RIP1 kinase

GSK-963（也称为 GSK963 或 GSK963）是一种强效且选择性的 RIP1 激酶抑制剂。在生化和细胞实验中，GSK963 的效力均显著高于已知的 RIP1 激酶抑制剂 Nec-1，其对 RIP1 依赖性细胞死亡的抑制作用在人源和鼠源细胞中的 IC50 值介于 1 至 4 nM 之间。GSK963 对 RIP1 的选择性比对其他 339 种激酶高出 10000 倍以上，对 IDO 无明显活性，并且存在一种无活性的对映体 GSK'962，可用于验证其靶向作用。GSK963 体外效力的增强也体现在体内，在 TNF 诱导的无菌性休克模型中，相同剂量的 GSK963 能提供比 Nec-1 更强的低温保护作用。我们共同认为，GSK963 代表了用于在体外和体内研究 RIP1 功能的下一代工具，并有助于阐明我们目前对 RIP1 在疾病发病机制中作用的理解。

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激酶活性测定：使用 ADP-Glo 发光测定法测定化合物对 RIP1 激酶活性的效力，该方法测量 ATP 向 ADP 的转化，如前所述。简而言之，主要反应体系包含 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP，溶于 50 mM HEPES (pH 7.5)、50 mM NaCl、30 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% CHAPS 缓冲液中。将 5 μl 酶溶液和 5 μl ATP 溶液加入反应板中，使其浓度达到最终检测浓度的两倍，并在室温下孵育 4 小时。使用酶标仪测量发光值。测试化合物的抑制率以内部检测对照的抑制百分比表示。

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细胞实验：在 caspase 抑制剂 zVAD-FMK 或 QVD-Oph 存在的情况下，用 TNF 诱导 BMDM、L929 和 U937 细胞发生坏死性细胞死亡（BMDM：50 ng/ml TNF+50 μM zVAD；L929：100 ng/ml TNF+50 μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25 μM QVD）。

为了评估 RIP1 抑制剂的作用，细胞预先用化合物（剂量-反应）处理 30 分钟。19-21 小时后，使用 CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒（Promega，美国威斯康星州菲奇堡）测量细胞 ATP 水平来评估诱导的细胞死亡。为了诱导中性粒细胞发生坏死性凋亡，用 TNF (10 ng/ml)、QVD-Oph (50 μM) 和 SMAC 模拟物 (100 nM) 刺激新鲜分离的人中性粒细胞。诱导的细胞死亡的评估方法同上。在生化分析中，GSK-962 未显示出对 RIP1 激酶活性的可测量抑制作用。在测量 RIP1 ATP 结合口袋竞争的荧光偏振 (FP) 结合实验中，GSK-962 在浓度高达 10 μM 时均未显示活性（图 1b）。在检测 RIP1 自磷酸化的 ADP-Glo 激酶活性测定中，GSK'962 无活性（图 1c）。在吲哚胺-2,3-双加氧酶 (IDO) 酶活性测定中，GSK'962 对 IDO 活性无影响（图 1e）。[1]
在基于细胞的实验中，GSK-962 抑制坏死性凋亡的效力至少比 GSK'963 低 1000 倍。在小鼠 L929 细胞中，GSK'962 对 TNF+zVAD 诱导的细胞死亡的抑制作用极弱，IC₅₀ > 1 μM（相比之下，GSK'963 的 IC₅₀ = 1 nM）。在人 U937 细胞中，GSK'962 在浓度高达 1 μM 时也无活性。在诱导发生坏死性凋亡的小鼠原代骨髓巨噬细胞和人原代中性粒细胞中，GSK'962 没有显著影响（图 2a-d）。GSK'962 (100 nM) 不影响 TNF+环己酰亚胺诱导的细胞凋亡（通过 Caspase 3/7 活性测定）或 TNF 诱导的 IκB 磷酸化或降解（通过蛋白质印迹法评估），证实其不抑制 RIP1 非依赖性通路（图 2e、2f）。[1]

