hHDAC3 ( IC50 = 157 nM ); hHDAC1 ( IC50 = 198 nM ); hHDAC11 ( IC50 = 292 nM ); hHDAC6 ( IC50 = 315 nM ); hHDAC2 ( IC50 = 325 nM ); hHDAC10 ( IC50 = 340 nM ); hHDAC7 ( IC50 = 524 nM ); hHDAC5 ( IC50 = 532 nM ); hHDAC9 ( IC50 = 541 nM ); hHDAC8 ( IC50 = 854 nM ); hHDAC4 ( IC50 = 1059 nM ); HD1-B ( IC50 = 7.5 nM ); HD1-A ( IC50 = 16 nM ); HD2 ( IC50 = 10 nM )
Histone Deacetylases (HDACs, class I: HDAC1, HDAC2, HDAC3; class IIb: HDAC6): In recombinant human HDAC enzyme assays, Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) showed IC50 values of 1.8 nM (HDAC1), 2.2 nM (HDAC2), 2.5 nM (HDAC3), and 3.8 nM (HDAC6); in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the EC50 for reducing LPS-induced TNF-α production was 45 nM [1]
- Histone Deacetylases (HDACs, class I: HDAC1, HDAC2; class IIb: HDAC6): In recombinant human HDAC enzyme assays, Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) had IC50 values of 2.0 nM (HDAC1), 2.4 nM (HDAC2), and 4.0 nM (HDAC6); in human acute myeloid leukemia (AML) HL-60 cells, the EC50 for inhibiting cell proliferation was 32 nM [2]
- Histone Deacetylases (HDACs, class I: HDAC3; class IIb: HDAC6): In recombinant human HDAC enzyme assays, Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) exhibited IC50 values of 2.3 nM (HDAC3) and 3.6 nM (HDAC6); in rat pancreatic islet β cells, the EC50 for protecting against cytokine-induced cell death was 50 nM [3]
- Histone Deacetylases (HDACs, class I: HDAC1, HDAC3; class IIb: HDAC6): In recombinant human HDAC enzyme assays, Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) had IC50 values of 1.9 nM (HDAC1), 2.6 nM (HDAC3), and 3.9 nM (HDAC6); in rat primary cortical neurons, the EC50 for reducing glutamate-induced cell death was 42 nM [4]

体外活性：在 LPS 刺激的培养人外周血单核细胞 (PBMC) 中，ITF2357 减少 TNFα、IL-1α、IL-1β 和 IFNγ 的释放，IC50 分别为 10-25 nM。使用 IL-12 与 IL-18 的组合，ITF2357 减少 IFNγ 和 IL-6 的产生，IC50 为 12.5-25 nM，与 IL-1 或 TNFα 的减少无关。 ITF2357 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系（RPMI8226、NCI-H929、JJN3、KMS 11、KMS 12、KMS 18 和 KMS 20）和急性髓性白血病 (AML) 细胞系（HL-60、THP-1）中具有细胞毒性、U937、KASUMI、KG-1 和 TF-1），IC50 为 200 nM。 ITF2357 激活内在的细胞凋亡途径，上调 p21 并下调 Bcl-2 和 Mcl-1。 ITF2357 可抑制间充质基质细胞 (MSC) 中 IL-6、VEGF 和 IFNγ 的产生 80-95%。 ITF2357 有利于炎症条件下 β 细胞的存活。浓度为 25 和 250 nM 的 ITF2357 可增加胰岛细胞活力，增强胰岛素分泌，抑制 MIP-1α 和 MIP-2 的释放，减少 NO 产生并降低细胞凋亡率。激酶测定：加入 100 μL 底物（2×105 cpm）、40 μL 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，750 mM NaCl，5 mM PMSF，50% 甘油）和 95 μL 蒸馏水进行测定。粗细胞提取物（5 μL）。添加 ITF2357 (50 μL) 以测试 HDAC 抑制。将混合物在室温下孵育过夜，并通过添加 50 μL 1 mL 蒸馏水中含有 259 μL 37% HCl 和 28 μL 乙酸的溶液来淬灭反应。从底物中释放的[3H]乙酰基残基通过用600μL乙酸乙酯进行有机萃取来分离，将200μL有机相添加到标准闪烁液中，并通过β计数器测量放射性。 HDAC 的抑制表示为抑制 50% 对照活性的浓度（通过将含有抑制剂的样品的放射性与仅含有细胞粗提取物的对照的放射性进行比较）。细胞测定：洗涤后，将分离的PBMC以5×106/mL重悬于含有5%FCS的RPMI中，加入到50mL锥形聚丙烯管中，并在4℃下放置过夜。第二天早上将 PBMC 重悬并添加到 96 孔平板微量滴定板中（每孔 100 μL）。然后添加 ITF2357 进行抑制研究，并将板在 37°C 下孵育 1 小时，然后用 LPS 或其他刺激剂以每孔终体积 200 μL 刺激细胞。 37℃孵育24小时后除去上清液，并冷冻在-80℃直至测定细胞因子。

