Golvatinib (E7050)   中文名称: 戈伐替尼

VEGFR2 (IC50 = 16 nM); c-Met (IC50 = 14 nM)
Golvatinib (E7050) inhibits c-Met tyrosine kinase (IC₅₀ = 1.3 nM) and VEGFR2 tyrosine kinase (IC₅₀ = 1.8 nM) [1]
Golvatinib (E7050) also shows inhibitory activity against Axl (IC₅₀ = 4.7 nM) and Ron (IC₅₀ = 8.6 nM) tyrosine kinases [2]

体外研究表明 E7050 有效抑制 c-Met 和 VEGFR-2 的磷酸化。 E7050 还可有效抑制 c-met 扩增的肿瘤细胞和 HGF 或 VEGF 刺激的内皮细胞的生长。 E7050 通过在体外阻断 Met/Gab1/PI3K/Akt 通路，规避 EGFR 突变型肺癌细胞系中外源和/或内源性 HGF 诱导的所有可逆、不可逆和突变选择性 EGFR-TKI 的耐药性。 E7050 还可以防止因持续暴露于 HGF 而诱导的吉非替尼耐药 HCC827 细胞的出现。激酶测定：通过蛋白质印迹分析检测c-Met和VEGFR-2的磷酸化状态。对于 c-Met，将 MKN45 细胞与 E7050 的系列稀释液在完全培养基中于 37°C 孵育 2 小时。对于 VEGFR-2，HUVEC 用含有 0.5% FBS 的人内皮无血清培养基饥饿 24 小时。随后将 HUVEC 与连续稀释的 E7050 一起孵育 1 小时，然后与 20 ng/mL 人 VEGF 一起孵育 5 分钟。用裂解缓冲液（50 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、10% 甘油、1% Triton X-100、1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA [pH 8.0]、100 mM NaF、1 mM 苯甲基磺酰氟裂解细胞1 mM 原钒酸钠、10 μg/mL 抑肽酶、50 μg/mL 亮肽素和 1 μg/mL 胃酶抑素 A)。将切除的肿瘤样品用含有 25 mM β-甘油磷酸盐和 0.5% (v/v) 磷酸酶抑制剂混合物 2 的裂解缓冲液在 4 °C 下匀浆。通过在 4 °C 下以 17 860g 离心 20 分钟去除细胞碎片。将含有 5-20 μg 蛋白质的上清液等分试样在还原条件下进行 SDS-PAGE。然后将蛋白质转移到 PVDF 膜上，用含有 0.05% Tween-20 和 5% 脱脂牛奶或 5% BSA 的 TBS 封闭。用以下抗体探测膜：抗c-Met多克隆抗体(C-28)和抗VEGFR-2多克隆抗体(C-20)；小鼠抗磷酸酪氨酸克隆4G10；抗VEGFR-2多克隆抗体、抗磷酸VEGFR-2(Tyr996)多克隆抗体、抗磷酸c-Met(Tyr1234/1235)多克隆抗体。使用 Super Signal 增强化学发光试剂盒进行检测。使用 Image Master-VDS-CL 检测系统通过化学发光使免疫反应条带可视化。使用图像分析仪测量每个条带的强度。细胞测定：将细胞（1–3 × 103 个细胞/100 μL/孔、MKN45、EBC-1、Hs746T、SNU-5、A549、SNU-1 和 MKN74）接种在含有不同浓度 E7050 的 96 孔培养板上并培养3天。然后，向每个孔中添加 10 μL WST-8 试剂，并使用 MTP-500 酶标仪在 450 nm 处测量吸光度，与 660 nm 处的参考测量值进行比较。 HUVEC（2 × 103 细胞/孔）在含有 HGF (30 ng/mL)、VEGF (20 ng/mL) 或碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) (20 ng/mL) 的培养基中连续培养 3 天稀释的E7050。

