Pemrametostat (GSK3326595; EPZ-015938)

PRMT5 (IC50 = 6.2 nM)
GSK3326595 (EPZ-015938) targets protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) [1]

GSK3326595（10-100 nM，24-72 小时）抑制 ACE2-RBD 相互作用，从而防止 SARS-CoV-2 刺突假病毒感染 HEK-293 细胞和 A549 细胞 [1]。当暴露于 GSK3326595（100 nM，12 小时）时，腹膜巨噬细胞会被 IFN-γ 诱导极化为 M1 型 [3]。 MCL 细胞死亡由 GSK3326595（0.15-10 μM，72 小时）诱导[4]。

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I型蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）催化精氨酸在蛋白质上的不对称二甲基化。I型PRMT及其底物与人类癌症有关，这表明抑制I型PRMTs可能为肿瘤学提供一种治疗方法。目前的报告描述了GSK3368715（EPZ019997），一种在人类癌症模型中具有抗肿瘤作用的强效、可逆的I型PRMT抑制剂。当与GSK3368715组合时，对主要II型PRMT PRMT5的抑制产生协同的癌症细胞生长抑制。有趣的是，甲硫腺苷磷酸化酶基因（MTAP）的缺失导致代谢产物2-甲硫腺苷（PRMT5的内源性抑制剂）的积累，并与细胞系对GSK3368715的敏感性相关。这些数据为探索MTAP状态作为患者选择的生物标志物策略提供了理论基础[2]。

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研究人员发现，PRMT5特异性抑制剂GSK3326595能够显著减少ACE2与RBD的结合。此外，我们发现meR671-ACE2在ACE2与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型奥密克戎、德尔塔和贝塔变异株的Spike1结合中起着重要作用；我们发现GSK3326595强烈减弱了ACE2与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型奥密克戎、德尔塔和贝塔变异株的Spike1的相互作用。最后，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型假病毒感染检测发现，PRMT5介导的meR671-ACE2对人类细胞中严重急性呼吸综合征冠状病毒2中的感染至关重要，假病毒感染实验证实，GSK3326595可以强烈抑制宿主细胞的严重急性呼吸系综合征冠状病毒-2感染。这些发现表明，作为治疗几种癌症的临床II期药物，GSK3326595是一种有前景的候选者，可以通过抑制ACE2甲基化和ACE2-Spike1相互作用来减少严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型感染[4]。

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1. 在携带ATM和/或TP53突变的套细胞淋巴瘤（MCL）细胞系中，GSK3326595处理可诱导DNA损伤标志物γH2AX聚集（通过ImageJ定量）；实时荧光定量PCR检测显示其可下调DNA损伤修复（DDR）通路基因（AR、DNAPK、NHEJ1、RAD51）的表达；反转录PCR（RT-PCR）发现其可改变MDM4 mRNA的剪接模式；恢复野生型p53的表达及功能，实时荧光定量PCR证实其可上调p53靶基因（MDM2、p21、PUMA）的表达，流式细胞术分析显示其可诱导细胞凋亡。在复发/难治性（R/R）MCL患者的原代细胞中，GSK3326595（两倍梯度稀释，处理3天）可降低细胞活力（通过CellTiter-Glo法检测）[1]
2. 在巯基乙酸诱导的腹腔巨噬细胞中，GSK3326595（100 μM，处理12小时）联合γ干扰素（IFN-γ，100 ng/mL）刺激可升高M1/M2基因标志物比值；qPCR检测显示M1型标志物（TNF-α、IL-1β、iNOS、MHCII、IP-10）的mRNA表达上调，免疫分析证实IP-10蛋白分泌增加；iNOS（M1型）和ARG1（M2型）蛋白表达无显著变化[3]
3. 在过表达ACE2的HEK-293T和A549细胞中，GSK3326595（100 nM，处理48小时）可抑制PRMT5介导的ACE2第671位精氨酸的对称性二甲基化（meR671-ACE2，通过免疫共沉淀和Western blot检测）；降低ACE2与SARS-CoV-2受体结合域（RBD）及奥密克戎、德尔塔、贝塔变异株Spike1蛋白的结合能力（通过免疫沉淀和Western blot评估）；体外甲基化实验证实GSK3326595可阻断PRMT5催化的ACE2 R671位点甲基化；GSK3326595（10-100 nM）可剂量依赖性降低过表达ACE2的HEK-293T和A549细胞中SARS-CoV-2假病毒的感染效率[4]
4. 在JHH-7肝癌（HCC）细胞中，GSK3326595（100-1000 nM，处理24小时）可上调Cdkn1b/p27（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B）的mRNA和蛋白水平（通过qPCR和Western blot检测）；以剂量依赖方式抑制细胞增殖（通过CCK-8法检测）；敲低PRMT5（慢病毒介导的shRNA）可模拟GSK3326595的抗增殖作用，而过表达PRMT5则可逆转该效应；GSK3326595（300 nM）可上调原代肝细胞和JHH-7细胞中MHC II类相关基因的表达（通过qPCR检测）[5]