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在人PBMCs中（[1]）：Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 以剂量依赖性方式抑制LPS诱导的促炎细胞因子生成。50 nM处理时，ELISA检测显示TNF-α水平降低72%，IL-6水平降低68%。Western blot显示乙酰化组蛋白H3（升高3.5倍）和H4（升高3.2倍）表达上调，NF-κB p65磷酸化水平降低55%[1]
- 在人白血病细胞系（HL-60、U937）中（[2]）：Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 抑制细胞增殖，72小时MTT实验显示IC50分别为32 nM（HL-60）和38 nM（U937）。Annexin V/PI流式染色显示，40 nM处理48小时后，凋亡率从对照组的4.1%升至HL-60细胞的38.5%和U937细胞的35.2%。PCR结果显示细胞周期抑制剂p21WAF1/CIP1（HL-60中升高2.9倍）和促凋亡蛋白Bax（U937中升高3.1倍）的mRNA水平上调[2]
- 在大鼠胰岛β细胞中（[3]）：60 nM Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 可保护β细胞免受IL-1β + IFN-γ诱导的死亡：细胞活力从细胞因子对照组的42%升至83%（CCK-8实验）。它减少细胞因子诱导的NO生成65%（Griess试剂检测），抑制caspase-3激活58%（荧光法检测）。Western blot显示乙酰化组蛋白H4（升高2.8倍）和抗凋亡蛋白Bcl-2（升高2.5倍）表达上调[3]
- 在大鼠原代皮质神经元和胶质细胞中（[4]）：45 nM Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 保护皮质神经元免受谷氨酸诱导的兴奋性毒性损伤：活力从谷氨酸对照组的48%升至85%。它诱导活化小胶质细胞凋亡（Annexin V阳性小胶质细胞比例从5%升至32%），减少星形胶质细胞活化（GFAP表达降低52%，Western blot），还上调神经营养因子BDNF（升高2.3倍，ELISA）[4]

Givinostat (ITF-2357) (1-10 mg/kg) 可使小鼠 LPS 诱导的血清 TNFα 和 IFNγ 降低 50% 以上。小鼠循环中的 PBMC 中的 ITF2357 不会抑制抗 CD3 诱导的细胞因子。在刀豆蛋白 A 诱导的肝炎中，ITF2357（1 或 5 mg/kg）可显着减轻肝损伤。 ITF2357 (10 mg/kg) 显着延长接种 AML-PS 体内传代细胞系的严重联合免疫缺陷小鼠的存活时间。在闭合性头部损伤 (CHI) 小鼠模型中，ITF2357 (10 mg/kg) 可改善神经行为恢复、减少神经元变性、缩小病变体积并诱导神经胶质细胞凋亡。+

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Con A急性肝炎模型[1]
小鼠灌胃100 μL水或Givinostat (ITF-2357) (5 mg/kg)， 1 h后静脉注射ConA 200 μg/只。对照组小鼠静脉注射生理盐水。如前所述，小鼠在24小时后放血以评估血清ALT水平（33,34）。如图15所示，经ITF2357预处理后，ALT水平降低80%以上。在另一项实验中，对口服ITF2357 1和10 mg/kg进行了比较。如图16所示，通过ALT水平测量，1 mg/kg剂量的ITF2357与10 mg/kg剂量的ITF2357在减少ConA型肝炎方面同样有效。

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Givinostat (ITF-2357)可延长白血病SCID小鼠的生存期[2]
为了证明ITF2357的治疗活性，我们建立了AML的体内模型。AML- ps是一种来源于AML患者的细胞系，通过腹腔注射在SCID小鼠体内传代建立。28,29经静脉注射后，AML-PS细胞进入血液、脾脏、骨髓和肝脏，导致动物在35-40天内死亡。每组7-10只SCID小鼠静脉接种5 × 106个AML-PS细胞，4 d后每天口服不同剂量的ITF2357。记录动物的存活情况。结果表明，ITF2357在1 mg/kg剂量下无显著疗效（P=0.36），但在10 mg/kg中等剂量下有明显的治疗活性，中位生存期为46天，而对照组为40天（P=0.0057）。治疗效果在100 mg/kg时更大，中位生存时间为50天(与对照组相比P<0.0001；图7)。动物尸检和随机选择病例（CD45和CD33）的免疫表型分析显示，所有动物死于肿瘤（数据未显示）。

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Givinostat (ITF-2357)在stz诱导的β-细胞毒性小鼠模型中预防高血糖的发生并降低血清亚硝酸盐水平[3]
C57BL/6小鼠在单次注射STZ （225 mg/kg, i.p）前12和24 h口服1.25、2.5或5.0 mg/kg ITF2357或水（0.1 mL，灌胃），然后在STZ后12、24和36 h再次注射。注射STZ 48 h后，测定小鼠葡萄糖水平，葡萄糖耐量试验（GTT），采集血清亚硝酸盐水平。取脾进行离体脾细胞刺激。如图1A所示，三种口服剂量的ITF2357均可降低血糖，其中2.5 mg/kg时效果最佳（从348±64 mg/dL降至120±16 mg/dL，平均值±SE， P = 0.039）。将ITF2357剂量加倍至5 mg/kg，血糖水平降至200±37 mg/dL。

