RIP1 kinase (IC50 = 29 nM)
GSK-963 targets receptor-interacting protein 1 (RIP1) kinase (IC₅₀ = 1–4 nM for inhibiting RIP1-dependent cell death in human and murine cells; >10,000-fold selective for RIP1 over 339 other human kinases at 10 μM; no measurable activity against indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO)) [1]

GSK-963 抑制人和小鼠细胞中 RIP1 依赖性细胞死亡，IC50 范围为 1 至 4 nM[1]。
GSK′963在生化检测中是RIP1激酶的强效选择性抑制剂。 GSK′963是一种选择性强的小鼠和人类细胞体外坏死性下垂抑制剂。

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1. GSK-963在荧光偏振（FP）结合实验中对RIP1的ATP结合口袋表现出极强的结合亲和力，远高于坏死抑制剂1（Nec-1）；在ADP-Glo激酶实验中，其可在体外强效抑制RIP1激酶域的自磷酸化，效能显著优于Nec-1 [1]
2. 在基于细胞的坏死性凋亡实验中，GSK-963以1–4 nM的IC₅₀抑制TNF + zVAD诱导的小鼠纤维肉瘤L929细胞、人单核细胞U937、原代小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的坏死性凋亡；在原代人中性粒细胞中（用TNF + zVAD + SMAC模拟物诱导坏死性凋亡），其抑制活性的IC₅₀同样为1–4 nM；而其非活性对映体GSK-962在相同浓度下无抑制作用 [1]
3. GSK-963（100 nM）对TNF + 环己酰亚胺处理的BMDM中caspase 3/7的活性无影响（该模型用于诱导细胞凋亡），也不抑制TNF诱导的BMDM中IκB的磷酸化（5分钟时）和降解（15分钟时），表明其不干扰凋亡信号通路或NF-κB的激活 [1]
4. GSK-963在体外酶活实验中对IDO无抑制活性（以甲萘醌为IDO抑制的阳性对照）；在10 μM浓度下，对339种测试的人类激酶均无抑制作用 [1]

GSK-963 是 TNF+zVAD 引起的致命性休克的强效抑制剂。与 Nec-1 相比，GSK-963 在 2 mg/kg 剂量下可在较长时间内将血液浓度维持在抑制 RIP1 活性 90% 所需的水平之上。

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GSK′963是TNF+zVAD介导的致死性休克的强效抑制剂：研究人员评估了GSK′965和Nec-1在体内腹腔注射后的药代动力学特征。尽管GSK′963的表观半衰期大于Nec-1（图3a；补充图1a），但Nec-1在10mg/kg时的暴露量比葛兰素史克′963高出约10倍。然而，基于小鼠药代动力学特征（图3a；补充图1a）和TNF+zVAD处理的L929细胞中的化合物效力（图2a）对这两种化合物的药效学建模表明，与Nec-1相比，在2 mg/kg的剂量下，GSK′963将在较长一段时间内将血液浓度维持在90%抑制RIP1活性所需的浓度以上（图3b；补充图1b）。为了直接在体内测试GSK′963的疗效，我们使用了无菌休克的急性模型。给予TNF+zVAD会导致致命的低体温，此前已被证明这取决于RIP1激酶活性。5,18用2 mg/kg GSK′963治疗动物可完全保护动物免受TNF+zVASD诱导的体温下降，0.2 mg/kg剂量也显示出显著的反应（图3c）。正如预期的那样，GSK′962对TNF+zVAD诱导的休克没有影响，证实GSK′963通过抑制RIP1激酶选择性地起作用（图3d）。有趣的是，Nec-1在0.2 mg/kg的剂量下对模型没有影响，该剂量在文献中通常用于在体内抑制RIP1，并且在高10倍的剂量下显示出最低水平的保护作用（图3e）。这些结果共同表明，与Nec-1相比，GSK′963是探索体内急性RIP1激酶生物学的更好工具分子[1]。

