| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
RIP1 kinase
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外活性：GSK-963（也称为 GSK963 或 GSK963）是一种有效的选择性 RIP1 激酶抑制剂。在生化和细胞测定中，GSK963 明显比 Nec-1（一种已知的 RIP1 激酶抑制剂）更有效，在人和小鼠细胞中抑制 RIP1 依赖性细胞死亡，IC50 介于 1 至 4 nM 之间。 GSK963 对 RIP1 的选择性比 339 种其他激酶高 10 000 倍，缺乏针对 IDO 的可测量活性，并且具有非活性对映体 GSK'962，可用于确认靶向效果。 GSK963 增强的体外效力也适用于体内，在 TNF 诱导的无菌休克模型中，GSK963 在与 Nec-1 匹配的剂量下提供了更大的低温保护。总之，我们相信 GSK963 代表了检查 RIP1 体外和体内功能的下一代工具，并应有助于澄清我们目前对 RIP1 在疾病发病机制中作用的理解。激酶测定：使用 ADP-Glo 发光测定测定化合物对抗 RIP1 激酶活性的效力，该测定如前所述测量 ATP 到 ADP 的转化。简而言之，主要反应由 50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% 中的 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP 组成章节。将 5 微升酶和 5 μl ATP 以最终测定浓度的两倍添加到板中，并在室温下孵育 4 小时。在读板器上测量发光。测试化合物抑制表示为内部测定对照的抑制百分比。细胞测定：在 caspase 抑制剂 zVAD-FMK 或 QVD-Oph 存在下，用 TNF 在 BMDM、L929 和 U937 细胞中诱导坏死性细胞死亡（BMDM：50 ng/ml TNF+50 μM zVAD；L929：100 ng/ml TNF） +50 μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25 μM QVD）。为了评估 RIP1 抑制剂的效果，用化合物（剂量反应）预处理细胞 30 分钟。 19-21小时后，通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定测量细胞ATP水平来评估诱导的细胞死亡。为了诱导中性粒细胞坏死性凋亡，用 TNF (10 ng/ml)、QVD-Oph (50 μM) 和 SMAC 模拟物 (100 nM) 刺激新鲜分离的人中性粒细胞。如上所述评估诱导的细胞死亡。
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| 体内研究 (In Vivo) |
GSK′963是TNF+zVAD介导的致死性休克的强效抑制剂：研究人员评估了GSK′965和Nec-1在体内腹腔注射后的药代动力学特征。尽管GSK′963的表观半衰期大于Nec-1（图3a；补充图1a），但Nec-1在10mg/kg时的暴露量比葛兰素史克′963高出约10倍。然而，基于小鼠药代动力学特征（图3a；补充图1a）和TNF+zVAD处理的L929细胞中的化合物效力（图2a）对这两种化合物的药效学建模表明，与Nec-1相比，在2 mg/kg的剂量下，GSK′963将在较长一段时间内将血液浓度维持在90%抑制RIP1活性所需的浓度以上（图3b；补充图1b）。为了直接在体内测试GSK′963的疗效，我们使用了无菌休克的急性模型。给予TNF+zVAD会导致致命的低体温，此前已被证明这取决于RIP1激酶活性。5,18用2 mg/kg GSK′963治疗动物可完全保护动物免受TNF+zVASD诱导的体温下降，0.2 mg/kg剂量也显示出显著的反应（图3c）。正如预期的那样，GSK'962对TNF+zVAD诱导的休克没有影响，证实GSK′963通过抑制RIP1激酶选择性地起作用（图3d）。有趣的是，Nec-1在0.2 mg/kg的剂量下对模型没有影响，该剂量在文献中通常用于在体内抑制RIP1，并且在高10倍的剂量下显示出最低水平的保护作用（图3e）。这些结果共同表明，与Nec-1相比，GSK′963是探索体内急性RIP1激酶生物学的更好工具分子[1]。
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| 酶活实验 |
使用 ADP-Glo 发光测定法测定化合物对抗 RIP1 激酶活性的效力，该测定法测量 ATP 到 ADP 的转化，如前所述。简而言之，主要反应由 50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% 中的 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP 组成章节。将 5 微升酶和 5 μl ATP 以最终测定浓度的两倍添加到板中，并在室温下孵育 4 小时。在读板器上测量发光。测试化合物抑制表示为内部测定对照的抑制百分比。