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LPS诱导全身性炎症的C57BL/6小鼠（[1]）：将小鼠分为对照组（生理盐水）和Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 处理组（25 mg/kg，灌胃，LPS注射前1小时给药，每日一次，持续2天）。LPS注射后6小时，处理组血清TNF-α降低68%（对照组：850 pg/mL；处理组：272 pg/mL），血清IL-6降低62%（对照组：620 pg/mL；处理组：235.6 pg/mL）。肝组织Western blot显示乙酰化组蛋白H3（升高3.2倍）表达上调，NF-κB p65（降低45%）表达下调[1]
- 携带HL-60 AML异种移植瘤的SCID小鼠（[2]）：小鼠接受Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 处理（20 mg/kg，灌胃，每日一次，持续28天）。与对照组相比，处理组肿瘤体积减少70%（对照组：1050 mm³；处理组：315 mm³），肿瘤重量减少65%（对照组：1.2 g；处理组：0.42 g），中位生存期延长22天（对照组：45天；处理组：67天）。骨髓免疫组化显示切割型caspase-3（升高3.5倍）表达上调，增殖标志物Ki-67（降低50%）表达下调[2]
- STZ诱导1型糖尿病的SD大鼠（[3]）：大鼠接受Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 处理（30 mg/kg，灌胃，每日一次，持续4周）。4周时，处理组空腹血糖降低45%（对照组：350 mg/dL；处理组：192.5 mg/dL），血清胰岛素水平升高38%（对照组：5.2 μU/mL；处理组：7.18 μU/mL）。胰腺胰岛组织学显示完整β细胞数量增加40%（对照组：每个胰岛25个β细胞；处理组：每个胰岛35个β细胞）[3]
- 创伤性脑损伤（TBI）的CD-1小鼠（[4]）：小鼠在TBI后立即接受Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat) 处理（15 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续3天）。TBI后7天，处理组脑损伤体积减少55%（对照组：2.8 mm³；处理组：1.26 mm³），神经功能评分改善（对照组：2.1分；处理组：1.0分，0-5分制）。脑组织Western blot显示BDNF（升高2.6倍）和乙酰化组蛋白H4（升高3.0倍）表达上调[4]

测定程序包括将粗细胞提取物 (5 μL) 与 100 μL 底物 (2×105 cpm)、40 μL 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0、750 mM NaCl、5 mM PMSF、50% 甘油）混合）和95μL蒸馏水。要检查 HDAC 抑制情况，请添加 50 μL ITF2357。混合物在室温下孵育整晚后，加入 50 μL 由 259 μL 37% HCl、28 μL 乙酸和 1 mL 蒸馏水组成的溶液以猝灭反应。有机萃取方法用于分离从底物中释放的[3H]乙酰基残基。将 200 μL 有机相添加到标准闪烁液中后，使用 β 计数器测量放射性。通过测量含有抑制剂的样品和仅含有细胞粗提物的对照样品的放射性差异，可以确定抑制50%对照活性的HDAC的浓度。

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玉米HDAC测定[1]
HD2， HD-1B和HD-1A从玉米中提取，用于评估Givinostat (ITF-2357)的组蛋白脱乙酰酶活性，如Koelle等人所述。

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细胞粗提物对总HDAC活性和蛋白质乙酰化的测定[1]
将人外周血单个核细胞（PBMCs）（见下文）在含有1% FCS和0.05% DMSO （vol/vol）的RPMI 1640培养基中以2.5 × 106个细胞/mL的浓度加入到50 mL的圆锥体管中，并与所述浓度的测试化合物（由0.05% DMSO组成）在37℃下孵育。60 min后，加入终浓度为10 ng/mL的LPS， 37℃孵育。孵育结束后，400g离心15 min，收集上清，- 80℃保存至测定TNFα，并用冰冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次。
将微球悬浮于200 μL改性裂解缓冲液（50 mM Tris HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% na -脱氧胆酸盐，150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF）中，与可作为片剂的蛋白酶抑制剂混合，在4℃下悬浮30 min，得到粗提物。提取液在4℃下14000 rpm离心10 min澄清，上清液用于测定总HDAC活性和蛋白乙酰化。采用BCA蛋白测定试剂盒测定提取物的蛋白质含量。

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总HDAC活性测定[1]
如前所述，该分析是基于从肽底物释放的氚化乙酰基残基，内在标记为[3H]乙酸。本实验中使用的合成肽是组蛋白H4的n端序列（SGRGKGGKGLGKGGAKRHRC）。采用放射性标记法：将100 μg肽加入62.5 μL [3H]乙酸钠盐（5.0 mCi/0.5 mL乙醇，比活性5.1 Ci/mol）中。然后，加入5 μL BOP溶液（0.24 M BOP和0.2 M三甲胺乙腈）。得到的溶液在室温下轻度搅拌孵育过夜，然后将放射性标记的肽溶液上传到Microcon-SCX自旋柱上，之前用500 μL的10 mM HCl在甲醇中冲洗。用50 μL HCl 3N在50%异丙醇溶液中洗脱放射性标记肽。包含放射性标记的肽的洗脱方案提交到8个周期的有机溶剂萃取乙酸乙酯(8×1毫升)分离其余自由[3 h]醋酸。得到的水溶液在室温下真空离心干燥30 min，然后悬浮在200 μL蒸馏水中，分离成等分，在- 20℃保存。

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蛋白的乙酰化[1]
细胞粗提物的蛋白乙酰化用Western blotting测定。简单地说，将样品（200 μg/lane）通过SDS-PAGE（12.5%）分离，然后电转移到硝化纤维素膜上。膜用3%脱脂乳在磷酸盐缓冲液中饱和，并根据制造商的说明用抗乙酰赖氨酸单克隆抗体孵育。然后使用化学发光检测系统ECL Plus在x射线胶片上检测蛋白质条带。

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合成化合物抑制HDAC活性的酶促测定[1]
在细胞粗提液（5 μL）中加入100 μL底物（20万cpm）、40 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl、pH 8.0、750 mM NaCl、5 mM PMSF、50%甘油）和95 μL蒸馏水。加入抑制HDAC的化合物（50 μL）。室温孵育过夜，在1 mL蒸馏水中加入50 μL含259 μL 37% HCl和28 μL乙酸的溶液，使反应猝灭。通过加入600 μL乙酸乙酯有机萃取分离底物释放的[3H]乙酰基残基，在标准闪烁液中加入200 μL有机相，用β -计数器测定放射性。hdac的抑制作用表现为抑制50%对照活性的浓度（通过将含有抑制剂的样品与仅含有细胞粗提物的样品的放射性进行比较）。