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1. 在TNF + zVAD诱导的小鼠无菌休克模型中，C57BL/6小鼠腹腔预处理GSK-963（0.2 mg/kg或2 mg/kg）15分钟后，再静脉注射TNF + zVAD，可在3小时的监测期内显著保护小鼠免于体温降低；该保护作用呈剂量依赖性，且效果远优于同剂量（0.2 mg/kg和2 mg/kg）的Nec-1 [1]
2. GSK-963的非活性对映体GSK-962即使在20 mg/kg的高剂量下（腹腔注射），也无法对TNF + zVAD诱导的体温降低产生保护作用，证实了GSK-963对RIP1的靶点特异性作用 [1]
3. 药代动力学建模显示，C57BL/6小鼠腹腔注射10 mg/kg GSK-963后产生的血浆药物暴露量，足以在0.2 mg/kg和2 mg/kg剂量下实现对RIP1的有效抑制（基于其在L929细胞中的效能数据）[1]

使用 ADP-Glo 发光测定法测定化合物对抗 RIP1 激酶活性的效力，该测定法测量 ATP 到 ADP 的转化，如前所述。简而言之，主要反应由 50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% 中的 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP 组成章节。将 5 微升酶和 5 μl ATP 以最终测定浓度的两倍添加到板中，并在室温下孵育 4 小时。在读板器上测量发光。测试化合物抑制表示为内部测定对照的抑制百分比。

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荧光偏振（FP）结合分析[1]
如前所述，开发了一种基于FP的结合测定法，通过与荧光标记的ATP竞争配体竞争，定量RIP1 ATP结合袋处新型测试化合物的相互作用。18简而言之，GST-RipK1（1-375）被纯化，并以10nM的最终测定浓度使用。使用荧光标记配体（14-（2-{[3-（{2-{[4-（氰甲基）苯基]氨基}-6-[（5-环丙基-1H-吡唑-3-基）氨基]-4-嘧啶基}氨基）丙基]氨基}-2-氧乙基）-16,16,18,18-四甲基-6,7,7a，8a，9,10,16,18-八氢苯并[2“，3”]中氮茚并[8“，7”：5ʹ，6ʹ;]吡喃并[3，2ʹ:3,4]吡啶并[1,2-A]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐，最终测定浓度为5nM。样本在Analyst多模式阅读器上读取。试验化合物抑制率表示为内部试验对照的抑制百分比（%）。

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ADP-Glo激酶测定[1]
使用ADP-Glo发光测定法测定化合物对RIP1激酶活性的效力，该测定法测量ATP向ADP的转化，如前所述。18简而言之，主要反应由10 nM GST-RIPK1（1-375）和50μM ATP在50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA和0.02%CHAPS中组成。将5微升酶和5μl ATP以最终测定浓度的两倍加入平板中，在室温下孵育4小时。在平板读数器上测量发光。试验化合物抑制率表示为内部测定对照的抑制百分比。

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激酶选择性[1]
在Reaction Corp Biology使用P33放射性标记测定法对GSK′963进行了抗339种激酶的测试(http://www.reactionbiology.com). 该化合物在10μM下以单次剂量进行了两次测试。反应在10μM ATP下进行。数据以酶活性百分比报告（相对于DMSO对照）。完整数据集见补充表一。

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IDO酶法测定[1]
如Takahashi等人25所述，使用购自R&D Systems的重组人IDO测定IDO活性。使用Spectramax酶标仪在490 nm下测量犬尿氨酸衍生的黄色色素。

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半胱天冬酶3/7测定[1]
为了诱导细胞凋亡，用GSK′963（100 nM）、GSK′962（100 nM）或Nec-1（10μM）预处理30分钟的BMDM用TNF（50 ng/ml）和CHX（12μg/ml）刺激。使用Caspase-Glo 3/7测定法在6小时时测量Caspase 3/7活性。