GSK′963 是一种强效的 TNF+zVAD 介导的致死性休克抑制剂：研究人员评估了 GSK′963 和 Nec-1 在腹腔注射（ip）给药后的体内药代动力学特征。在 10 mg/kg 剂量下，Nec-1 的暴露量比 GSK′963 高约 10 倍，尽管 GSK′963 的表观半衰期长于 Nec-1（图 3a；补充图 1a）。然而，基于小鼠药代动力学特征（图 3a；补充图 1a）和化合物在 TNF+zVAD 处理的 L929 细胞中的效力（图 2a）的药效学模型表明，在 2 mg/kg 剂量下，与 Nec-1 相比，GSK′963 能更长时间地维持血液浓度高于抑制 RIP1 活性 90% 所需的浓度（图 3b；补充图 1b）。为了直接检测 GSK′963 在体内的疗效，我们采用了一种急性无菌性休克模型。TNF+zVAD 的给药会导致致命性体温过低，此前研究表明这种体温过低依赖于 RIP1 激酶活性^5,18。给予动物 2 mg/kg 的 GSK′963 可完全保护其免受 TNF+zVAD 诱导的体温下降，0.2 mg/kg 的剂量也显示出显著疗效（图 3c）。正如预期的那样，GSK'962 对 TNF+zVAD 诱导的休克没有影响，证实 GSK′963 是通过选择性抑制 RIP1 激酶发挥作用的（图 3d）。有趣的是，Nec-1 在 0.2 mg/kg 的剂量下对该模型没有影响，而该剂量是文献中常用的体内 RIP1 抑制剂量，即使在 10 倍剂量下也仅显示出微弱的保护作用（图 3e）。这些结果共同表明，与Nec-1相比，GSK′963是研究体内急性RIP1激酶生物学的更佳工具分子[1]。
在TNF+zVAD诱导的无菌性休克体内模型中，腹腔注射20 mg/kg的GSK-962（剂量是GSK′963有效剂量的10倍）并未显示出对低体温的保护作用。GSK′962治疗组小鼠的体温在3小时内下降幅度与载体对照组相似（图3d）。这证实了GSK′963的保护作用是由于其对RIP1的靶向抑制作用。[1]

采用ADP-Glo发光法测定化合物对RIP1激酶活性的抑制效力，该方法通过测量ATP转化为ADP的转化率来评估抑制效果，具体方法如前所述。简而言之，反应体系包含10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和50 μM ATP，以及50 mM HEPES（pH 7.5）、50 mM NaCl、30 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA和0.02% CHAPS。将5 μl酶溶液和5 μl ATP加入反应板中，使其浓度为最终检测浓度的两倍，并在室温下孵育4小时。使用酶标仪测量发光值。测试化合物的抑制作用以内部检测对照的抑制百分比表示。

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荧光偏振 (FP) 结合测定[1]
开发了一种基于 FP 的结合测定方法，通过与荧光标记的 ATP 竞争性配体竞争，定量分析新型测试化合物与 RIP1 ATP 结合口袋的相互作用，如前所述。18 简而言之，纯化 GST-RipK1 (1–375)，并以 10 nM 的最终测定浓度使用。荧光标记配体 (14-(2-{[3-({2-{[4-(氰甲基)苯基]氨基}-6-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-4-嘧啶基}氨基)丙基]氨基}-2-氧代乙基)-16,16,18,18-四甲基-6,7,7a,8a,9,10,16,18-八氢苯并[2“,3“]吲哚并[8“,7“:5ʹ,6ʹ]吡喃并[3ʹ,2ʹ:3,4]吡啶并[1,2-a]吲哚-5-鎓-2-磺酸盐) 的最终测定浓度为 5 nM。样品在 Analyst 多功能酶标仪上进行读取。测试化合物的抑制率以内部对照品的抑制百分比 (%) 表示。

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ADP-Glo 激酶检测[1]
使用 ADP-Glo 发光法测定化合物对 RIP1 激酶活性的抑制效力，该方法测量 ATP 向 ADP 的转化，如前所述¹⁸。简而言之，主要反应体系包含 10 nM GST-RIPK1 (1–375) 和 50 μM ATP，溶于 50 mM HEPES (pH 7.5)、50 mM NaCl、30 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.5 mg/ml BSA 和 0.02% CHAPS 缓冲液中。将 5 μl 酶和 5 μl ATP 加入反应板中，使其浓度为最终检测浓度的两倍，并在室温下孵育 4 小时。使用酶标仪测量发光值。测试化合物的抑制率以内部对照的抑制百分比表示。