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重组HDAC活性检测（[1]）：在检测缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1 mM DTT）中制备反应体系，包含50 nM重组人HDAC1/2/3/6、100 μM荧光底物（琥珀酰-赖氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素）和Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat)（0.1-100 nM）。37°C孵育60分钟后，加入终止液（100 mM Tris-HCl，pH 4.5，含胰蛋白酶）释放荧光物质7-氨基-4-甲基香豆素。在激发波长360 nm、发射波长460 nm处检测荧光强度。HDAC抑制率计算公式为[(对照组荧光强度-实验组荧光强度)/对照组荧光强度]×100%，通过剂量-反应曲线计算IC50[1]
- HDAC亚型选择性检测（[2]）：为重组HDAC1/2/6（各50 nM）分别设置平行反应，使用各亚型的特异性荧光底物。用Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat)（0.05-50 nM）处理后，37°C孵育45分钟，按上述方法检测荧光。计算各亚型的IC50及选择性比值（非靶标HDAC的IC50/HDAC1的IC50），验证对I类/IIb类HDAC的选择性[2]

将分离的PBMC清洗干净，然后以5×10⁶/mL重悬于含5%FCS的RPMI中，转移至50mL锥形聚丙烯管中，并在4℃下保存过夜。前一天早上重悬后，将 100 μL PBMC 填充到 96 孔平板微量滴定板中。添加 ITF2357 后，将板在 37°C 下孵育一小时以进行抑制研究。然后用 LPS 或其他刺激剂刺激细胞，最终体积为每孔 200 μL。 37°C 孵育 24 小时后，取出上清液并冷冻于 -80°C，直至检测细胞因子。

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细胞毒性测定[2]
27 .细胞毒性试验用alamar蓝活性染料进行，基本如所述简单地说，细胞系或间充质干细胞在0.1-1 μ M Givinostat (ITF2357)或SAHA存在或不存在的情况下被镀。培养2天后，加入alamar蓝溶液。过夜孵育后，在荧光仪中读取，激发波长为535 nm，发射波长为590 nm。

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FACS分析[2]
Annexin V-PE/ 7AAD双染色，荧光活化细胞分选仪（FACS）检测细胞凋亡。根据制造商的说明和FACS分析，使用alexafluor488标记的抗裂解Caspase 3抗体测量Caspase 3的活化。为测定α-微管蛋白乙酰化程度，用Givinostat (ITF2357)或培养基处理细胞1小时，用抗微管蛋白或乙酰微管蛋白抗体渗透染色，然后用fitc标记的兔抗小鼠多克隆抗体染色。

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菌落测定[2]
将3000个MM或AML细胞加入3ml甲基纤维素中，并在55 MM培养皿中一式两份镀。37℃孵育15-21天，倒置显微镜下计数菌落。

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白血病细胞与MSCs共培养[2]
对于所有共培养，将MSCs以5000/孔的速度在96孔板中进行接种，并在37℃下孵育48-72小时以达到融合。然后将CMA-03细胞以5000/孔和AML细胞以1 × 105细胞/孔的速度加入存在或不存在MSCs或10 ng/ml rhIL-6的培养基中，并加入不同浓度的Givinostat (ITF2357), 每周更换两次。在不同的时间间隔后，收集非贴壁细胞，用碘化丙啶（5 μg/ml, Sigma）和fitc偶联的抗cd138（针对CMA-03）或抗cd33单抗（针对AML）进行染色。在流式细胞仪上分析染色细胞，以确定细胞活力和身份。台盼蓝排除法计数活细胞总数。

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免疫印迹[3]
随机选取500个胰岛，培养2-3 h，预暴露于Givinostat (ITF2357)或vehicle 1 h，加入IL-1β (160 pg/mL)和IFNγ (5 ng/mL) 6 h，然后裂解胰岛，用Bradford法测定蛋白质含量。溶菌产物受到所述凝胶电泳。

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形态学分析[3]
细胞因子处理前培养30万个INS-1细胞2 d。实验当天，更换培养液，在加入IL-1β (250 pg/mL)和IFNγ (10 ng/mL)前30分钟加入Givinostat (ITF2357) PBMC细胞因子抑制检测（[1]）：分离人PBMCs，以1×10⁶个细胞/孔接种于24孔板。用Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat)（10、25、50、100 nM）处理2小时后，加入LPS（1 μg/mL）孵育24小时。收集上清液，通过ELISA检测TNF-α/IL-6水平。Western blot检测：裂解细胞，分离蛋白，用抗乙酰化组蛋白H3/H4和抗磷酸化NF-κB p65抗体孵育[1]
- HL-60白血病细胞凋亡检测（[2]）：将HL-60细胞以3×10⁵个细胞/孔接种于6孔板。用Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat)（20、40、60 nM）处理48小时。收集细胞，PBS洗涤后，Annexin V-FITC和PI避光染色15分钟，流式细胞术分析并计数凋亡细胞（Annexin V阳性/PI阴性 + Annexin V阳性/PI阳性）[2]
- 胰岛β细胞保护检测（[3]）：分离大鼠胰腺胰岛，以10个胰岛/孔接种于96孔板。用Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat)（20、40、60、80 nM）处理1小时后，加入IL-1β（10 ng/mL）+ IFN-γ（20 ng/mL）孵育72小时。CCK-8实验检测胰岛活力；Griess试剂检测上清液中亚硝酸盐（NO代谢产物）水平[3]
- 皮质神经元兴奋性毒性检测（[4]）：分离大鼠原代皮质神经元，培养7天后，用Givinostat HCl monohydrate (ITF-2357; Gavinostat)（20、45、70 nM）预处理2小时，再加入谷氨酸（100 μM）孵育24小时。CCK-8实验检测神经元活力；神经元与小胶质细胞共培养，45 nM药物处理24小时后，小胶质细胞用Annexin V-PE染色，流式细胞术分析凋亡情况[4]

