Hibifolin   中文名称: 棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

ADA (adenosine deaminase) (Ki = 49.92 μM)

确定了Hibifolin在钙动员中的作用。在培养的神经元中，应用Aβ后，细胞内Ca2+水平增加了约2倍，并持续了几分钟。钙离子载体A23187作为Ca2+升高的对照（图2A）。为了揭示Aβ诱导的Ca2+内流与hibifolin神经保护机制之间的相关性，在测量细胞内Ca2+之前，用黄酮醇预处理培养的神经元24小时。有趣的是，hibifolin预处理使Aβ诱导的Ca2+量减少了70%以上（图2A）。此外，Hibifolin本身在治疗后不会引发任何Ca2+动员。这些结果表明，Aβ诱导的Ca2+升高是介导细胞死亡的信号通路之一，Hibifolin可以部分阻断这一作用。作为对照，细胞渗透性Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理3小时可减少aβ诱导的细胞死亡（图2B），这表明细胞内Ca2+确实是aβ诱导细胞死亡的下游介质之一。[1]

在培养的皮质神经元中，Aβ的应用导致切割的胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7（均为约16 kDa）增加约2倍（图3A）；然而，Hibifolin的预处理完全阻止了这种切割（图3A和B）。同样地，经预处理的Hibiflon被证明可以阻断由Aβ引发的DNA断裂（图3C）。一般的凋亡诱导剂星孢菌素作为两种检测的对照。这些结果表明，hibifolin通过阻断Aβ诱导的细胞凋亡来发挥其神经保护作用。[1]

除了上述保护机制外，Akt通路已被证明可以介导神经营养和抗凋亡作用[18]。因此，我们针对Akt信号在Hibifolin神经保护中的作用。通过使用针对T308和S473位置的抗体来测定Akt的磷酸化。结果显示，应用Hibifolin以时间依赖的方式诱导Akt在T308和S473（约60 kDa）的磷酸化至约2倍（图4）。Akt的总量（约60kDa）没有变化。因此，hibifolin对Akt磷酸化的活性可能是其对Aβ诱导的细胞死亡具有保护作用的另一种解释[2]。

如前所述，对皮质神经元进行了改良培养。简而言之，从胚胎第18天的大鼠身上解剖皮层，并进行胰蛋白酶消化。分离的皮质神经元在37°C、5%CO2的加湿培养箱中，在含有B27和0.5 mM GlutaMax的神经基础培养基中生长。在培养的第三天用2.5μM阿糖胞苷处理培养物，以消除神经胶质细胞。治疗前培养原代皮质神经元2周。将未聚集的Aβ（Aβ1-40）溶解在水中，在37°C下孵育4天。使用老化的Aβ和Aβ的活性片段（Aβ25-35）进行毒性试验。用10μM Aβ（老化Aβ或Aβ25-35）处理96孔板中培养的皮质神经元24小时。然后在PBS中加入3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-溴化二苯四氮唑（MTT；0.5 mg/ml）2小时，吸出培养基，用DMSO重新悬浮培养物，通过测量570 nm处的吸光度来确定细胞存活率。为了测量乳酸脱氢酶（LDH），将培养物按照存活率测定进行处理。处理后，收集条件培养基，在25°C下离心14000 rpm 5分钟。将上清液加入细胞毒性检测试剂盒，在室温下孵育20分钟，然后在490 nm处测定吸光度。在阻断实验中，在添加Aβ之前，用DMSO（对照，1/2000稀释）或Hibifolin（0.5、5和50μM）预处理培养物24小时，或用1,2-双（邻氨基苯氧基）乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸四（乙酰氧基甲基）酯（BAPTA-AM；50μM。[1]

根据之前的报告进行了DNA断裂分析。简而言之，在加入Aβ24小时之前，用或不用Hibifolin（0.5、5、50μM）预处理培养的皮质神经元24小时。用10 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM EDTA和1%Triton X-100裂解培养物，在4°C下离心14000 rpm 10分钟。上清液在55°C下用蛋白酶K（0.1 mg/ml）处理1小时，用RNase A（0.2 mg/ml）37°C处理30分钟，然后用苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）提取，然后在300 mM乙酸钠的存在下用异丙醇沉淀。通过琼脂糖凝胶电泳对断裂的DNA进行可视化。

