HAMNO (NSC111847)

RPA/replication protein A

HAMNO 是一种新型的复制蛋白 A (RPA) 蛋白相互作用抑制剂。 ATR/Chk1 通路包括 RPA。在两种 HNSCC 细胞系中，HAMNO 在低微摩尔浓度下均能抑制集落形成。与单独使用 HAMNO 相比，HAMNO 和依托泊苷显着抑制集落形成。 UMSCC38 细胞暴露于 HAMNO 后，全核 -H2AX 染色会出现剂量依赖性增加。癌细胞系 UMSCC11B 和癌细胞系 UMSCC38 均表现出强 -H2AX 染色，特别是在与 20 M HAMNO 孵育后。添加 HAMNO 后，UMSCC38 和 OKF4 细胞的 -H2AX 染色均增加，其中 S 期信号增加最多[1]。

HAMNO 可减缓小鼠 UMSCC11B 肿瘤的生长。用 20 M 依托泊苷处理两小时后，ATR 底物 RPA32 的 Ser33 被严重磷酸化。这种磷酸化随着 2 M HAMNO 的添加而减少，并且在较高浓度下几乎不存在，这证明了 HAMNO 作为 ATR 引起的 RPA32 磷酸化抑制剂的体内作用[1]。

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为了进一步研究HAMNO作为抗癌药物的潜力，我们在小鼠异种移植物模型中测试了HAMNO。在小鼠中，HAMNO减缓了UMSCC11B肿瘤的进展（图4C）。在与亚致死性依托泊苷联合治疗的小鼠以及类似治疗的UMSCC38细胞中也观察到这种抑制作用（图4D，E）。这些结果提出了一种令人兴奋的可能性，即单独使用DBD-F抑制剂可以减少肿瘤或使肿瘤细胞对其他化疗药物敏感[1]。 HAMNO对DBD-F具有选择性[1]
HAMNO（图1A）首先在高通量筛选中被鉴定为RPA DBD-F抑制剂，该筛选确定了小分子从RPA ssDNA复合物中解离Rad9-GST融合蛋白的能力，这种相互作用需要DBD-F。通过计算机模拟方法进一步研究了HAMNO与DBD-F的结合（图1B）。这些研究利用了DBD-F的晶体结构，该结构早些时候针对与体外DBD-F抑制剂富马酸（FPA）的结合进行了优化。预测亲和力最高的位点位于DBD-F上紧邻R43的位置（图1B：右图），该化合物将预测性地阻碍蛋白质相互作用，因为该残基对DBD-F蛋白质结合至关重要。

为了确认HAMNO与DBD-F在体外的相互作用，我们利用DBD-F弱结合标记寡核苷酸的能力，并使用EMSA寻找HAMNO存在下复合物的流动性和强度的变化（图1C）。在没有DBD-F的情况下，HAMNO不结合标记的寡核苷酸（图1C：左图）。在DNA和DBD-F存在的情况下，添加HAMNO会导致游离ssDNA和蛋白质结合ssDNA带之间形成带。（图1C：右侧面板；用星号表示）。由于HAMNO在中性pH下不带电，因此化合物单独与蛋白质-DNA复合物结合不太可能导致在凝胶上检测到这种新形成的条带。相反，HAMNO对DBD-F与DNA结合的刺激表明，小分子与DBD-F直接相互作用，导致构象转变，改变了DNA结合。

然后，我们想确认HAMNO仅选择性抑制DBD-F，而不是DBDs-A-E，后者在RPA与ssDNA结合中很重要。这种选择性将确保HAMNO对蛋白质募集的影响比ssDNA结合更不利。为了确定这一点，我们利用了RPA的DNA解旋活性，该活性依赖于DBD-F，但不需要DBD-F来稳定结合形成的ssDNA。为此，我们使用ssDNA和dsDNA探针将EMSA与全长RPA结合使用。HAMNO在浓度高达200μM时不影响RPA与ssDNA的结合，但在100μM时阻止dsDNA解旋和随后的ssDNA结合（图1D）。HAMNO对dsDNA解旋的抑制作用几乎与我们之前鉴定的体外抑制剂FPA相当，FPA随后对DBD-F的解离常数为9.0μM。这些数据一起显示了HAMNO在微摩尔水平上选择性抑制DBD-F的偏好，这种能力将预测性地靶向复制应激的癌症细胞中的复制应激反应，而不是正常细胞。