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1. 荧光偏振（FP）结合实验：将重组RIP1蛋白与系列浓度的GSK-963、GSK-962及Nec-1共同孵育，评估化合物与RIP1的ATP结合口袋的结合亲和力。检测荧光偏振信号并绘制剂量-响应曲线（GSK-963 n=7、GSK-962 n=4、Nec-1 n=52），比较各化合物的结合效能 [1]
2. ADP-Glo激酶实验：将重组RIP1激酶域与不同浓度的GSK-963、GSK-962或Nec-1在ATP存在下孵育，评估对RIP1自磷酸化的抑制作用。孵育后加入ADP-Glo试剂检测生成的ADP量（激酶活性的标志物），绘制剂量-响应曲线（GSK-963 n=2、GSK-962 n=2、Nec-1 n=20），并计算对RIP1激酶抑制的IC₅₀值 [1]
3. 激酶选择性实验：在10 μM浓度下，用GSK-963测试339种人类激酶的活性，检测各激酶的活性并计算抑制率，结果显示GSK-963对这些激酶均无抑制作用 [1]
4. IDO酶活实验：将GSK-963、GSK-962、Nec-1及阳性对照甲萘醌与IDO酶和其底物在体外体系中孵育，检测IDO的酶活性，实验重复三次，结果证实GSK-963无可检测的IDO抑制活性 [1]

对于免疫印迹分析，用 GSK'963 (100 nM)、GSK'962 (100 nM) 或 Nec-1 (10 μM) 预处理 30 分钟后，用 50 ng/ml TNF 刺激 BMDM 5 和 15 分钟。在 1× 细胞裂解缓冲液中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂制成的裂解物在 4-12% SDS-PAGE 上分离，并印迹到硝酸纤维素膜上。 IκB、磷酸-IκB 和微管蛋白作为印迹上的上样对照进行探测。

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细胞培养[1]
将小鼠纤维肉瘤L929细胞（ATCC#CCL-1）和人单核细胞U937细胞在添加了10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI培养基中培养。通过用10ng/ml M-CSF分化7天，从C57BL/6小鼠制备BMDM，并在添加了10%热灭活FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素的DMEM培养基中培养。按照标准方法从人血液中分离出原代人中性粒细胞，该方法包括在右旋糖酐中顺序沉淀、在Ficoll-Hypaque中密度离心和溶解污染的红细胞。

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基于细胞的检测[1]
在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂zVAD FMK或QVD Oph的存在下，TNF诱导BMDM、L929和U937细胞发生坏死性细胞死亡（BMDM:50 ng/ml TNF+50μM zVAD；L929:100ng/ml肿瘤坏死因子+50μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25μM QVD）。为了评估RIP1抑制剂的效果，用化合物（剂量反应）预处理细胞30分钟。19-21小时后，通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法测量细胞ATP水平来评估诱导的细胞死亡。为了诱导中性粒细胞坏死性下垂，用TNF（10ng/ml）、QVD-Oph（50μM）和SMAC模拟物（100nM）刺激新鲜分离的人中性粒细胞。如上所述评估诱导的细胞死亡。

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1. 坏死性凋亡细胞活力实验（CellTiter-Glo法）：将小鼠纤维肉瘤L929细胞、人单核细胞U937、原代小鼠BMDM及原代人中性粒细胞接种于培养板，加入系列浓度的GSK-963、GSK-962或Nec-1；用TNF + zVAD诱导坏死性凋亡（人中性粒细胞需联合SMAC模拟物），孵育后加入CellTiter-Glo试剂检测细胞活力，整合至少三次独立实验的数据绘制剂量-响应曲线，并计算坏死性凋亡抑制的IC₅₀值 [1]
2. Caspase 3/7活性实验：原代小鼠BMDM用TNF + 环己酰亚胺处理以诱导凋亡，同时加入GSK-963（100 nM）、GSK-962（100 nM）或Nec-1（10 μM）。处理3小时后用Caspase-Glo 3/7试剂检测caspase 3/7活性，20小时后用CellTiter-Glo法检测细胞活力；实验独立重复四次，结果显示GSK-963对凋亡信号无影响 [1]
3. IκB磷酸化与降解的免疫印迹实验：原代小鼠BMDM预先用GSK-963（100 nM）、GSK-962（100 nM）或Nec-1（10 μM）处理，再用TNF刺激，分别在5分钟（检测IκB磷酸化）和15分钟（检测IκB降解）收集细胞裂解液；通过免疫印迹实验，用磷酸化IκB、总IκB和微管蛋白（内参）的抗体进行检测；实验用四只不同小鼠的细胞重复，结果证实GSK-963不影响TNF诱导的NF-κB信号通路 [1]