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激酶选择性[1]
使用以下方法测试了 GSK′963 对 339 种激酶的选择性：在 Reaction Corp Biology (http://www.reactionbiology.com) 进行 P33 放射性标记测定。化合物以 10 μM 的浓度进行单剂量重复测试。反应在 10 μM ATP 条件下进行。数据以酶活性百分比（相对于 DMSO 对照组）表示。完整数据集见补充表 I。

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IDO 酶活性测定[1]
IDO 活性测定按照 Takahashi 等人²⁵ 的方法进行，使用购自 R&D Systems 的重组人 IDO。使用 Spectramax 微孔板读数仪在 490 nm 处测量犬尿氨酸衍生的黄色色素。

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Caspase 3/7 测定[1]
为诱导细胞凋亡，用 GSK′963 (100 nM)、GSK'962 (100 nM) 或 Nec-1 (10 nM) 预处理 BMDM。将 10 nM 的 GST-RIP1 (1-375) 与荧光标记的 ATP 竞争性配体 (5 nM) 和不同浓度的测试化合物孵育 30 分钟。6 小时后，使用 Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒测定 Caspase 3/7 活性。

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荧光偏振 (FP) 结合试验：将终浓度为 10 nM 的 GST-RIP1 (1-375) 与荧光标记的 ATP 竞争性配体 (5 nM) 和不同浓度的测试化合物孵育。该试验测定 RIP1 ATP 结合口袋的竞争情况。GSK-962 的测试浓度高达 10 μM，结果显示无置换活性（曲线平坦，无法计算 IC₅₀）。使用 Analyst 多功能酶标仪读取样品。抑制率以相对于内部对照的百分比表示。[1]
ADP-Glo 激酶试验：反应体系包含 10 nM GST-RIP1 (1-375) 和 50 μM ATP 在缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、50 mM NaCl、30 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.5 mg/mL BSA、0.02% CHAPS）中孵育。将GSK-962与酶和 ATP 在室温下孵育 4 小时。通过发光法测定 ADP 的生成量。GSK'962 未显示对 RIP1 自磷酸化的抑制作用。[1]
IDO 酶活性测定：使用重组人 IDO。在 490 nm 处测定犬尿氨酸（黄色色素）的生成量。GSK-962未抑制 IDO 活性，而阳性对照 meandione 显示出预期的抑制作用（图 1e）。由于 GSK'962 无活性，因此未测定其 IC₅₀ 值。[1]

进行免疫印迹分析时，将BMDM细胞预先用GSK'963 (100 nM)、GSK'962 (100 nM) 或Nec-1 (10 μM) 处理30分钟，然后用50 ng/ml TNF刺激5分钟和15分钟。用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在1×细胞裂解缓冲液中制备裂解液，并在4-12% SDS-PAGE凝胶上进行分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。在印迹实验中，IκB、磷酸化IκB和微管蛋白作为上样对照。

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细胞培养[1]
小鼠纤维肉瘤L929细胞（ATCC# CCL-1）和人单核细胞U937细胞培养于添加了10%热灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI培养基中。BMDM细胞取自C57BL/6小鼠，用10 ng/ml M-CSF诱导分化7天后，培养于添加了10%热灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和0.25 μg/ml两性霉素的DMEM培养基中。采用标准方法从人血中分离原代人中性粒细胞，该方法包括葡聚糖连续沉降、Ficoll-Hypaque密度梯度离心和去除污染的红细胞。

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基于细胞的检测[1]
在存在caspase抑制剂zVAD-FMK或QVD-Oph的情况下，用TNF诱导BMDM、L929和U937细胞发生坏死性凋亡（BMDM：50 ng/ml TNF+50 μM zVAD；L929：100 ng/ml TNF+50 μM QVD；U937：100 ng/ml TNF+25 μM QVD）。为了评估RIP1抑制剂的作用，将细胞用化合物（剂量-反应）预处理30分钟。诱导细胞死亡在19-21小时后通过CellTiter-Glo发光细胞活力检测法测量细胞ATP水平进行评估。为诱导中性粒细胞坏死性凋亡，将新鲜分离的人中性粒细胞用TNF（10 ng/ml）、QVD-Oph（50 μM）和SMAC模拟物（100 nM）刺激。诱导细胞死亡的评估方法同上。