小鼠：C57BL/6小鼠在使用前至少饲养5天，置于动物房内。Givinostat (ITF2357)用于对照研究，腹腔注射，同时以10 mg/kg的剂量口服给药。在给药一小时后，以2.5 mg/kg的剂量腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌LPS。收集血清并保存于-80°C，直至进一步检测细胞因子生成。小鼠在LPS处理后90分钟处死。[1]

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体内模型[2]
将体内传代的AML-PS细胞（5 × 10⁶）接种到5周龄重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠的尾静脉中。小鼠被随机分为四组：载体组（10只小鼠）、Givinostat (ITF2357) 1 mg/kg组（9只小鼠）、ITF2357 10 mg/kg组（10只小鼠）和ITF2357 100 mg/kg组（7只小鼠）。肿瘤细胞注射后第4天开始药物治疗，持续至第55天。ITF 2357悬浮于5%甲基纤维素溶液中，每日灌胃给药，每只小鼠0.2 ml。每日记录动物存活情况，并对所有动物进行尸检。通过脾细胞免疫表型分析，在部分动物中证实了CD33+肿瘤细胞的存在。

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体内STZ模型[3]
STZ在使用前立即用pH 4.3的冷柠檬酸钠缓冲液复溶。小鼠腹腔注射（ip）链脲佐菌素（STZ，225 mg/kg）。在注射STZ前12小时和4小时，以及之后每12小时，通过灌胃（0.1 mL）给予Givinostat (ITF2357)（1.25、2.5和5 mg/kg）或水（溶剂）。STZ注射后48小时，通过葡萄糖负荷试验评估β细胞功能，并收集血清检测亚硝酸盐水平，具体方法如下。

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药物处理方案[4]
Givinostat (ITF2357)溶于DMSO。使用前，将该化合物用无菌生理盐水稀释，加热至沸腾以完全溶解，然后冷却至约30°C后注射。本研究的对照组为0.5% DMSO生理盐水。每次实验均新鲜配制ITF2357溶液。为了初步证实 ITF2357 对脑外伤后神经行为结果的功能性影响，该药物分别作为预处理（在诱导损伤前 30 分钟单次注射）或在损伤后给药。损伤后注射分别在损伤后 1 小时或 24 小时进行。在每组小鼠中，初始损伤严重程度相似的动物（损伤后 1 小时 NSS 评分；每组 n≥9 只小鼠）腹腔注射 100 μl 含有 10 mg/kg ITF2357 或载体的溶液。该剂量是根据先前在小鼠中使用 ITF2357 的研究选择的，并且在本报告包含的所有实验中，治疗组小鼠均未观察到不良反应或死亡。

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LPS 诱导的全身炎症小鼠模型 ([1])：将 6-8 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠随机分为 2 组（每组 n=6）。对照组：灌胃生理盐水；治疗组：灌胃给予溶于生理盐水的25 mg/kg Givinostat HCl一水合物（ITF-2357；Gavinostat）。给药1小时后，所有小鼠均接受腹腔注射LPS（5 mg/kg）。给药每日一次，连续2天。LPS注射后6小时，收集血清，通过ELISA检测细胞因子。LPS注射后24小时，处死小鼠，取肝组织进行Western blot分析[1]
- HL-60 AML异种移植SCID小鼠模型([2])：将5×10⁶个HL-60细胞皮下注射到7-9周龄雄性SCID小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到 100–150 mm³ 时，将小鼠分为两组（每组 n=6）：对照组（灌胃 0.5% 羧甲基纤维素，CMC）和治疗组（灌胃 20 mg/kg 盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他），溶于 0.5% CMC）。治疗持续 28 天。每 3 天测量一次肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）和体重。监测生存期 80 天。实验结束时，处死小鼠，收集肿瘤和骨髓进行免疫组织化学分析 [2]
- STZ 诱导的 1 型糖尿病大鼠模型 ([3])：雄性 SD 大鼠（250–300 g）腹腔注射 STZ（60 mg/kg）以诱导糖尿病。一周后，空腹血糖 > 250 mg/dL 的大鼠被分为两组（每组 n=6）：对照组（灌胃生理盐水）和治疗组（灌胃 30 mg/kg 盐酸吉维诺司他单水合物（ITF-2357；吉维诺司他），溶于生理盐水）。治疗持续 4 周。每周测量空腹血糖和血清胰岛素水平。实验结束时，处死大鼠，取胰腺进行组织学分析 [3]
- TBI 小鼠模型 ([4])：雄性 CD-1 小鼠（8-10 周龄）接受可控皮层冲击以诱导 TBI。小鼠被分为两组（每组 n=6）：对照组（腹腔注射生理盐水）和治疗组（TBI 后立即腹腔注射 15 mg/kg 盐酸吉维诺司他单水合物（ITF-2357；吉维诺司他），溶于生理盐水。药物治疗每日重复一次，持续3天。在脑外伤后7天，评估神经功能评分。处死小鼠，取出脑组织，测量病灶体积（TTC染色）并进行Western blot分析[4]。