荧光偏振（FP）结合分析[1] 如前所述，开发了一种基于FP的结合测定法，通过与荧光标记的ATP竞争配体竞争，定量RIP1 ATP结合袋处新型测试化合物的相互作用。18简而言之，GST-RipK1（1-375）被纯化，并以10nM的最终测定浓度使用。使用荧光标记配体（14-（2-{[3-（{2-{[4-（氰甲基）苯基]氨基}-6-[（5-环丙基-1H-吡唑-3-基）氨基]-4-嘧啶基}氨基）丙基]氨基}-2-氧乙基）-16,16,18,18-四甲基-6,7,7a，8a，9,10,16,18-八氢苯并[2“，3”]中氮茚并[8“，7”：5ʹ，6ʹ;]吡喃并[3，2ʹ:3,4]吡啶并[1,2-A]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐，最终测定浓度为5nM。样本在Analyst多模式阅读器上读取。试验化合物抑制率表示为内部试验对照的抑制百分比（%）。 ADP-Glo激酶测定[1] 使用ADP-Glo发光测定法测定化合物对RIP1激酶活性的效力，该测定法测量ATP向ADP的转化，如前所述。18简而言之，主要反应由10 nM GST-RIPK1（1-375）和50μM ATP在50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl2、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA和0.02%CHAPS中组成。将5微升酶和5μl ATP以最终测定浓度的两倍加入平板中，在室温下孵育4小时。在平板读数器上测量发光。试验化合物抑制率表示为内部测定对照的抑制百分比。 激酶选择性[1] 在Reaction Corp Biology使用P33放射性标记测定法对GSK′963进行了抗339种激酶的测试(http://www.reactionbiology.com). 该化合物在10μM下以单次剂量进行了两次测试。反应在10μM ATP下进行。数据以酶活性百分比报告（相对于DMSO对照）。完整数据集见补充表一。 IDO酶法测定[1] 如Takahashi等人25所述，使用购自R&D Systems的重组人IDO测定IDO活性。使用Spectramax酶标仪在490 nm下测量犬尿氨酸衍生的黄色色素。 半胱天冬酶3/7测定[1] 为了诱导细胞凋亡，用GSK′963（100 nM）、GSK'962（100 nM）或Nec-1（10μM）预处理30分钟的BMDM用TNF（50 ng/ml）和CHX（12μg/ml）刺激。使用Caspase-Glo 3/7测定法在6小时时测量Caspase 3/7活性。 |
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| 细胞实验 |
对于免疫印迹分析，用GSK'963 (100 nM)、GSK'962 (100 nM) 或 Nec-1 (10 μM) 预处理 30 分钟后，用 50 ng/ml TNF 刺激 BMDM 5 和 15 分钟。在 1× 细胞裂解缓冲液中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂制成的裂解物在 4-12% SDS-PAGE 上分离，并印迹到硝酸纤维素膜上。 IκB、磷酸-IκB 和微管蛋白作为印迹上的上样对照进行探测。
细胞培养[1] 将小鼠纤维肉瘤L929细胞（ATCC#CCL-1）和人单核细胞U937细胞在添加了10%热灭活FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI培养基中培养。通过用10ng/ml M-CSF分化7天，从C57BL/6小鼠制备BMDM，并在添加了10%热灭活FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素的DMEM培养基中培养。按照标准方法从人血液中分离出原代人中性粒细胞，该方法包括在右旋糖酐中顺序沉淀、在Ficoll-Hypaque中密度离心和溶解污染的红细胞。 基于细胞的检测[1] 在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂zVAD FMK或QVD Oph的存在下，TNF诱导BMDM、L929和U937细胞发生坏死性细胞死亡（BMDM:50 ng/ml TNF+50μM zVAD；L929:100ng/ml肿瘤坏死因子+50μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25μM QVD）。为了评估RIP1抑制剂的效果，用化合物（剂量反应）预处理细胞30分钟。19-21小时后，通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法测量细胞ATP水平来评估诱导的细胞死亡。为了诱导中性粒细胞坏死性下垂，用TNF（10ng/ml）、QVD-Oph（50μM）和SMAC模拟物（100nM）刺激新鲜分离的人中性粒细胞。如上所述评估诱导的细胞死亡。 |
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| 动物实验 |
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| 药代性质 (ADME/PK) |
接下来，研究人员评估了腹腔注射（ip）GSK′963和Nec-1在体内的药代动力学特征。在10 mg/kg剂量下，Nec-1的暴露量比GSK′963高约10倍，尽管GSK′963的表观半衰期比Nec-1长（图3a；补充图1a）。然而，基于小鼠药代动力学特征（图3a；补充图1a）和化合物在TNF+zVAD处理的L929细胞中的效力（图2a）的药效学模型表明，在2 mg/kg剂量下，与Nec-1相比，GSK′963能够更长时间地维持高于抑制RIP1活性90%所需浓度的血药浓度（图3b；补充图1b）。[1]
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| 参考文献 |
Cell Death Discov.2015 Jul 27;1:15009.