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HAMNO以细胞周期特异性方式诱导γ-H2AX染色[1]
DBD-F结合ATRIP、Rad9、Rad17和Nbs1，从而招募并稳定参与ATR激活的蛋白质。抑制DBD-F-与这些蛋白质的相互作用可能会使ATR信号短路，导致复制应激增加，这可以通过S期H2AX的泛核磷酸化来监测。这种磷酸化已被证明是S期特异性的，正如之前用Chk1抑制剂所证明的那样，与双链断裂时出现的点状病灶不同。我们通过泛核γ-H2AX染色的增加来评估HAMNO是否诱导复制应激（图2A）。UMSCC38细胞暴露于HAMNO后，泛核γ-H2AX染色以剂量依赖的方式增加（图2A，B）。当通过蛋白质印迹评估H2AX磷酸化时，癌症来源的UMSCC38细胞以及另一种癌症细胞系UMSCC11B具有显著的γ-H2AX染色，特别是在与20μM HAMNO孵育后。相反，在这种浓度下，端粒化的角质形成细胞系OKF4没有显示出增强的γ-H2AX染色，这表明HAMNO在癌症细胞系中更有效地诱导H2AX磷酸化，这些细胞系在致癌诱导的应激中增强。为了进一步验证泛核γ-H2AX代表复制应激，并且HNSCC细胞和OKF4细胞之间复制应激的差异是S期特异性的，我们采用了流式细胞术。为了测量细胞周期特异性γ-H2AX染色，我们在没有HAMNO作为阴性对照的情况下对细胞进行了检测，该阴性对照确定了每个细胞周期阶段γ-H2AX阳性和γ-H2AZ阴性细胞之间的阈值（图2D）。加入HAMNO后，UMSCC38和OKF4细胞的γ-H2AX染色均增加，S期信号增加最大（图2D）。进一步比较两种细胞系，在20μM和50μM时，UMSCC38细胞中S期γ-H2AX阳性细胞与γ-H2AZ阴性细胞的比例分别是OKF4细胞的六到八倍（图2E）。这些数据表明，HAMNO在S期选择性地增加了γ-H2AX染色，表明复制应激增加。这些数据还表明，预测具有高水平癌基因诱导应激的细胞，如突变型p53鳞状细胞癌细胞，被HAMNO选择性增强以增加复制应激。

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HAMNO影响RPA和ATR磷酸化[1]
HAMNO对DBD-F的抑制有望通过抑制DBD-F与参与激活ATR的复制应激反应蛋白的相互作用来直接抑制RPA32磷酸化。我们在增强RPA32 Ser33磷酸化的条件下测试了这一假设（图3A）。ATR底物RPA32的Ser33在用20μM的依托泊苷处理两小时后高度磷酸化，加入2μM的HAMNO后，其磷酸化程度降低，在较高浓度下几乎不存在，这表明HAMNO作为ATR对RPA32磷酸化的抑制剂具有体内作用。

在HAMNO处理的细胞中，γ-H2AX染色的增加和RPA磷酸化的减少表明ATR信号传导的失调。为了进一步描述这种感受态DNA损伤反应（DDR）信号的丧失，我们评估了ATR在T1989的自磷酸化，T1989是ATR活性的标志物（图3C）。正如预期的那样，依托泊苷强烈诱导ATR自磷酸化，而单独用HAMNO治疗显示T1989磷酸化略有增加。有趣的是，与单独使用依托泊苷相比，同时添加依托泊甙和HAMNO会导致ATR自磷酸化减少，这表明ATR活性受到了损害。综上所述，这些数据表明，HAMNO抑制RPA32磷酸化并降低ATR自磷酸化，表明HAMNO能够影响ATR信号传导。

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HAMNO增强依托泊苷的毒性[1]
HAMNO抑制ATR信号传导的能力表明该化合物可能具有细胞毒性，并使细胞对DNA损伤剂敏感。在低微摩尔范围内，单独使用HAMNO抑制了两种HNSCC细胞系的集落形成（图4A）。接下来，我们比较了在有或没有初始20μM/2小时暴露于依托泊苷的情况下，在HAMNO浓度增加的情况下UMSCC38细胞的集落形成（补充图S1）。当这两种情况标准化为0μM HAMNO治疗时，HAMNO联合依托泊苷对集落形成的抑制程度明显高于单独使用HAMNO（图4B）。

与 HAMNO (2、20、50 μM) 孵育 2 小时并在 70% 乙醇中固定过夜后，在 UMSCC38 和 OKF4 细胞中监测细胞周期评估和 γ-H2AX 染色。用 PBS 洗涤细胞，并在含有 1% BSA、10% 山羊血清和 PS139-H2AX 抗体的 PBS 中孵育过夜，洗涤并在山羊抗小鼠 Alexa Fluor 647 抗体中室温孵育 30 分钟。将细胞在 50 μg/mL 碘化丙啶和 100 μg/mL RNase A 中孵育 30 分钟，每个样品分析 10,000 个细胞[1]。

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细胞和克隆试验[1]
鳞状细胞癌细胞系UMSCC38和UMSCC11B在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中增殖。将永生化的原代口腔角质形成细胞系OKF4在含有10%胎牛血清的强化KBM-2培养基中增殖。对于克隆形成试验，将细胞胰蛋白酶化并在培养基中稀释至1000个细胞/mL，然后分散到60mm培养皿（3mL）中过夜。加入HAMNO后，细胞生长9天，然后在含有6%戊二醛的PBS中固定30分钟，然后在0.5%结晶紫中染色30分钟并冲洗。计数含有50多个细胞的菌落。对于需要依托泊苷的研究，在加入2μM依托泊甙前一小时加入HAMNO。在暴露于依托泊苷2小时后，取出培养基并用PBS冲洗，然后再加入含有HAMNO的培养基。使用非配对双侧Student t检验对数据进行分析，以确定统计显著性。