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戈伐替尼（E7050）剂量依赖性抑制c-Met过表达的胃癌细胞系（MKN-45和SNU-5）增殖，IC₅₀分别为12nM和15nM。浓度≥20nM时，可阻断这些细胞中c-Met磷酸化及下游信号（Akt和ERK1/2），50nM时可诱导G1期细胞周期阻滞和凋亡[1]
戈伐替尼（E7050）抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖和管腔形成，IC₅₀分别为22nM和18nM。30nM时，可抑制Axl介导的肺癌细胞（A549）迁移约70%[2]
戈伐替尼（E7050）在体外增强结直肠癌细胞（HT-29）对5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性。10nM戈伐替尼与5μM 5-FU联合处理，相比单独使用5-FU，细胞凋亡增加约40%[3]

使用 E7050 进行的体内研究显示，它可以抑制肿瘤中 c-Met 和 VEGFR-2 的磷酸化，并在异种移植模型中强烈抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成。用高剂量 E7050（50-200 mg/kg）治疗一些含有 c-met 扩增的肿瘤系可诱导肿瘤消退和消失。在腹膜传播模型中，E7050 显示出对腹膜肿瘤的抗肿瘤作用，并显着延长治疗小鼠的寿命。在另一项异种移植模型研究中，由 HGF 转染的 Ma-1 (Ma-1/HGF) 细胞产生的肿瘤比载体对照肿瘤更具血管生成性，并且显示出对 ZD1839 的抗性。 E7050 单独抑制血管生成并延缓 Ma-1/HGF 肿瘤的生长。 E7050 与 ZD1839 联合诱导肿瘤生长显着消退。

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戈伐替尼（E7050）以30mg/kg/天的剂量口服给药21天，可抑制裸鼠MKN-45胃癌异种移植瘤的生长。与对照组相比，肿瘤体积减少约65%，瘤内c-Met磷酸化水平显著下调[1]
戈伐替尼（E7050）抑制裸鼠A549肺癌异种移植瘤的血管生成和转移。口服50mg/kg/天，持续28天，微血管密度减少约60%，肺转移结节减少约75%[2]
戈伐替尼（E7050）与5-FU联合使用，在携带CT26结直肠癌异种移植瘤的BALB/c小鼠中显著提高抗肿瘤疗效。口服戈伐替尼（20mg/kg/天）联合腹腔注射5-FU（50mg/kg/周），持续3周，相比单独使用任一药物，肿瘤重量减少约80%[3]

Western blot分析用于检测VEGFR-2和c-Met的磷酸化状态。将 MKN45 细胞与 E7050 的系列稀释液在完全培养基中于 37 °C 孵育两小时，以检测 c-Met。将 HUVEC 用含有 0.5% FBS 的人内皮血清培养基饥饿 24 小时，以测试 VEGFR-2。下一步是将 HUVEC 与连续稀释的 E7050 一起孵育 1 小时，并与 20 ng/mL 人 VEGF 一起孵育 5 分钟。裂解缓冲液（50 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、10% 甘油、1% Triton X-100、1.5 mM MgCl₂、1 mM EDTA [pH 8.0]、100 mM NaF、和 1 mM 苯甲基磺酰氟）用于裂解细胞。 1 mM 原钒酸钠、10 μg/mL 抑肽酶、50 μg/mL 亮肽素和 1 μg/mL 胃酶抑素 A)。使用含有 0.5% (v/v) 磷酸酶抑制剂混合物 2 和 25 mM β-甘油磷酸盐的裂解缓冲液在 4 °C 下对已取出的肿瘤样本进行均质化。在 4 °C 下以 17 860 g 离心 20 分钟可去除细胞碎片。含有 5-20 μg 蛋白质的上清液等分试样在 SDS-PAGE 上通过还原条件。之后，将蛋白质置于 PVDF 膜上，并用含有 0.05% Tween-20 和 5% BSA 或 5% 脱脂牛奶的 TBS 封闭。以下抗体用于探测膜：小鼠抗磷酸酪氨酸克隆 4G10；抗c-Met多克隆抗体(C-28)和抗VEGFR-2多克隆抗体(C-20)；抗磷酸-VEGFR-2 (Tyr996) 多克隆抗体和抗磷酸-c-Met (Tyr1234/1235) 多克隆抗体。使用 Super Signal 的增强型化学发光试剂盒完成检测。使用称为 Image Master-VDS-CL 的化学发光检测系统来观察免疫反应带。使用图像分析仪确定每个条带的强度。