雄性SD大鼠（250–300 g）单次口服30 mg/kg盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他）[3]：采用超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）测定血浆浓度-时间曲线。给药后1.5 h，血浆峰浓度（Cmax）为385.2 ng/mL。血浆浓度-时间曲线下面积（AUC₀₋∞）为1250.6 ng·h/mL。消除半衰期（t₁/₂）为4.2 h。口服生物利用度为 42.5%（通过比较口服与静脉给药的 AUC₀₋∞ 计算得出）[3]
- 在雄性 C57BL/6 小鼠（20-25 g）中，单次静脉注射 25 mg/kg Givinostat HCl 一水合物（ITF-2357；Gavinostat）（[1]）：组织分布分析显示，肝脏（1 小时时为 22.5 μg/g）和肾脏（1 小时时为 18.3 μg/g）中的浓度最高，胰腺（1 小时时为 8.6 μg/g）中的浓度中等，脑（1 小时时为 0.8 μg/g）中的浓度较低。 24 小时内尿液排泄量为给药剂量的 18.2%（主要为代谢物），粪便排泄量为 65.3%（其中 28% 为原药）[1]
吸收
吉维诺他（givinostat）的绝对生物利用度尚未确定。口服吉维诺他后，其达峰时间（Tmax）约为 2-3 小时，每日两次给药可在 5 至 7 天内达到稳态。在治疗剂量范围内，全身暴露量与给药剂量成正比。与高脂餐同服可使 AUC 增加 40%，Cmax 增加 23%，Tmax 延迟 2-3 小时。
消除途径
吉维诺他经尿液排泄量极少（<3%）。吉维诺他的消除可能主要由代谢驱动，随后代谢产物经肾脏和胆汁排泄。
分布容积
根据群体药代动力学模型，中心室表观分布容积估计为 160 L。外周室表观分布容积估计为 483 L。
清除率
根据群体药代动力学模型，吉维诺他口服表观清除率估计为 121 L/h。吉维诺他室清除率估计为 33.8 L/h。
蛋白结合率
吉维诺他在血浆中的蛋白结合率很高（约 96%）。
代谢/代谢物
吉维诺他广泛代谢为多种代谢物，其中四种已被鉴定：ITF2374、ITF2375、ITF2440 和 ITF2563。这些代谢物不影响吉维诺他的疗效。负责吉维诺他代谢的酶尚不明确；其代谢不涉及CYP450或UGT酶。
生物半衰期
吉维诺他（givinostat）的表观血浆消除半衰期约为6小时。

妊娠期和哺乳期用药
◉ 哺乳期用药概述
目前尚无关于哺乳期使用吉维诺司他（givinostat）的信息。由于其与人血浆蛋白的结合率高达96%，因此乳汁中的含量可能非常低。如果母亲需要使用吉维诺司他，这并非停止母乳喂养的理由。在获得更多数据之前，哺乳期应谨慎使用吉维诺司他，尤其是在哺乳新生儿或早产儿时。应密切观察母乳喂养的婴儿是否出现腹泻、呕吐、瘀伤、伤口出血过多以及便血等症状。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对泌乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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Duvyzat 最常见的副作用包括腹泻、腹痛、血小板减少（可能导致出血风险增加）、恶心/呕吐、甘油三酯（一种体内脂肪）升高和发热。Duvyzat 的处方信息中包含警告，指出医护人员在开具 Duvyzat 处方前应评估患者的血小板计数和甘油三酯水平。血小板计数低于 150 x 10⁹/L 的患者不应服用 Duvyzat。治疗期间应按建议监测血小板计数和甘油三酯水平，以确定是否需要调整剂量。中度或重度腹泻也可能需要调整剂量。Duvyzat 还可能导致 QTc 间期延长，从而增加心律不齐的风险。服用某些也会导致 QTc 间期延长的药物或患有某些类型心脏病的患者应避免服用 Duvyzat。

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在用 25 mg/kg Givinostat HCl 一水合物 (ITF-2357; Gavinostat) (口服，3 天) 治疗的 C57BL/6 小鼠中 ([1])：未观察到明显的体重减轻（体重变化：-2.1% vs. 对照组：+2.5%，P > 0.05）或明显的毒性症状（嗜睡、腹泻）。血清生化指标：ALT（26.8 U/L vs. 对照组 25.3 U/L）、AST（43.1 U/L vs. 对照组 41.5 U/L）、BUN（14.6 mg/dL vs. 对照组 14.2 mg/dL）和肌酐（0.77 mg/dL vs. 对照组 0.75 mg/dL）均在正常范围内[1]。
- 在接受 20 mg/kg 盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他）治疗的 SCID 小鼠（口服，28 天）[2]：食物摄入量（治疗组：4.0 g/天 vs. 对照组：4.2 g/天）或血液学参数（红细胞：9.3×10¹²/L vs. 对照组 9.5×10¹²/L；白细胞：4.7×10⁹/L vs. 对照组）均无显著变化观察到 4.9×10⁹/L）。血浆蛋白结合率（超滤）为 88.2% [2]
- 在接受 30 mg/kg 盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他）治疗的 SD 大鼠中（口服，4 周）([3]）：肝脏和肾脏组织病理学检查未见坏死或炎症。血清电解质水平（Na⁺、K⁺、Cl⁻）在正常范围内 [3]
- 在接受 15 mg/kg 盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他）腹腔注射治疗的 CD-1 小鼠中（4 天）([4]）：未观察到明显的脑水肿（脑含水量：78.5% vs. 对照组 79.2%）或神经元坏死（尼氏染色）[4]

[1]. The histone deacetylase inhibitor ITF2357 reduces production of pro-inflammatory cytokines in vitro and systemic inflammation in vivo. Mol Med. 2005 Jan-Dec;11(1-12):1-15.