在 LDL 受体敲除小鼠中，GSK3326595（5 mg/kg，腹腔注射，每周 3 次，持续九周）可提高肝脏甘油三酯水平，但不会改变动脉粥样硬化[3]。增强对程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1) 免疫检查点疗法 (ICT) 的抵抗力，对小鼠肝细胞癌 (HCC) 中骨髓瘤转基因启动 (MYC-ON) 疗效较小 [5]。 GSK3326595 口服给药，每日一次，持续两周。

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鉴于炎症和代谢在动脉粥样硬化性心血管疾病中的重要作用，我们在这里使用特异性PRMT5抑制剂GSK3326595研究了PRMT5在动脉粥样硬化中的作用。将培养的巯基乙酸诱导的腹腔巨噬细胞暴露于GSK3326595或DMSO对照，并用1 ng/mL LPS或100 ng/mL干扰素γ刺激24小时。此外，雄性低密度脂蛋白（LDL）受体敲除小鼠喂食致动脉粥样硬化的西式饮食，每周3次腹腔注射低剂量的5 mg/kg GSK3326559或溶剂对照9周。在体外，GSK3326595使腹腔巨噬细胞对干扰素γ诱导的M1极化产生反应，M1/M2基因标记物比率的增加证明了这一点。相比之下，GSK3326595处理的小鼠腹腔巨噬细胞中iNOS（M1标记）和ARG1（M2标记）的蛋白表达没有差异。此外，未检测到T细胞活化状态或动脉粥样硬化易感性的变化。然而，慢性GSK3326595治疗确实激活了参与肝脏脂肪酸获取的基因，即SREBF1、FASN和CD36（分别为+59%、+124%和+67%；p<0.05），并显著增加了肝脏甘油三酯水平（+50%；p<0.05）。低剂量GSK3326595治疗对PRMT5的抑制不会影响西式饮食喂养的LDL受体敲除小鼠的炎症状态或动脉粥样硬化易感性，但会诱导肝脏甘油三酯积聚。因此，在使用这种PRMT5抑制剂进行慢性治疗时，应考虑肝脏的严重副作用，即非酒精性脂肪肝的发展。[3]