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| 其他信息 |
坏死性凋亡及其由RIP1激酶活性调控的信号通路正逐渐成为多种疾病炎症的关键驱动因素。通过使用RIP1激酶抑制剂坏死抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1)，人们对RIP1如何调控坏死性细胞死亡有了更深入的了解。Nec-1一直是探索RIP1激酶活性功能的变革性工具；然而，其应用受到一定限制，例如效力中等、对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)存在脱靶活性以及药代动力学性质较差。Nec-1的这些局限性促使人们致力于寻找研究RIP1功能的下一代工具，并最终发现了7-Cl-O-Nec-1 (Nec-1s)。Nec-1s具有更优的药代动力学性质，且不抑制IDO。本文描述了GSK′963的特性，GSK′963是一种手性小分子RIP1激酶抑制剂，其化学结构与Nec-1和Nec-1s均不同。在生化和细胞实验中，GSK′963的效力均显著高于Nec-1，对人源和鼠源细胞中RIP1依赖性细胞死亡的抑制IC50值介于1至4 nM之间。GSK′963对RIP1的选择性比对其他339种激酶高10000倍以上，对IDO无明显活性，且存在一种无活性的对映体GSK′962，可用于验证其靶向作用。GSK′963体外活性的增强也体现在体内，在TNF诱导的无菌性休克模型中，相同剂量的GSK′963对低温的保护作用远优于Nec-1。我们相信，GSK′963 代表了用于体外和体内研究 RIP1 功能的下一代工具，并有助于阐明我们目前对 RIP1 在疾病发病机制中作用的理解。[1]
在本研究中，我们对 GSK′963 进行了表征，GSK′963 是一种新型 RIP1 激酶小分子抑制剂，其结构与 Nec-1 和 Nec-1s 截然不同。GSK′963 的效力比 Nec-1 高 200 倍以上，对 RIP1 激酶活性具有极高的选择性，并且对 IDO 活性、TNF 介导的 NFκB 激活或细胞凋亡均无影响。GSK′963 是一种手性分子，因此可以使用其化学结构相同的非活性对映体作为阴性对照，以验证该抑制剂的靶向活性。此外，在TNF诱导的无菌性休克体内模型中，GSK′963在Nec-1在该模型中未显示出显著保护作用的剂量下，仍能提供完全的保护。综上所述，我们认为GSK′963代表了一种用于探索RIP1激酶介导的生物学作用的新一代工具。[1] 综上所述，我们发现了一种新型的、高效且选择性的RIP1激酶活性抑制剂。我们认为GSK′963代表了一种用于体外研究RIP1生物学的新一代工具抑制剂，与市售的坏死抑制剂相比具有显著优势。 |
| 分子式 |
C14H18N2O
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|---|---|---|
| 分子量 |
230.31
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| 精确质量 |
230.141
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| 元素分析 |
C, 73.01; H, 7.88; N, 12.16; O, 6.95
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| CAS号 |
2049872-86-6
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| 相关CAS号 |
GSK963;2049868-46-2
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| PubChem CID |
122703688
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| 外观&性状 |
Light yellow to yellow solid powder
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| LogP |
2.1
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| tPSA |
32.7
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
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| 氢键受体(HBA)数目 |
2
|
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| 可旋转键数目(RBC) |
2
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| 重原子数目 |
17
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| 分子复杂度/Complexity |
311
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| 定义原子立体中心数目 |
1
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| SMILES |
CC(C)(C)C(=O)N1[C@H](CC=N1)C2=CC=CC=C2
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| InChi Key |
NJQVSLWJBLPTMD-GFCCVEGCSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C14H18N2O/c1-14(2,3)13(17)16-12(9-10-15-16)11-7-5-4-6-8-11/h4-8,10,12H,9H2,1-3H3/t12-/m1/s1
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| 化学名 |
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 4.3420 mL | 21.7099 mL | 43.4197 mL | |
| 5 mM | 0.8684 mL | 4.3420 mL | 8.6839 mL | |
| 10 mM | 0.4342 mL | 2.1710 mL | 4.3420 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
GSK′963A is a potent and selective inhibitor of RIP1 kinase. (a) Chemical structures of GSK′963A (active analog), GSK′962A (inactive analog) and Necrostatin-1. (b) Dose–response curves for GSK′963, GSK′962 and Nec-1 in the FP binding assay evaluating the affinity of compounds for RIP1 (ATP-binding pocket).Cell Death Discov.2015 Jul 27;1:15009. |
|---|
 GSK′963A is highly potent in human and mouse cell-based assays and selective for inhibition of necroptosis. (a–d) Dose–response curves for GSK′963, GSK′962 and Nec-1 in cell-based assays.Cell Death Discov.2015 Jul 27;1:15009. |
 GSK′963A protects mice from TNF+zVAD-induced hypothermia. (a) Pharmacokinetic profile of GSK′963A dosed i.p. at 10 mg/kg in C57BL/6 mice. The data represent the combined results of the three independent animals. (b) Modeling of predicted % inhibition against RIP1 using the observed pharmacokinetic profile of GSK′963 in conjunction with the potency in inhibiting TNF+zVAD necroptosis in mouse L929 cells.Cell Death Discov.2015 Jul 27;1:15009. |
NSC23005 sodium
GNF-6231
FIPI HCl
去氨加压素
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