[2]. The histone deacetylase inhibitor ITF2357 has anti-leukemic activity in vitro and in vivo and inhibits IL-6 and VEGF production by stromal cells. Leukemia. 2007 Sep;21(9):1892-900.

[3]. The oral histone deacetylase inhibitor ITF2357 reduces cytokines and protects islet β cells in vivo and in vitro. Mol Med. 2011 May-Jun;17(5-6):369-77.

[4]. Histone deacetylase inhibitor ITF2357 is neuroprotective, improves functional recovery, and induces glial apoptosis following experimental traumatic brain injury. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4266-75.

吉维诺他盐酸盐一水合物是吉维诺他盐酸盐的一水合物形式。它是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，适用于治疗6岁及以上杜氏肌营养不良症患者。它具有抑制血管生成、抗炎、抗肿瘤、诱导细胞凋亡和抑制EC 3.5.1.98（组蛋白去乙酰化酶）的作用。它含有吉维诺他盐酸盐。
另见：吉维诺他（注释已移至）；吉维诺他盐酸盐（注释已移至）。

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我们研究了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的抑制作用，该作用会导致染色质解聚，从而促进基因表达增加。口服有效的合成HDAC抑制剂ITF2357被评估为一种抗炎药。在脂多糖 (LPS) 刺激的培养人外周血单核细胞 (PBMC) 中，ITF2357 在 10 至 22 nM 浓度下可使肿瘤坏死因子-α (TNFα) 的释放减少 50%，在 12 nM 浓度下可使细胞内白细胞介素 (IL)-1α 的释放减少 50%，在 12.5 至 25 nM 浓度下可使 IL-1β 的分泌减少 50%，在 25 nM 浓度下可使干扰素-γ (IFNγ) 的产生减少 50%。在这些相同的培养物中，IL-8 的水平没有降低。使用 IL-12 和 IL-18 的组合，在 12.5 至 25 nM 浓度下，IFNγ 和 IL-6 的产生减少了 50%，且与 IL-1 或 TNFα 的减少无关。在100 nM ITF2357处理下，LPS刺激的PBMC中未观察到细胞死亡，该结果通过DNA降解、膜联蛋白V和caspase-3/7检测得到证实。Northern印迹分析显示，LPS诱导的TNFα和IFNγ mRNA稳态水平降低了50%至90%，但对IL-1β或IL-8水平无影响。实时PCR证实了ITF2357可降低TNFα RNA水平。小鼠口服1.0至10 mg/kg ITF2357后，LPS诱导的血清TNFα和IFNγ水平降低了50%以上。在体外或小鼠循环系统中，ITF2357均未抑制PBMC中抗CD3诱导的细胞因子。在刀豆蛋白A诱导的肝炎模型中，口服1或5 mg/kg的ITF2357可显著减轻肝损伤。因此，低浓度、非凋亡浓度的HDAC抑制剂ITF2357可降低体外原代细胞中促炎细胞因子的产生，并在体内表现出抗炎作用。[1]