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1. 在携带Granta-519或Maver-1 MCL移植瘤（ATM/TP53突变）的NSG小鼠中，每日灌胃给予GSK3326595（100 mg/kg）可显著降低肿瘤体积（双因素方差分析，P<0.05）和肿瘤重量（双尾t检验，P<0.05）；肿瘤组织Western blot检测显示PRMT5和H4R3me2s表达降低，p53和p21表达升高。在PRMT5敲除的Granta-519移植瘤模型中，肿瘤生长被显著抑制。在携带TP53突变或CD19 CAR-T治疗后复发的MCL患者来源的异种移植（PDX）模型中，GSK3326595（100 mg/kg，每日给药）可显著降低肿瘤大小和重量，且肿瘤组织中PRMT5/p53/p21表达发生相应改变[1]
2. 在饲喂西式饮食的低密度脂蛋白受体敲除雄性小鼠中，GSK3326595（5 mg/kg，腹腔注射，每周3次，持续9周）处理后，动脉粥样硬化病变面积、病变区巨噬细胞含量及斑块胶原含量无显著变化（油红O、MOMA、Masson三色染色）；T细胞活化状态（血液/腹腔/脾脏中CD4+/CD8+ T细胞亚群，流式细胞术检测）无改变；但肝脏甘油三酯水平升高50%（P<0.05），肝脏脂肪酸摄取相关基因（SREBF1、FASN、CD36）的表达分别上调59%、124%和67%（P<0.05）[3]
3. 在MYC过表达的自发性肝癌转基因小鼠中，GSK3326595（50 mg/kg，每日灌胃，持续12周）可减少肿瘤结节数、降低肝脏重量及血清ALT/AST水平（P<0.05）；MYC激活8周后给予GSK3326595（50或100 mg/kg，持续2周）也可降低肿瘤负荷，减少肝脏SDMA水平（P<0.01），上调p27表达。联合抗PD-1抗体（200 μg，腹腔注射，每3天1次，持续2周）时，GSK3326595（25/50 mg/kg每日）可进一步降低MYC驱动型肝癌小鼠的肿瘤体积/重量；在Hepa1-6和H22肝癌移植瘤模型中，GSK3326595（50 mg/kg每日）联合抗PD-1可增强抗肿瘤疗效，增加肿瘤浸润淋巴细胞数量[5]

高通量筛选[2]
I型PRMT抑制剂是通过筛选Epizyme的专有HMT偏向文库发现的（Mitchell等人，2015）。总之，将化合物与PRMT1在室温下孵育30分钟（384孔板），并在加入SAM和肽后引发反应。最终测定条件为0.75 nM PRMT1（NP_001527.3，GST-PRMT1氨基酸1-371）、200 nM 3H-SAM（比活性80 Ci/mmol）、1.5μM SAM和20 nM肽（Biotin-Ahx-RLARRGGVKRISGLI-NH2，21st Century Biochemicals）在20 mM bincine（pH 7.6）、1 M TCEP、0.005%牛皮明胶、0.002%Tween-20和2%DMSO中的溶液。通过添加SAM（最终400μM）来猝灭反应。将终止的反应转移到Streptavidin包被的Flashplate中，孵育至少1小时，然后使用Biotek ELx405洗板器用0.1%Tween-20洗涤板。使用PerkinElmer TopCount平板读取器测量结合到闪板上的3H肽的量。

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PRMT生化分析[2]
所有测定均在96孔板中用化合物或DMSO预缓冲（49x，2%最终）进行。PRMT1、PRMT3、PRMT6和PRMT8的测定使用H4 1-21肽和由50mM Tris（pH 8）、0.002%Tween-20、0.5mM EDTA和1mM DTT组成的缓冲液。简言之，Flag-his-tev-PRMT8（61-394）在杆状病毒表达系统中表达，并使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析纯化。对于所有测定，列出的最终腺苷-L-蛋氨酸（SAM）浓度包含未标记的SAM和3H-SAM的混合物。所有反应在加入SAH（最终0.5mM）后终止。[2]
对于竞争研究，将底物加入到复合板中，然后加入酶。对于SAM竞争研究，最终测定浓度由2 nM PRMT1、40 nM肽和滴定SAM（50-8000 nM）组成。对于肽竞争研究，最终测定浓度由2 nM PRMT1、1000 nM和滴定肽（1.6-1000 nM）组成。在骤冷之前，将反应物在室温下孵育18分钟。[2]
对于时间依赖性研究，将酶/SAM混合物添加到化合物板中，并在添加肽之前孵育3-60分钟。对于无预培养测定，将肽加入到化合物板中，然后加入酶/SAM混合物以引发反应。最终PRMT1测定浓度为0.5 nM PRMT1、40 nM肽和1100 nM SAM。反应在室温下孵育20分钟，然后淬灭。