为了检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在添加Aβ24和48小时之前，在12孔板中用或不用Hibifolin（50μM）预处理2周龄的培养皮层神经元24小时。使用Staurosporin（1μM）作为对照诱导凋亡。为了检测Akt，将12孔板中2周龄的皮质神经元用神经基底培养基或含有河豚毒素（100 nM）的DMEM饥饿3小时，然后用hibifolin（50μM）处理0、5、15分钟。然后立即用含有0.125 M Tris-HCl、pH 6.8、4%SDS、20%甘油、2%巯基乙醇的裂解缓冲液收集培养物，并通过蛋白质印迹分析分析细胞裂解物。这些抗体对切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、总半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶-3、切割的胱氨酸蛋白酶-7、总胱氨酸酶-7、磷酸化Akt S473、磷酸化Akt T308和总Akt具有特异性。根据ECL进行检测。在图像分析仪上比较了对照和药物刺激样品中条带的强度，这些样品在相同的凝胶上和严格标准化的ECL条件下运行，每种情况下都使用由平行凝胶和其中一个样品的连续稀释液构建的校准图。[1]

用2μM Fluo-4-AM在37°C的HEPES缓冲盐水中标记96孔透明底部黑板中的培养皮层神经元1小时，然后通过FlexStation II测定细胞内Ca2+动员的变化。对于阻断实验，在标记过程中加入了50μM的Hibifolin。在加入Aβ后监测Ca2+动员2分钟。数据通过SoftMax Pro 4.7软件进行分析。[1]

阐明了Hibiflon（图1A）在保护培养的皮质神经元免受衰老Aβ或Aβ25-35诱导的细胞死亡方面的作用。通过使用MTT法测定细胞存活率，应用Aβ（老化Aβ或Aβ25-35）24小时导致培养细胞死亡40-50%（补充材料图1S）。同样，在应用aβ（老化的aβ或aβ25-35）后，LDH（细胞死亡的细胞质标志物）释放到培养基中的量显著增加到2倍（补充材料图1S）。通过MTT和LDH测定来量化Hibiflon的保护作用。hibifolin的预处理以剂量依赖的方式预防了Aβ诱导的细胞死亡（图1B，上图）。同时，hibifolin减少了Aβ诱导的皮质神经元LDH的释放（图1B，下图）。刚果红和雌激素作为阳性对照。药物处理的皮质神经元的形态变化也表明了Aβ的毒性和hibifolin的神经保护作用（补充材料图2S）。由于细胞死亡试验中显示的衰老Aβ和Aβ25-35的结果相似，因此在随后的实验中常规使用Aβ25-35。

[1]. Hibifolin, a flavonol glycoside, prevents beta-amyloid-induced neurotoxicity in cultured cortical neurons. Neurosci Lett. 2009 Sep 18;461(2):172-6.

Hibifolin has been reported in Sedum album, Helicteres isora, and Abelmoschus manihot with data available.

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The toxicity of aggregated β-amyloid (Aβ) has been implicated as a critical cause in the development of Alzheimer's disease (AD). Hibifolin, a flavonol glycoside derived from herbal plants, possessed a strong protective activity against cell death induced by aggregated Aβ. Application of hibifolin in primary cortical neurons prevented the Aβ-induced cell death in a dose-dependent manner. In cultured cortical neurons, the pre-treatment of hibifolin abolished Aβ-induced Ca2+ mobilization, and also reduced Aβ-induced caspase-3 and caspase-7 activation. Moreover, DNA fragmentation induced by Aβ could be suppressed by hibifolin. In addition to such protection mechanisms, hibifolin was able to induce Akt phosphorylation in cortical neurons, which could be another explanation for the neuroprotection activity. These results therefore provided the first evidence that hibifolin protected neurons against Aβ-induced apoptosis and stimulated Akt activation, which would be useful in developing potential drugs or food supplements for treating AD.[1]

C21H18O14

494.3592

494.07

C, 51.02; H, 3.67; O, 45.31

55366-56-8

5490334

White to yellow solid powder

0.3

247.81

9

14

4

35

861

5

C1=CC(=C(C=C1C2=C(C(=O)C3=C(O2)C(=C(C=C3O)O)O[C@H]4[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O4)C(=O)O)O)O)O)O)O)O

KHVMAMXQPVHXTJ-ORYXKJSJSA-N

InChI=1S/C21H18O14/c22-6-2-1-5(3-7(6)23)16-13(28)11(26)10-8(24)4-9(25)17(18(10)33-16)34-21-15(30)12(27)14(29)19(35-21)20(31)32/h1-4,12,14-15,19,21-25,27-30H,(H,31,32)/t12-,14-,15+,19-,21+/m0/s1

beta-D-Glucopyranosiduronic acid, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyran-8-yl

Gossypetin 8-O-beta-D-glucuronide; Hibifolin; 55366-56-8; (2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-oxochromen-8-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid; beta-D-Glucopyranosiduronic acid, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyran-8-yl; DTXSID00203913; (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-oxochromen-8-yl)oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid; DTXCID30126404; Gossypetin-8-glucuronide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~202.28 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.06 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.06 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。