-11移植瘤的雄性小鼠每日一次口服溶媒对照或Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼（1 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg、10 mg/kg），持续28天。吉瑞替尼以剂量依赖方式降低肿瘤体积（均值±标准误，每组6只小鼠；第28天与对照组相比，P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001，Dunnett检验），且小鼠体重无显著变化[2]
4. FLT3突变体移植瘤模型的肿瘤消退：给荷表达FLT3-ITD、FLT3-D835Y或FLT3-ITD-D835Y的Ba/F3细胞移植瘤的雄性裸鼠，在肿瘤确认生长后，每日一次口服Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼（10 mg/kg或30 mg/kg），持续7天。吉瑞替尼在三种模型中均诱导显著的肿瘤消退（均值±标准误，每组5只小鼠；第7天与对照组相比，P < 0.01、P < 0.001，Dunnett检验）[2]
5. 降低白血病负荷并改善生存：给移植MV4-11-luc细胞的雌性NOD-SCID小鼠，从第15天开始每日一次口服30 mg/kg Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼，持续56天。活体成像显示吉瑞替尼显著降低MV4-11-luc细胞的骨髓浸润（均值±标准误，每组10只小鼠；第42天与对照组相比，P < 0.001，Student’s t检验）；Kaplan–Meier分析证实吉瑞替尼处理组小鼠生存率显著提升（与对照组相比，P < 0.001，Log-rank检验）[2]

TK-ELISA 或片外迁移率变化测定用于测试 Gilteritinib 对一组 78 种测试激酶的激酶抑制活性，其中 ATP 浓度大致相当于每种激酶的 Km 值。最初，在两种浓度的 Gilteritinib（1 nM 和 5 nM）下评估每种化合物对 TK 活性的抑制作用。接下来，使用一系列 Gilteritinib 剂量进行了其他研究，以确定 c-KIT 和激酶的 IC50 值，这些激酶的活性在 1 nM Gilteritinib 时被抑制一半以上。 FLT3、LTK、AXL 和 c-KIT IC50 研究是使用 TK-ELISA 和 MSA 测定进行的； HTRF KinEASE-TK 测定用于测定棘皮动物微管相关蛋白样 4-ALK (EML4-ALK) 的 IC50 值[2]。

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开展激酶选择性实验以评估Gilteritinib hemifumarate的活性成分吉瑞替尼。将纯化的FLT3、AXL、c-KIT及其他酪氨酸激酶与吉瑞替尼，在ATP和特异性底物存在下，于优化的反应条件下孵育；采用未指定的检测方法测定激酶活性，以评估吉瑞替尼对各激酶的抑制作用。结果证实吉瑞替尼对FLT3和AXL具有高选择性，对c-KIT活性弱 [2]

CellTiter-Glo 发光细胞活力测定用于评估 gelderitinib 对 MV4-11 和 MOLM-13 细胞的影响。进一步研究调查 quizartinib 和 gilteritinib 对表达 FLT3-ITD、FLT3-D835Y、FLT3-ITD-D835Y、FLT3-ITD-F691 L 或 FLT3-ITD-F691I 的 Ba/F3 细胞的影响。连续五天，将 DMSO 或增加浓度的 Gilteritinib（0.01、0.1、1、10 和 100 nM）应用于 MV4-11 和 MOLM-13 细胞。 CellTiter-Glo 用于测量细胞的活力[2]。

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1. AML细胞活力实验：
- 步骤1：将MV4-11和MOLM-13 AML细胞以未指定密度接种至适宜培养板，在标准条件下培养，确保细胞处于对数生长期；
- 步骤2：用DMSO（对照）或系列浓度的Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼处理细胞，孵育5天；
- 步骤3：采用CellTiter-Glo法（未指定检测原理）量化细胞活力，四重复收集数据并以均值±标准误呈现；实验重复三次，报道代表性结果[2]
2. FLT3磷酸化的免疫沉淀与蛋白质印迹实验：
- 步骤1：将MV4-11细胞培养至所需汇合度，用DMSO或递增浓度的Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼处理2小时；
- 步骤2：收集细胞并裂解（裂解液组分未指定），采用未指定方法测定蛋白浓度；
- 步骤3：用FLT3特异性抗体从细胞裂解液中免疫沉淀FLT3蛋白，将免疫沉淀物进行SDS-PAGE电泳（凝胶浓度未指定）；
- 步骤4：将分离的蛋白转至未指定类型的膜上，用磷酸化FLT3和总FLT3一抗孵育，再加入二抗；
- 步骤5：采用未指定方法检测蛋白条带，光密度分析量化条带强度（值标注于印迹下方）；实验重复三次[2]
3. FLT3下游信号蛋白的蛋白质印迹实验：
- 步骤1：按上述方法用DMSO或递增浓度的Gilteritinib hemifumarate活性成分吉瑞替尼处理MV4-11细胞2小时；
- 步骤2：制备细胞裂解液，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜，用磷酸化AKT、ERK、STAT5及其总蛋白一抗孵育（未指定内参）；
- 步骤3：检测并分析蛋白条带（三次重复实验）[2]