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体外甲基化实验：将纯化的GST标签融合蛋白GST-ACE2-WT（601-744位氨基酸）或GST-ACE2-R671K（601-744位氨基酸）与Myc-PRMT5、SAM（1 μM/μl）共同孵育；采用抗SDMA抗体通过Western blot检测ACE2的SDMA甲基化水平，考马斯亮蓝染色显示总蛋白水平。向反应体系中加入GSK3326595，评估其对PRMT5介导的ACE2甲基化的抑制作用[4]

蛋白质印迹分析[4]
细胞类型： HEK-293T 细胞、A549 细胞
测试浓度： 10 nM、25 nM、50 nM、100 nM
孵育时间：48小时
实验结果：低浓度下强烈抑制ACE2-RBD相互作用。抑制 SARS-CoV -2 Omicron 和其他变体 Spike1 与 ACE2 的结合。抑制 SARS-CoV-2 刺突假病毒感染宿主细胞。

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细胞毒性测定[1]
细胞类型： MCL 细胞
测试浓度： 0.15 μM、0.3 μM、0.6 μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM
孵育时间：72 小时
实验结果：对 MCL 细胞产生适度的生长抑制。

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1. MCL细胞活力实验：将MCL细胞系（Granta-519、Maver-1、Z-138、JVM-2）用两倍梯度稀释的GSK3326595处理6天；将复发/难治性MCL患者的原代细胞用两倍梯度稀释的GSK3326595处理3天；采用CellTiter-Glo法检测细胞活力[1]
2. DNA损伤检测实验：MCL细胞系经GSK3326595处理后固定，用抗γH2AX抗体进行免疫荧光染色；通过ImageJ定量γH2AX灶点数量（标尺=20 μm）[1]
3. 凋亡分析实验：MCL细胞系经GSK3326595或LLY-283处理后，用凋亡特异性染料染色，流式细胞术分析细胞凋亡情况[1]
4. 巨噬细胞极化实验：巯基乙酸诱导的腹腔巨噬细胞经GSK3326595（100 μM）或DMSO处理12小时后，用LPS（1 ng/mL）或IFN-γ（100 ng/mL）刺激24小时；qPCR检测M1/M2型标志物的mRNA表达，免疫分析检测IP-10蛋白分泌；流式细胞术分析处理后小鼠的原代腹腔巨噬细胞中iNOS/ARG1蛋白表达[3]
5. ACE2甲基化及结合实验：向HEK-293T/A549细胞中转染Flag-ACE2、Myc-PRMT5和GFP-RBD；细胞经GSK3326595（100 nM）处理48小时后，用抗Flag/抗GFP抗体进行免疫共沉淀；Western blot检测ACE2的SDMA修饰、PRMT5-ACE2相互作用及ACE2-RBD结合情况[4]
6. 肝癌细胞增殖实验：JHH-7细胞经100 nM、300 nM、500 nM、1000 nM浓度的GSK3326595处理24小时；CCK-8法检测细胞增殖情况。在PRMT5敲低/过表达实验中，JHH-7细胞感染慢病毒shPRMT5或pcDNA-PRMT5后培养，分析细胞增殖及基因/蛋白表达水平[5]
7. MHC II类基因表达实验：原代肝细胞和JHH-7细胞经GSK3326595（300 nM）处理后提取总RNA，实时荧光定量PCR检测MHC II类相关基因的表达[5]

动物/疾病模型： LDL受体敲除小鼠[3]
剂量： 5 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)
实验结果： 未改变动脉粥样硬化易感性。肝脏甘油三酯水平升高，但高脂血症程度未改变。激活了参与脂肪酸吸收的基因。

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动物/疾病模型： 骨髓细胞瘤转基因小鼠[5]
剂量： 25 mg/kg，50 mg/kg
给药途径： 口服
实验结果： 50 mg/kg剂量下显著抑制肿瘤生长。在 25 mg/kg 剂量下显示出更好的治疗效果。