C57BL/6 小鼠在静脉注射 TNF (1.25 mg/kg) 和 zVAD-FMK (16.7 mg/kg) 前 15 分钟，腹腔注射 Nec-1 (0.2 和 2 mg/kg)、GSK′963 (0.2 和 2 mg/kg) 或 GSK′962 (20 mg/kg)。
C57BL/6 小鼠药代动力学实验[1]
简而言之，每种化合物每组使用 n=3 只动物进行药代动力学研究。动物腹腔注射 GSK′963 或 7-Cl-O-Nec-1，药物配制成含 6% 11-β-羟丙基环糊精和 5% DMSO 的水溶液。在腹腔注射后不同时间点采集血样，并用水 1:1 稀释后储存于 -80 °C。
在生物分析之前，将样品解冻，并使用基于蛋白质沉淀的方法分离每种分析物。将所得上清液注入针对目标化合物检测优化的LC/MS/MS系统。数据以标准曲线分析确定的定量药物浓度表示。在这些优化条件下，两种化合物的典型定量下限均为1.00 ng/ml。

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TNF+zVAD诱导的休克模型[1]
在静脉注射TNF（1.25 mg/kg）和zVAD-FMK（16.7 mg/kg）前15分钟，腹腔注射Nec-1（0.2和2 mg/kg）、GSK′963（0.2和2 mg/kg）或GSK′962（20 mg/kg）。通过直肠探针监测体温，持续3小时。

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1. 药代动力学 (PK) 研究：C57BL/6 小鼠腹腔注射 GSK-963，剂量为 10 mg/kg。在预定时间点采集血样，分离血浆，并测定血浆中 GSK-963 的浓度。PK 曲线由三只独立动物的合并结果生成，并基于其在 L929 细胞试验中的效力对 RIP1 的预测抑制率进行建模 [1]。
2. TNF + zVAD 诱导的无菌性休克模型：将 C57BL/6 小鼠随机分为若干组（每组七只）。小鼠在静脉注射TNF + zVAD前15分钟，分别接受GSK-963（0.2 mg/kg或2 mg/kg，腹腔注射）、GSK-962（20 mg/kg，腹腔注射）、Nec-1（0.2 mg/kg或2 mg/kg，腹腔注射）或载体（对照组）预处理。使用直肠探针每30分钟监测一次直肠温度，持续3小时。该实验独立重复三次，并绘制各组的温度变化曲线[1]。

接下来，研究人员评估了腹腔注射（ip）GSK′963和Nec-1在体内的药代动力学特征。在10 mg/kg剂量下，Nec-1的暴露量比GSK′963高约10倍，尽管GSK′963的表观半衰期长于Nec-1（图3a；补充图1a）。然而，基于小鼠药代动力学特征（图3a；补充图1a）和化合物在TNF+zVAD处理的L929细胞中的效力（图2a）的药效学模型表明，在2 mg/kg剂量下，与Nec-1相比，GSK′963能够更长时间地维持高于抑制RIP1活性90%所需浓度的血药浓度（图3b；补充图1b）。 [1]

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1. 将GSK-963以10 mg/kg的剂量腹腔注射给C57BL/6小鼠，并在不同时间点测量该化合物的血浆浓度，以生成药代动力学曲线。[1]
2. 基于观察到的GSK-963药代动力学曲线及其抑制TNF + zVAD诱导的L929细胞坏死性凋亡的效力，计算了0.2 mg/kg和2 mg/kg剂量下RIP1的预测抑制率，证实这些剂量在体内可有效抑制RIP1。[1]

[1]. Characterization of GSK'963: a structurally distinct, potent and selective inhibitor of RIP1 kinase. Cell Death Discov. 2015 Jul 27;1:15009.