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将重组c-Met、VEGFR2、Axl和Ron激酶结构域分别与ATP及特异性多肽底物在系列稀释的戈伐替尼（E7050）存在下孵育，反应在37°C下进行60分钟，采用均相时间分辨荧光（HTRF）法检测磷酸化底物。通过与溶媒对照组的荧光强度对比计算抑制率，从量效曲线中得出IC₅₀值[1]
采用比色法进一步验证VEGFR2激酶活性。将重组VEGFR2与戈伐替尼、ATP和显色底物孵育，45分钟后终止反应，通过测量吸光度定量磷酸化水平，确定IC₅₀以验证与HTRF结果的一致性[2]

在 96 孔培养板上，将细胞（1–3 × 10 3 细胞/100 μL/孔）接种到不同浓度的 E7050 中并培养三天。向每个孔中添加 10 μL WST-8 试剂后，使用 MTP-500 酶标仪测量 450 nm 处的吸光度，并将其与 660 nm 处的参考测量值进行比较。将 HUVEC（2 × 10 3 细胞/孔）在含有连续稀释的 E7050 以及 HGF (30 ng/mL)、VEGF (20 ng/mL) 或碱性的培养基中培养三天。成纤维细胞生长因子 (bFGF) (20 ng/mL)。

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将MKN-45和SNU-5细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔板中，用戈伐替尼（E7050）（1-100nM）处理72小时，采用四唑盐法检测细胞活性并计算IC₅₀值。蛋白质印迹分析中，用10-50nM戈伐替尼处理细胞24小时，裂解后与抗磷酸化c-Met、Akt、ERK1/2和GAPDH的抗体孵育。采用碘化丙啶和Annexin V-FITC染色，通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡[1]
将HUVECs接种到96孔板或基质胶包被的孔中，用戈伐替尼（E7050）（5-50nM）预处理1小时后，用VEGF刺激细胞。72小时后检测增殖情况，12小时后计数管腔形成数量。采用Boyden小室评估A549细胞迁移，用10-30nM戈伐替尼处理，6小时后计数迁移细胞[2]
用戈伐替尼（E7050）（5-20nM）单独或与5-FU（5μM）联合处理HT-29细胞48小时，采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测凋亡，通过蛋白质印迹法分析凋亡标志物（切割型caspase-3）的表达[3]

小鼠：将携带 MKN45、Hs746T、SNU-5 或 EBC-1 肿瘤的裸鼠每日一次分别给予戈伐替尼（25、50、100 或 200 mg/kg）或载体作为对照。在指定日期（0-15 天），用游标卡尺测量肿瘤体积。携带 MKN-45 胃癌异种移植瘤（100-150 mm³）的裸鼠随机分为对照组和治疗组。戈伐替尼 (E7050) 悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素溶液中，以 30 mg/kg/天的剂量口服给药，持续 21 天。每3天测量一次肿瘤体积，处死小鼠并收集肿瘤组织进行c-Met磷酸化Western blot分析[1]。
携带A549肺癌异种移植瘤的裸鼠接受戈伐替尼（E7050）口服治疗，剂量为50 mg/kg/天，持续28天。收集肿瘤组织进行CD31免疫染色以评估微血管密度。取出肺组织，在显微镜下计数转移结节[2]。
携带CT26结直肠癌异种移植瘤的BALB/c小鼠被分为四组：对照组、戈伐替尼单药治疗组（口服，20 mg/kg/天）、5-氟尿嘧啶单药治疗组（腹腔注射，50 mg/kg/周）和联合治疗组。治疗持续3周，并在研究结束时测量肿瘤重量。对肿瘤组织进行TUNEL检测以评估细胞凋亡[3]