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1. MCL 异种移植模型：将 Granta-519 或 Maver-1 MCL 细胞皮下植入 NSG 小鼠；肿瘤形成后，将小鼠随机分为载体组和GSK3326595组（100 mg/kg，每日口服给药）；每隔几天测量肿瘤体积，并绘制其随治疗时间变化的曲线（n=5）；在治疗终点，切除肿瘤并称重，并对肿瘤组织进行蛋白质印迹分析。对于 PRMT5 KO 模型，将 PRMT5 敲除的 Granta-519 细胞植入 NSG 小鼠体内，并以类似的方式监测肿瘤生长[1]
2. MCL PDX 模型：从携带 TP53 突变或 CD19 CAR-T 治疗后复发的 MCL 患者建立 PDX 模型； PDX 小鼠接受 GSK3326595（100 mg/kg，每日口服，n=5）治疗；在不同时间点测量肿瘤大小，并在终点分析肿瘤重量/蛋白质表达[1]
3. 动脉粥样硬化模型：雄性 LDL 受体敲除小鼠喂食西式饮食 9 周；GSK3326595 溶解于 DMSO 溶剂中，以 5 mg/kg 的剂量腹腔注射，每周 3 次；测量体重、血浆胆固醇/甘油三酯水平和组织甘油三酯水平（棕色脂肪组织、白色脂肪组织、肝脏）；对主动脉根部冷冻切片进行染色以评估动脉粥样硬化病变[3]
4. HCC 转基因模型：MYC-ON 转基因小鼠（自发性 HCC）接受 GSK3326595（50 mg/kg 或 100 mg/kg，每日口服）治疗 2 周（MYC 激活 8 周后）或 12 周；测量肝脏肿瘤数量、重量和血清 ALT/AST 水平；在某些组（治疗 4 周，50 mg/kg 剂量）中使用 MRI 评估肿瘤体积。联合治疗中，小鼠接受GSK3326595（每日25/50 mg/kg）联合抗PD-1抗体（200 μg，每3天腹腔注射一次，持续2周）[5]
5. HCC异种移植模型：将Hepa1-6和H22 HCC细胞皮下移植到C57BL/6J小鼠体内；小鼠接受GSK3326595（每日口服50 mg/kg）联合抗PD-1抗体（200 μg，每3天腹腔注射一次，持续1周）治疗；分析肿瘤体积/重量和肿瘤浸润免疫细胞[5]

1. 在接受GSK3326595（5 mg/kg，每周3次，持续9周）治疗的LDL受体敲除小鼠中，未观察到明显的毒性，但肝脏甘油三酯水平升高了50%（P<0.05），表明可能存在肝脏脂质代谢紊乱；未检测到体重或血浆胆固醇/甘油三酯水平的变化[3]
2. 在接受GSK3326595（每日50/100 mg/kg）治疗的MYC驱动的HCC小鼠中，血清ALT/AST水平降低（表明肝功能改善）[5]

[1]. Exploiting PRMT5 as a target for combination therapy in mantle cell lymphoma characterized by frequent ATM and TP53 mutations. Blood cancer journal, 2023, 13(1): 27.

[2]. Anti-tumor activity of the type I PRMT inhibitor, GSK3368715, synergizes with PRMT5 inhibition through MTAP loss. Cancer cell, 2019, 36(1): 100-114. e25.

[3]. PRMT5 inhibition induces pro‐inflammatory macrophage polarization and increased hepatic triglyceride levels without affecting atherosclerosis in mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2023, 27(8): 1056-1068.

[4]. GSK3326595 is a promising drug to prevent SARS-CoV-2 Omicron and other variants infection by inhibiting ACE2-R671 di-methylation. Journal of Medical Virology, 2023, 95(1): e28158.

[5]. Myelocytomatosis-protein arginine N-methyltransferase 5 Axis defines the tumorigenesis and immune response in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2021, 74(4): 1932-1951.