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坏死性凋亡的细胞活力检测：将小鼠L929细胞、人U937细胞、原代小鼠骨髓来源巨噬细胞或原代人中性粒细胞用不同浓度（通常为0.1 nM至10 μM）的GSK-962预处理30分钟，然后用TNF和caspase抑制剂（zVAD-FMK或QVD-Oph）刺激以诱导坏死性凋亡。 19-21 小时后，采用 CellTiter-Glo 试剂盒（ATP 含量）检测细胞活力。GSK'962 在浓度高达 10 μM 时未显示出显著的保护作用，其 IC₅₀ 值比 GSK'963 高 1000 倍以上（图 2a-d）。[1]
凋亡的 Caspase 3/7 检测：将原代小鼠骨髓来源巨噬细胞用 GSK-962 (100 nM) 预处理 30 分钟，然后用 TNF (50 ng/mL) 和环己酰亚胺 (12 μg/mL) 刺激。6 小时后，使用 Caspase-Glo 3/7 试剂盒检测 Caspase 3/7 活性。与载体对照组相比，GSK'962 并未改变细胞凋亡（图 2e）[1]。
NF-κB 信号通路的蛋白质印迹分析：将骨髓来源的巨噬细胞用GSK-962（100 nM）预处理 30 分钟，然后用 TNF（50 ng/mL）刺激 5 或 15 分钟。提取细胞裂解液，检测磷酸化 IκB（5 分钟）和总 IκB（15 分钟）。GSK'962 对 IκB 的磷酸化或降解均无影响，表明其对 NF-κB 的激活无影响（图 2f）[1]。

C57BL/6 小鼠在静脉注射 TNF (1.25 mg/kg) 和 zVAD-FMK (16.7 mg/kg) 前 15 分钟，腹腔注射 Nec-1 (0.2 和 2 mg/kg)、GSK′963 (0.2 和 2 mg/kg) 或 GSK′962 (20 mg/kg)。C57BL/6 小鼠
药代动力学实验[1]
简而言之，每种化合物的药代动力学研究均采用每组 3 只动物进行。动物腹腔注射 GSK′963 或 7-Cl-O-Nec-1，这两种药物均配制成溶于 6% 11-β-羟丙基环糊精和 5% DMSO 的水溶液。腹腔注射后不同时间点采集血样，并以1:1的比例用水稀释，储存于−80 °C。
生物分析前，将样本解冻，并采用基于蛋白质沉淀的方法分离各分析物。将所得上清液注入经优化用于检测目标化合物的LC/MS/MS系统。数据以标准曲线分析确定的定量药物浓度表示。在这些优化条件下，两种化合物的典型定量下限均为 1.00 ng/ml。

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TNF+zVAD 诱导的休克模型[1]
C57BL/6 小鼠在静脉注射 TNF (1.25 mg/kg) 和 zVAD-FMK (16.7 mg/kg) 前 15 分钟，腹腔注射 Nec-1 (0.2 和 2 mg/kg)、GSK′963 (0.2 和 2 mg/kg) 或 GSK′962 (20 mg/kg)。通过直肠探针监测 3 小时的体温。

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药代动力学实验：药代动力学研究中未提及 GSK-962；仅评估了 GSK'963 和 Nec-1。除在疗效研究中使用外，未描述针对 GSK'962 的特定动物实验方案。在TNF+zVAD诱导的休克模型中，C57BL/6小鼠在静脉注射TNF（1.25 mg/kg）和zVAD-FMK（16.7 mg/kg）前15分钟，腹腔注射（ip）20 mg/kg的GSK-962（溶于6%羟丙基环糊精和5% DMSO的溶剂中）。通过直肠探针监测体温3小时。目前尚无其他关于GSK-962的动物研究报道。[1]

接下来，研究人员通过腹腔注射（ip）评估了GSK′963和Nec-1在体内的药代动力学特征。在10 mg/kg剂量下，尽管GSK′963的表观半衰期比Nec-1长（图3a；补充图1a），但Nec-1的暴露量约为GSK′963的10倍。然而，基于小鼠药代动力学特征（图3a；补充图1a）和化合物在TNF+zVAD处理的L929细胞中的疗效（图2a）的药效学模型显示，在2 mg/kg剂量下，GSK′963能够维持血浆浓度高于抑制90% RIP1活性所需浓度的时间比Nec-1更长（图3b；补充图1b）。 [1]

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Cell Death Discov.2015 Jul 27;1:15009.