在小鼠中，单次口服30 mg/kg戈伐替尼（E7050）的生物利用度约为55%。血浆半衰期约为6.8小时，给药后2小时达到最大血浆浓度（Cmax），为3.2 μg/mL [1]。在大鼠中，口服50 mg/kg戈伐替尼（E7050）后，24小时AUC₀为28.6 μg·h/mL，且该药物广泛分布于肝脏、肾脏和肿瘤组织中 [2]。

小鼠以 30 mg/kg/天的剂量接受戈伐替尼 (E7050) 治疗 21 天后，体重略有下降（约 8%），但未见明显的器官毒性。血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 和肌酐水平均在正常范围内 [1]。大鼠以 50 mg/kg/天的剂量接受戈伐替尼 (E7050) 治疗 28 天后，未见明显的血液学异常，但 15% 的动物出现轻度胃肠道刺激（厌食）[2]。通过平衡透析法测定，戈伐替尼 (E7050) 在人血浆中的血浆蛋白结合率约为 94% [3]。

[1]. Cancer Sci . 2010 Jan;101(1):210-5.

[2]. Clin Cancer Res . 2012 Mar 15;18(6):1663-71.

[3]. Am J Pathol . 2012 Sep;181(3):1034-43.

戈伐替尼是一种芳香醚。
戈伐替尼已被研究用于治疗铂类耐药的头颈部鳞状细胞癌。
戈伐替尼是一种口服生物利用度高的双重激酶抑制剂，可抑制c-Met（肝细胞生长因子受体）和VEGFR-2（血管内皮生长因子受体-2）酪氨酸激酶，具有潜在的抗肿瘤活性。c-Met/VEGFR激酶抑制剂E7050可结合并抑制c-Met和VEGFR-2的活性，从而抑制过度表达这些受体酪氨酸激酶的肿瘤细胞的生长和存活。 c-Met 和 VEGFR-2 在多种肿瘤细胞类型中表达上调，并在肿瘤细胞的生长、迁移和血管生成中发挥重要作用。

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戈伐替尼 (E7050) 是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，它通过阻断 c-Met 和 VEGFR2 信号通路发挥抗肿瘤作用，抑制肿瘤细胞增殖和血管生成 [1]
戈伐替尼 (E7050) 抑制 Axl 和 Ron 激酶的能力表明其对 Axl/Ron 信号通路失调的肿瘤（例如肺癌和乳腺癌）具有潜在疗效 [2]
戈伐替尼 (E7050) 与 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 等传统化疗药物联合使用可能产生协同抗肿瘤作用，为晚期结直肠癌提供了一种有前景的治疗策略 [3]

C33H37F2N7O4

633.69

633.287

C, 62.55; H, 5.89; F, 6.00; N, 15.47; O, 10.10

928037-13-2

16118392

white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

867.5±65.0 °C at 760 mmHg

478.5±34.3 °C

0.0±3.3 mmHg at 25°C

1.671

2.03

126.12

3

9

8

46

1060

0

O=C(N1CCC(N2CCN(C)CC2)CC1)NC1C=C(OC2C=C(F)C(NC(C3(CC3)C(NC3C=CC(F)=CC=3)=O)=O)=CC=2)C=CN=1

UQRCJCNVNUFYDX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C33H37F2N7O4/c1-40-16-18-41(19-17-40)24-9-14-42(15-10-24)32(45)39-29-21-26(8-13-36-29)46-25-6-7-28(27(35)20-25)38-31(44)33(11-12-33)30(43)37-23-4-2-22(34)3-5-23/h2-8,13,20-21,24H,9-12,14-19H2,1H3,(H,37,43)(H,38,44)(H,36,39,45)

1-N'-[2-fluoro-4-[2-[[4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidine-1-carbonyl]amino]pyridin-4-yl]oxyphenyl]-1-N-(4-fluorophenyl)cyclopropane-1,1-dicarboxamide

E 7050; Golvatinib; E7050; E-7050

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.28 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.28 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.28 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% propylene glycol, 5% Tween 80, 65% D5W: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。