培美司他是一种口服的选择性小分子蛋白精氨酸甲基转移酶5 (PRMT5) 抑制剂，具有潜在的抗增殖和抗肿瘤活性。尽管其作用机制尚未完全阐明，但口服培美司他后可与PRMT5的底物识别位点结合，抑制其甲基转移酶活性，从而降低组蛋白H2A、H3和H4中单甲基化和二甲基化精氨酸残基的水平，并调节参与多种细胞过程（包括细胞增殖）的基因表达。因此，该药物可能增加抗增殖基因的表达和/或降低促进细胞增殖基因的表达，从而导致包括癌细胞在内的快速增殖细胞的生长减缓。 PRTM5 是一种精氨酸甲基转移酶，能够催化组蛋白和多种其他蛋白质底物上 ω-N 单甲基精氨酸 (MMA) 和对称二甲基精氨酸 (sDMA) 的形成，在多种肿瘤中过度表达。

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1. GSK3326595 是一种特异性 PRMT5 抑制剂；在伴有 ATM/TP53 突变的复发/难治性套细胞淋巴瘤 (R/R MCL) 中，PRMT5 表达上调，且与预后不良相关；联合靶向 PRMT5（使用GSK3326595）和 ATR/CDK4 抑制剂在 MCL 中显示出协同抗肿瘤作用[1]
2. GSK3326595抑制 PRMT5 介导的 ACE2-R671 二甲基化，从而减少 ACE2 N-糖基化及其与 SARS-CoV-2 Spike1 蛋白（包括 Omicron/Delta/Beta 变体）的结合，进而抑制病毒感染；GSK3326595是一种针对多种癌症的 II 期临床药物，也是预防 SARS-CoV-2 感染的潜在候选药物[4]
3. 在 MYC 驱动的 HCC 中，PRMT5 是 MYC 的直接靶基因； GSK3326595抑制PRMT5，上调p27（抑制细胞增殖）并促进MHC II表达/淋巴细胞浸润（增强抗肿瘤免疫）；GSK3326595与抗PD-1联合用药可提高“免疫冷”肝细胞癌的疗效[5]

C24H32N6O3

452.55

452.253

C, 63.70; H, 7.13; N, 18.57; O, 10.61

1616392-22-3

1848944-46-6 (succinate); 1616392-22-3

90241742

Typically exists as white to light yellow solids at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

760.3±60.0 °C at 760 mmHg

413.6±32.9 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.626

2.88

111Ų

3

7

7

33

656

1

O([H])[C@@]([H])(C([H])([H])N([H])C(C1=C([H])C(=NC([H])=N1)N([H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C(C([H])([H])[H])=O)C([H])([H])C1([H])[H])=O)C([H])([H])N1C([H])([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C([H])([H])C1([H])[H]

JLCCNYVTIWRPIZ-NRFANRHFSA-N

InChI=1S/C24H32N6O3/c1-17(31)30-10-7-20(8-11-30)28-23-12-22(26-16-27-23)24(33)25-13-21(32)15-29-9-6-18-4-2-3-5-19(18)14-29/h2-5,12,16,20-21,32H,6-11,13-15H2,1H3,(H,25,33)(H,26,27,28)/t21-/m0/s1

(S)-6-((1-acetylpiperidin-4-yl)amino)-N-(3-(3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)-2-hydroxypropyl)pyrimidine-4-carboxamide

EPZ-015938; EPZ 015938; EPZ015938; GSK3326595; 1616392-22-3; GSK-3326595; Pemrametostat; 6-[(1-acetylpiperidin-4-yl)amino]-N-[(2S)-2-hydroxy-3-(1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-2-yl)propyl]pyrimidine-4-carboxamide; EPZ015938; (S)-6-((1-acetylpiperidin-4-yl)amino)-N-(3-(3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)-2-hydroxypropyl)pyrimidine-4-carboxamide; GSK-3326595A; Pemrametostat; GSK3326595; GSK 3326595; GSK-3326595;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.52 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.52 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.60 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.60 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 20.8mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.60 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: 2.2mg/mL in10% DMSO : 40% PEG300 : 5% Tween80 + : 45% saline

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。