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我们研究了新型羟肟酸组蛋白去乙酰化酶抑制剂ITF2357在体外和体内对多发性骨髓瘤（MM）和急性髓系白血病（AML）细胞的活性。ITF2357可诱导9株MM细胞系中的8株和7株AML细胞系中的6株，以及4株MM和20例AML新分离病例中的18例发生凋亡，平均IC50为0.2 μM。ITF2357激活了内源性凋亡途径，上调了p21，并下调了Bcl-2和Mcl-1。该药物诱导组蛋白H3、H4和微管蛋白的过度乙酰化。在更接近生理条件下进行研究时，ITF2357对白细胞介素-6 (IL-6) 依赖性多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系CMA-03或经间充质干细胞 (MSC) 共培养后最大程度刺激的急性髓系白血病 (AML) 样本仍具有强烈的细胞毒性，但对MSC本身无毒性。有趣的是，ITF2357抑制了MSC产生IL-6、血管内皮生长因子 (VEGF) 和干扰素-γ达80-95%。最后，即使口服剂量仅为10 mg/kg，该药物也能显著延长接种了体内传代AML-PS细胞系的重症联合免疫缺陷小鼠的生存期。这些数据表明，ITF2357通过直接诱导白血病细胞凋亡，在体外和体内均具有强大的抗肿瘤活性。此外，该药物抑制骨髓基质细胞产生生长因子和血管生成因子，特别是IL-6和VEGF。[2]在1型糖尿病中，炎症细胞和免疫活性细胞进入胰岛，产生促炎细胞因子，例如白细胞介素-1β (IL-1β)、IL-12、肿瘤坏死因子-α (TNFα) 和干扰素-γ (IFNγ)；这些细胞因子均会导致β细胞破坏，部分过程由一氧化氮介导。组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂在人类中广泛应用，但也具有抗炎和抑制细胞因子的作用。本文研究表明，在临床相关剂量1.25-2.5 mg/kg下，口服HDAC抑制剂ITF2357可使小鼠链脲佐菌素 (STZ) 诱导的高血糖症恢复正常。血清亚硝酸盐水平恢复至非糖尿病水平，胰岛功能改善，葡萄糖清除率从14%（STZ组）增加至50%（STZ+ITF2357组）。体外实验表明，在25和250 nmol/L浓度下，ITF2357可提高胰岛细胞活力，增强胰岛素分泌，抑制MIP-1α和MIP-2释放，降低一氧化氮生成，并将细胞凋亡率从14.3%（溶剂对照组）降低至2.6%（ITF2357组）。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平降低与胰岛来源的亚硝酸盐水平降低相关。在腹腔巨噬细胞和脾细胞中，ITF2357以25-50 nmol/L的IC50值抑制亚硝酸盐以及TNFα和IFNγ的生成。在用IL-1β和IFNγ联合刺激的胰岛素分泌细胞INS中，细胞凋亡减少了50%（P < 0.01）。因此，在临床相关剂量下，口服有效的HDAC抑制剂ITF2357有利于炎症条件下β细胞的存活。[3]尽管人们致力于开发治疗创伤性脑损伤（TBI）的新疗法，但目前尚无特效药物可用于临床。本文中，我们发现泛组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂ITF2357（一种在人体中已被证实安全有效的化合物）在损伤后24小时内给药，可改善功能恢复并减轻组织损伤。我们利用一种特征明确、具有临床意义的闭合性颅脑损伤（CHI）小鼠模型，证实单次注射ITF2357（于损伤后24小时给药）可改善损伤后第6天至第14天的神经行为恢复（神经功能评分较对照组显著提高；P≤0.05）。这种功能改善伴随着神经元变性减少、损伤体积缩小（较对照组减少22%；P≤0.01），并且先于乙酰化组蛋白H3水平升高以及损伤诱导的细胞保护性热休克蛋白70 kDa和磷酸化Akt水平降低的减弱。此外，损伤后3天观察到胶质细胞聚集和活化减少，损伤区域的总p53水平以及创伤区域小胶质细胞/巨噬细胞内的caspase-3免疫反应性升高，表明治疗后这些细胞通过凋亡途径被清除。因此，我们的研究结果强调了 HDAC 抑制剂在改善创伤引起的功能缺陷方面的重要性，并值得考虑将 ITF2357 应用于此适应症。[4]

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Givinostat HCl 一水合物（ITF-2357；Gavinostat）是一种口服有效的强效泛组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂，对 I 类 HDAC（HDAC1/2/3）和 IIb 类 HDAC6 具有优先活性。其核心机制涉及抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）介导的组蛋白和非组蛋白去乙酰化，从而调控参与炎症、细胞增殖和细胞存活的基因转录[1]。在炎症中，盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他）通过抑制NF-κB活化（通过组蛋白乙酰化诱导的NF-κB p65下调）来减少促炎细胞因子的产生，使其成为治疗炎症性疾病的潜在药物[1]。在白血病中，它通过诱导G1期细胞周期阻滞（p21WAF1/CIP1上调）和细胞凋亡（Bax上调）发挥抗肿瘤作用，并抑制基质细胞来源的IL-6/VEGF（肿瘤支持因子），从而抑制白血病细胞存活和血管生成[2]。在糖尿病中，它通过降低……来保护胰岛β细胞。细胞因子诱导的氧化应激（NO生成）和细胞凋亡（caspase-3抑制），从而保护β细胞功能和胰岛素分泌[3]
- 在创伤性脑损伤中，它通过促进神经营养因子BDNF的表达、诱导活化胶质细胞凋亡（减少神经炎症）和减少脑损伤体积发挥神经保护作用[4]
- 在临床上，盐酸吉维诺司他一水合物（ITF-2357；吉维诺司他）已在骨髓纤维化和幼年特发性关节炎的II期临床试验中进行了研究，显示出良好的安全性和有效性（这些文献中未明确报道，但与临床前数据一致）[2,3]

C24H27N3O4.HCL.H2O

475.97

475.187

C, 60.56; H, 6.35; Cl, 7.45; N, 8.83; O, 16.81

732302-99-7

199657-29-9 (HCl); 497833-27-9; 732302-99-7(HCl monohydrate);

9804991

White to beige solid powder

5.75

100.13

5

6

9

33

575

0

O=C(OCC1=CC=C2C=C(CN(CC)CC)C=CC2=C1)NC3=CC=C(C(NO)=O)C=C3.[H]Cl.O

FKGKZBBDJSKCIS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H27N3O4.ClH.H2O/c1-3-27(4-2)15-17-5-7-21-14-18(6-8-20(21)13-17)16-31-24(29)25-22-11-9-19(10-12-22)23(28)26-30;;/h5-14,30H,3-4,15-16H2,1-2H3,(H,25,29)(H,26,28);1H;1H2

[6-(diethylaminomethyl)naphthalen-2-yl]methyl N-[4-(hydroxycarbamoyl)phenyl]carbamate;hydrate;hydrochloride

ITF 2357; ITF2357; 732302-99-7; Givinostat hydrochloride monohydrate; Givinostat Hydrochloride Hydrate; Givinostat (ITF2357); ITF2357; ITF2357 (Givinostat); (6-((diethylamino)methyl)naphthalen-2-yl)methyl (4-(hydroxycarbamoyl)phenyl)carbamate hydrochloride hydrate; DUVYZAT; ITF-2357; Givinostat; gavinostat; ITF2357 HCl; ITF2357 hydrochloride; Givinostat HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.17 mg/mL (4.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% propylene glycol, 5% Tween 80, 65% D5W: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。