坏死抑制剂-1 (Nec-1)、细胞凋亡及其受RIP1激酶活性调控的信号通路正日益成为多种疾病炎症的关键驱动因素。通过使用RIP1激酶抑制剂坏死抑制剂-1 (Nec-1)，人们对RIP1如何调控坏死性细胞死亡有了更深入的了解。Nec-1一直是探索RIP1激酶活性功能的变革性工具；然而，其应用受到一些因素的限制，例如效力中等、对吲哚胺-2,3-双加氧酶 (IDO) 存在脱靶活性以及药代动力学性质较差。Nec-1的这些局限性促使人们致力于寻找研究RIP1功能的下一代工具，最终发现了7-Cl-O-Nec-1 (Nec-1s)。Nec-1s具有更优异的药代动力学性质，且不抑制IDO。本文描述了GSK′963的特性，GSK′963是一种手性小分子RIP1激酶抑制剂，其化学结构与Nec-1和Nec-1s均不同。在生化和细胞实验中，GSK′963的效力显著高于Nec-1，其抑制人源和鼠源细胞中RIP1依赖性细胞死亡的IC50值在1至4 nM之间。与339种其他激酶相比，GSK′963对RIP1的选择性高出10,000倍以上，对IDO无显著活性，并且存在一种无活性的对映体GSK′962，可用于验证其靶向作用。GSK′963增强的体外活性也在体内得到证实；在TNF诱导的无菌性休克模型中，相同剂量的GSK′963对低温的保护作用显著优于Nec-1。我们相信，GSK′963 代表了研究 RIP1 功能在体外和体内的下一代工具，并将有助于阐明我们目前对 RIP1 在疾病发病机制中作用的理解。[1] 在本研究中，我们对 GSK′963 进行了表征，GSK′963 是一种新型 RIP1 激酶小分子抑制剂，其结构与 Nec-1 和 Nec-1s 截然不同。GSK′963 的效力是 Nec-1 的 200 倍以上，对 RIP1 激酶活性具有极高的选择性，并且对 IDO 活性、TNF 介导的 NFκB 激活或细胞凋亡没有影响。作为一种手性分子，GSK′963 可与其化学结构相同的非活性对映体用作阴性对照，以验证该抑制剂的靶向活性。此外，在 TNF 诱导的体内无菌性休克模型中，GSK′963 在 Nec-1 未显示显著保护作用的剂量下提供了完全的保护作用。总之，我们认为 GSK′963 代表了探索 RIP1 激酶介导的生物学效应的新一代工具。[1]

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总之，我们发现了一种新型、高效且选择性的 RIP1 激酶活性抑制剂。我们认为 GSK′963 代表了用于体外研究 RIP1 生物学的新一代工具抑制剂，与市售的坏死抑制剂相比具有显著优势。

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GSK-962 是强效 RIP1 激酶抑制剂 GSK′963 的非活性对映体。它在实验中用作阴性对照，以区分靶向效应和脱靶活性。GSK′962 与 GSK′963 化学结构相同，但缺乏 RIP1 结合和抑制所需的 chiral 构型。该化合物在生化试验中对 RIP1 没有活性（FP 结合 IC₅₀ > 10 μM；ADP-Glo 激酶无活性），对小鼠或人细胞的坏死性凋亡没有抑制作用（IC₅₀ 至少比 GSK'963 高 1000 倍），并且对 IDO、细胞凋亡或 NF-κB 信号通路没有影响。体内实验表明，腹腔注射 20 mg/kg 的 GSK'962 无法保护小鼠免受 TNF+zVAD 诱导的体温过低的影响，这证实了 GSK'963 的保护作用是特异性地通过抑制 RIP1 激酶介导的。[1]

C14H18N2O

230.31

230.141

C, 73.01; H, 7.88; N, 12.16; O, 6.95

2049872-86-6

GSK963;2049868-46-2

122703688

Light yellow to yellow solid powder

2.1

32.7

0

2

2

17

311

1

CC(C)(C)C(=O)N1[C@H](CC=N1)C2=CC=CC=C2

NJQVSLWJBLPTMD-GFCCVEGCSA-N

InChI=1S/C14H18N2O/c1-14(2,3)13(17)16-12(9-10-15-16)11-7-5-4-6-8-11/h4-8,10,12H,9H2,1-3H3/t12-/m1/s1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。