小鼠：在移植了MV4-11 AML细胞的裸鼠中评估抗肿瘤活性。此外，还检测了异种移植小鼠的药代动力学。作为治疗的一部分，对MV4-11异种移植小鼠口服吉瑞替尼（10 mg/kg），疗程为4天。吉瑞替尼治疗28天，剂量大于6 mg/kg时可导致肿瘤完全消退，并呈剂量依赖性地抑制MV4-11肿瘤的生长[1]。

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1. MV4-11异种移植模型（药代动力学分析）：
- 步骤1：将MV4-11 AML细胞以未指定的细胞数量皮下注射到裸鼠（性别/年龄未指定）体内，以建立异种移植模型。
- 步骤2：当肿瘤达到未指定的体积时，小鼠单次口服吉瑞替尼（来自吉瑞替尼半富马酸盐），剂量分别为1 mg/kg、6 mg/kg或10 mg/kg（药物制剂/载体未指定）。
- 步骤3：给药后在未指定的时间点采集血液和肿瘤样本。
- 步骤4：测定血浆和肿瘤中的药物浓度采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定吉瑞替尼的浓度，数据以均值±标准差（SD）表示（血浆样本取2-3只动物，肿瘤样本取3只动物）[2]
2. MV4-11异种移植瘤模型（药效学/疗效分析）：
- 步骤1：将MV4-11细胞皮下植入雄性裸鼠（每组n=6）体内，建立异种移植瘤模型。
- 步骤2：肿瘤形成后（肿瘤体积未指定），小鼠分别口服给予载体对照或吉瑞替尼（来自吉瑞替尼半富马酸盐），剂量分别为1 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg或10 mg/kg，每日一次，连续28天（药物制剂未指定）。
- 步骤3：进行药效学分析：收集24小时内的肿瘤组织，制备蛋白裂解液，并测定了磷酸化FLT3/总FLT3（ELISA）和磷酸化STAT5/总STAT5（免疫印迹）的比值。
- 步骤4：疗效分析：在未指定的时间间隔测量肿瘤体积和体重，并在第28天进行统计分析（Dunnett检验）[2]
3. Ba/F3-FLT3突变异种移植模型：
- 步骤1：将表达FLT3-ITD、FLT3-D835Y或FLT3-ITD-D835Y的Ba/F3细胞皮下注射到雄性裸鼠（每组n=5）体内，以建立异种移植模型。
- 步骤2：确认肿瘤生长（体积未指定）后，小鼠分别口服给予载体对照、10 mg/kg或30 mg/kg的吉瑞替尼（来自吉瑞替尼半富马酸盐）每日一次，最多持续7天（药物制剂未指定）。
- 步骤3：在未指定的时间点测量肿瘤体积，并在第7天进行统计分析（Dunnett检验）[2]
4. 骨髓内移植模型：
- 步骤1：将MV4-11-luc细胞（表达荧光素酶的MV4-11细胞）通过骨髓内注射移植到雌性NOD-SCID小鼠体内（注射部位/细胞数量未指定）。
- 步骤2：从移植后第15天开始，小鼠（每组n=10）口服给予载体对照或30 mg/kg的吉瑞替尼（来自吉瑞替尼半富马酸盐），每日一次，持续56天（药物制剂未指定）。步骤 3：在未指定的时间点（例如，第 21 天、第 42 天）进行全身生物发光成像，以监测 MV4-11-luc 细胞的骨髓浸润情况（成像参数未指定）。
- 步骤 4：记录小鼠存活率，并进行 Kaplan-Meier 分析（Log-rank 检验）[2]

1. 吸收和分布：吉瑞替尼（吉瑞替尼半富马酸盐的活性成分）口服给药后，在携带MV4-11异种移植瘤的裸鼠体内迅速吸收，并在肿瘤组织中分布广泛。单次口服给药（1 mg/kg、6 mg/kg、10 mg/kg）后，采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定血浆和肿瘤组织中的药物浓度[2]。
2. 代谢、排泄、半衰期和生物利用度：未提供吉瑞替尼半富马酸盐的代谢、排泄、半衰期或口服生物利用度的相关信息[2]。

1. 体内毒性：在接受吉瑞替尼（源自吉瑞替尼半富马酸盐）治疗的小鼠模型中未观察到明显的毒性。在MV4-11异种移植瘤模型中，吉瑞替尼（1-10 mg/kg，每日一次）治疗28天后，小鼠体重未发生显著变化，表明其具有良好的耐受性[2]。

[1]. ASP2215, a novel FLT3/AXL inhibitor: Preclinical evaluation in acute myeloid leukemia (AML). 2014 ASCO Annual Meeting.