坏死性凋亡及其由RIP1激酶活性调控的信号通路正逐渐成为多种疾病炎症的关键驱动因素。通过使用RIP1激酶抑制剂坏死抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1)，人们对RIP1如何调控坏死性细胞死亡有了更深入的了解。Nec-1一直是探索RIP1激酶活性功能的变革性工具；然而，其应用受到一定限制，例如效力中等、对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)存在脱靶活性以及药代动力学性质较差。Nec-1的这些局限性促使人们致力于寻找研究RIP1功能的下一代工具，并最终发现了7-Cl-O-Nec-1 (Nec-1s)。Nec-1s具有更优的药代动力学性质，且不抑制IDO。本文描述了GSK′963的特性，GSK′963是一种手性小分子RIP1激酶抑制剂，其化学结构与Nec-1和Nec-1s均不同。在生化和细胞实验中，GSK′963的效力均显著高于Nec-1，对人源和鼠源细胞中RIP1依赖性细胞死亡的抑制IC50值介于1至4 nM之间。GSK′963对RIP1的选择性比对其他339种激酶高10000倍以上，对IDO无明显活性，且存在一种无活性的对映体GSK′962，可用于验证其靶向作用。GSK′963体外活性的增强也体现在体内，在TNF诱导的无菌性休克模型中，相同剂量的GSK′963对低温的保护作用远优于Nec-1。我们相信，GSK′963 代表了用于体外和体内研究 RIP1 功能的下一代工具，并有助于阐明我们目前对 RIP1 在疾病发病机制中作用的理解。[1]

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在本研究中，我们对 GSK′963 进行了表征，GSK′963 是一种新型 RIP1 激酶小分子抑制剂，其结构与 Nec-1 和 Nec-1s 截然不同。GSK′963 的效力比 Nec-1 高 200 倍以上，对 RIP1 激酶活性具有极高的选择性，并且对 IDO 活性、TNF 介导的 NFκB 激活或细胞凋亡均无影响。GSK′963 是一种手性分子，因此可以使用其化学结构相同的非活性对映体作为阴性对照，以验证该抑制剂的靶向活性。此外，在TNF诱导的无菌性休克体内模型中，GSK′963在Nec-1在该模型中未显示出显著保护作用的剂量下，提供了完全的保护作用。综上所述，我们认为GSK′963代表了探索RIP1激酶介导的生物学作用的又一新一代工具。[1]

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综上所述，我们发现了一种新型的、高效且选择性的RIP1激酶活性抑制剂。我们认为GSK′963代表了用于体外研究RIP1生物学的新一代工具抑制剂，与市售的坏死抑制剂相比具有显著优势。

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1.GSK-963是一种手性小分子RIP1激酶抑制剂，其化学结构与Nec-1和Nec-1s（7-Cl-O-Nec-1）不同；它解决了 Nec-1 的局限性（效力中等、脱靶 IDO 抑制、药代动力学性质差）[1]
2. GSK-963 有一个无活性的对映体 (GSK-962)，可用作阴性对照，以验证 RIP1 抑制在体外和体内实验中的靶向作用[1]
3. 坏死性凋亡和 RIP1 激酶介导的信号传导是各种疾病情况下炎症的关键驱动因素； GSK-963是一种新一代工具化合物，因其高效、选择性强且无脱靶活性，可用于研究RIP1在疾病发病机制中的作用[1]
4. GSK-963特异性抑制RIP1依赖性坏死性凋亡，而不影响凋亡信号通路（caspase 3/7活性）或NF-κB激活（IκB磷酸化/降解），表明其对RIP1激酶具有靶向特异性[1]

C14H18N2O

230.31

230.141

C, 73.01; H, 7.88; N, 12.16; O, 6.95

2049868-46-2

GSK962;2049872-86-6

122703613

Light yellow to yellow solid powder

1.06±0.1 g/cm3

342.8±45.0 °C

2.1

32.7

0

2

2

17

311

1

O=C(C(C)(C)C)N1C(C2C=CC=CC=2)CC=N1

NJQVSLWJBLPTMD-LBPRGKRZSA-N

InChI=1S/C14H18N2O/c1-14(2,3)13(17)16-12(9-10-15-16)11-7-5-4-6-8-11/h4-8,10,12H,9H2,1-3H3/t12-/m0/s1

2,2-dimethyl-1-[(3S)-3-phenyl-3,4-dihydropyrazol-2-yl]propan-1-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (10.85 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。