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流式细胞术[1]
用HAMNO孵育2小时后，在UMSCC38和OKF4细胞中监测细胞周期评估和γ-H2AX染色，并在70%乙醇中固定过夜。用PBS洗涤细胞，并在含有1%BSA、10%山羊血清和PS139-H2AX抗体的PBS中孵育过夜，在室温下用山羊抗小鼠Alexa Fluor 647抗体洗涤并孵育30分钟。将细胞在50μg/mL碘化丙啶和100μg/mL RNase A中孵育30分钟，在BD FACSray上使用532和635 nm激发分析每个样品的10000个细胞，并用585/42 nm和661/16 nm的滤光片收集荧光发射（分别为黄色和红色参数）。BD FACSarray和WinList™（ 软件分别用于数据收集和分析。

本研究采用裸胸腺小鼠。将肿瘤细胞（2～610⁵个细胞溶于100 mL无菌PBS）皮下注射至6周龄雌性小鼠体内，以植入UMSCC38和UMSCC11B细胞。每日使用游标卡尺测量肿瘤体积[肿瘤体积=1/2(长×宽²)]，以监测肿瘤生长速度。当肿瘤生长至50 mm³时，连续三天腹腔注射依托泊苷（10 mg/kg）和HAMNO（2 mg/kg）。比较各实验组的肿瘤体积，并每日追踪肿瘤大小。每组至少包含三只小鼠[1]。

[1]. RPA inhibition increases replication stress and suppresses tumor growth. Cancer Res. 2014 Sep 15;74(18):5165-72.

ATR/Chk1通路是一个关键的监控网络，它通过在正常复制过程中稳定复制叉来维持DNA复制过程中的基因组完整性，从而避免复制压力。正常细胞和癌细胞之间的众多差异之一是复制过程中发生的复制压力的程度。癌基因激活的癌细胞会产生更高水平的复制压力。这使得癌细胞对ATR/Chk1通路的依赖性增强，并为通过抑制该通路来优先杀死癌细胞提供了机会。为了支持这一观点，我们发现了一种名为HAMNO（(1Z)-1-[(2-羟基苯胺基)亚甲基]萘-2-酮）的小分子，它是一种新型的复制蛋白A (RPA)蛋白相互作用抑制剂，RPA是ATR/Chk1通路中参与的蛋白。HAMNO选择性地结合RPA70的N端结构域，有效抑制依赖于该结构域的关键RPA蛋白相互作用。HAMNO既抑制ATR的自身磷酸化，也抑制ATR对RPA32 Ser33的磷酸化。 HAMNO 单独使用时，会在已处于复制应激状态的癌细胞中产生 DNA 复制应激，但不会对正常细胞产生这种影响。它与依托泊苷协同作用，可在体外杀死癌细胞，并在体内减缓肿瘤生长。因此，HAMNO 表明 RPA 抑制剂可作为癌症治疗的候选药物，通过靶向癌细胞对复制应激的不同反应，实现疾病选择性治疗。Cancer Res; 74(18); 5165-72. [1]

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HAMNO 与依托泊苷的协同作用证明了诱导复制应激并降低复制应激反应以选择性地增加具有组成型 DNA 复制应激的癌细胞死亡的有效策略。这种方法在临床上具有优势，因为添加 RPA 抑制剂可以提高治疗效果并减少不良副作用。由于HAMNO能够选择性地增强已存在癌基因诱导的复制应激的癌细胞的细胞毒性，因此它也具有作为独立药物的潜力。
这是首个体内研究，表明RPA DBD-F抑制剂具有作为癌症化疗药物的潜力。HAMNO能够单独诱导细胞毒性，并与依托泊苷协同杀伤细胞，这表明HAMNO可以单独使用，也可以与其他化疗药物联合使用。在影响肿瘤生长的剂量下，HAMNO在小鼠体内具有良好的耐受性，这证明了该化合物的临床应用潜力。HAMNO的结构允许添加和取代许多可能提高其与DBD-F亲和力的部分。我们目前正在测试几种HAMNO衍生物，以期提高其对DBD-F的抑制作用。[1]

C17H13NO2

263.3

263.095

C, 77.55; H, 4.98; N, 5.32; O, 12.15

138736-73-9

138736-73-9

85895

Solid powder

3.514

49.33

2

3

2

20

344

0

OC1C=CC2C=CC=CC=2C=1/C=N/C1C=CC=CC=1O

NADCEWZYITXLKJ-KAMYIIQDSA-N

InChI=1S/C17H13NO2/c19-16-10-9-12-5-1-2-6-13(12)14(16)11-18-15-7-3-4-8-17(15)20/h1-11,18,20H/b14-11-

HAMNO; CID 6335338; NSC-111847; HAMNO; 138736-73-9; 894-93-9; 2(1H)-Naphthalenone, 1-[[(2-hydroxyphenyl)amino]methylene]-; NSC111,847; 137320-35-5; 1-(((2-Hydroxyphenyl)imino)methyl)-2-naphthol; 1-(((2-Hydroxyphenyl)amino)methylene)naphthalen-2(1H)-one; NSC111847; NSC111847; MLS000737724;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (9.50 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。