[2]. Gilteritinib, a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3 mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 2017 Oct;35(5):556-565.

富马酸吉瑞替尼是吉瑞替尼的富马酸盐形式，是一种口服生物利用度高的受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂，包括FMS样酪氨酸激酶3（FLT3；STK1；FLK2）、AXL（UFO；JTK11）、间变性淋巴瘤激酶（ALK；CD246）和白细胞受体酪氨酸激酶（LTK），具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，吉瑞替尼可与FLT3、AXL、ALK和LTK的野生型和突变型结合并抑制其活性。这可能导致FLT3、AXL、ALK和LTK介导的信号转导通路受到抑制，并降低过度表达这些RTK的癌细胞的增殖。 FLT3、AXL、ALK 和 LTK 在多种癌细胞类型中过度表达或发生突变，在肿瘤细胞的生长和存活中发挥关键作用。
另见：吉瑞替尼（具有活性部分）。

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药物适应症
Xospata 适用于治疗伴有 FLT3 突变的复发或难治性急性髓系白血病 (AML) 成人患者，作为单药疗法。

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1. 背景和组成：吉瑞替尼半富马酸盐是吉瑞替尼 (ASP2215) 的盐形式，吉瑞替尼是一种新型 I 型酪氨酸激酶抑制剂，对 FLT3 和 AXL 具有高选择性。FLT3 是急性髓系白血病 (AML) 中最常见的突变基因之一，FLT3 突变与较差的总生存期相关； AXL参与FLT3激活和AML发病机制[2]
2.作用机制：吉瑞替尼半富马酸盐中的活性成分吉瑞替尼通过抑制突变FLT3及其下游信号通路（AKT、ERK、STAT5）的磷酸化发挥抗白血病活性，从而抑制AML细胞增殖并在体内诱导肿瘤消退[2]
3.临床潜力：临床前研究表明，吉瑞替尼半富马酸盐（通过其活性成分吉瑞替尼）在FLT3突变的AML细胞系和小鼠模型（异种移植和骨髓内移植模型）中具有强大的抗白血病活性，且无明显毒性，表明其可能是一种有前景的下一代FLT3抑制剂，用于治疗FLT3突变阳性的AML[2]
4.计算模型：对吉瑞替尼（吉瑞替尼半富马酸盐的活性成分）与野生型FLT3的结合进行了计算建模。吉瑞替尼以球棍模型可视化（原子按元素类型着色），蛋白质表面按静电势着色；门控残基F691被突出显示[2]

C29H44N8O3₀.₅C₄H₄O₄

610.75

1220.718

C, 60.96; H, 7.59; N, 18.35; O, 13.10

1254053-84-3

Gilteritinib;1254053-43-4

76970819

White to yellow solid powder

317

8

24

20

88

904

0

CCC1=C(N=C(C(=N1)C(=O)N)NC2=CC(=C(C=C2)N3CCC(CC3)N4CCN(CC4)C)OC)NC5CCOCC5.CCC1=C(N=C(C(=N1)C(=O)N)NC2=CC(=C(C=C2)N3CCC(CC3)N4CCN(CC4)C)OC)NC5CCOCC5.C(=C/C(=O)O)\C(=O)O

UJOUWHLYTQFUCU-WXXKFALUSA-N

InChI=1S/2C29H44N8O3.C4H4O4/c2*1-4-23-28(31-20-9-17-40-18-10-20)34-29(26(33-23)27(30)38)32-21-5-6-24(25(19-21)39-3)37-11-7-22(8-12-37)36-15-13-35(2)14-16-36;5-3(6)1-2-4(7)8/h2*5-6,19-20,22H,4,7-18H2,1-3H3,(H2,30,38)(H2,31,32,34);1-2H,(H,5,6)(H,7,8)/b;;2-1+

(E)-but-2-enedioic acid;6-ethyl-3-[3-methoxy-4-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1-yl]anilino]-5-(oxan-4-ylamino)pyrazine-2-carboxamide

ASP2215 hemifumarate; ASP-2215 hemifumarate; ASP 2215 hemifumarate; Gilteritinib hemifumarate; Trade name: Xospata

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 10 mg/mL (16.37 mM) in 50% PEG300 +50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。